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Genetica umana (malattie genetiche monofattoriali e complesse, HLA, ereditarietà, mutazioni, genetica delle popolazioni)

Tutto quello che devi sapere per ottenere un ottimo voto all'esame di genetica umana del primo anno di Medicina, arricchito di immagini e con spiegazioni precise e puntuali, dell'università degli Studi di Torino - Unito. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Basi biologiche e genetica umana docente Prof. F. Malavasi

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Tay Sachs: patologia da accumulo, dovuta a alterazioni biochimiche nel metabolismo

che fanno accumulare un prodotto tossico: il ganglioside GM2, che a causa di una

mutazione(difetto enzimatico) ,viene accumulata nelle cellule nervose con neuro

degenerazione e morte neuronale. La mutazione è recessiva e coinvolge l’enzima beta

esoaminossidasi A, tale mancanza non permette che questo ganglioside venga

scomposto. I bambini che manifestano la malattia nascono normali, dopodiché

iniziano a manifestare i primi segni nello sviluppo con progressiva perdita delle

funzioni celebrali, cecità paralisi e decesso. Si può pensare di trasferire un gene

normale, in quanto si tratta di una mancanza di enzima. Per fare ciò dovrei mettere in

queste cellule una variante di questo gene, ma il problema è inserire il gene( o

direttamente l’enzima mancante)nell’encefalo, perché molto protetto. Una strategia è

il trapianto di midollo con gene che produce beta esoaminossidasi A; in questo modo

il midollo produrrà cellule che producono l’enzima le quali circolano nell’apparato

circolatorio. Si punta sul fatto che per vicinanza qualche piccola percentuale

dell’enzima raggiungerà il cervello (poco risultato clinico, ma importante per

l’approccio concettuale usato).

Il problema è che ormai conosciamo abbastanza bene questa (e molte altre) malattia

genica, eppure non siamo in grado di curarla(difficile da curare a causa della sua

localizzazione). In realtà ultimamente approcci di terapie geniche cominciano ad

esserci anche per questa malattia.

Fibrosi cistica : più comune malattia

ereditaria pediatrica nella nostra

popolazione. La caratteristica clinica è

il muco denso che a lungo andare può

accumularsi nei polmoni (parti bianche

nei polmoni, tessuto cicatriziale nei

polmoni dovuto a infezioni, tale tessuto

non effettua respirazione). Il muco

denso deriva dalla mutazione in un gene

(CFTR) responsabile di un complesso

sulla membrana cellulare che scambia

sodio­cloro(un tempo i test x capire se

si era affetti da tale malattia si basavano sul sudore, che in questi individui è

particolarmente salato). Inoltre il problema è sistemico, perché il muco di tutte le

ghiandole è denso. La fibrosi cistica può diventare un problema neonatale, in quanto

i bambini quando nascono espellono il “deconio”, in casi di grave fibrosi cistica i

neonati hanno una condizione di ileo paralitico, ossia il loro intestino non si muove a

causa della densità del muco (intervento chirurgico in cui si rimuove il pezzo di

intestino otturato). Avere ghiandole che si “intasano” non è nemmeno positivo per il

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pancreas (soprattutto la parte esocrina che produce enzimi digestivi che tagliano

proteine) che non può riversare gli enzimi litici nell’intestino, di conseguenza tali

enzimi digeriscono il pancreas stesso. Questi bambini soffrono di problema digestivo

(mancanza di enzimi che però possono essere assunti in pastiglie), ma soprattutto

diventano diabetici perché la digestione del tessuto pancreatico include anche le

cellule responsabili della produzione di insulina(cellule beta delle isole di

Langerhans). Altre ghiandole coinvolte sono quelle dell’apparato riproduttivo(quasi

sempre sono sterili).La mutazione non è singola e i fenotipi variano in funzione della

mutazione. Anche in questa malattia la terapia genica è interessante in quanto il

problema che diminuisce la durata della vita è il problema polmonare (gli altri

problemi si possono contrastare). La terapia genica (sperimentale) si basa

sull’assunzione per aerosol di alcune particelle virali contenenti geni che codificano

per una variante normale del gene della fibrosi cistica. Il problema può essere che

l’epitelio polmonare non è eterno, di conseguenza è necessario eseguire tale terapia

ogni mese con costi elevati e aumento del rischio progressivo. Una soluzione estrema

può essere il trapianto del polmone (che avrà genotipo sano). L’aspettativa di vita di

bambini affetti è migliorata nell’ultimo decennio perché si sono sviluppate tecniche

di lavaggio del muco per cui i bambini imparano a eseguire in autonomia movimenti

di rimozione meccanica del muco denso, che rimane la miglior terapia per questi

soggetti per la prevenzione di infezioni dovute a muco denso.

Talassemie: zone con elevato numero di

individui affetti da talassemia

corrispondono a zone con elevata

diffusione della malaria. L’emoglobina è

composta da catene alfa e beta, le più

importanti sono le beta­talassemie. Un

bambino talassemico è un’emergenza

pediatrica a qualche mese di vita (se

non identificato prima) e risulta

febbricitante, irritabile,con milza e

fegato ingrossati e fortemente

anemico (dev’essere trasfuso immediatamente). Ciò succede perché c’è una

mutazione loss of function nei geni che specificano la catena beta dell’emoglobina (il

bambino non produce catene beta dell’emoglobina), per cui la sua emoglobina è

formata di sole catene alfa. La patologia si sviluppa a 4­6 mesi dalla nascita perché

questo è il tempo fisiologico in cui avviene il ricambio tra geni delle catene

globiniche (durante la vita fetale la catena beta non c’è ma c’è la catena gamma,

intorno ai 6 mesi l’emoglobina diventa quella adulta. In vita fetale è diversa perché il

bambino non respira e l’affinità con l’ossigeno dev’essere diversa). In presenza della

mutazione in omozigosi il globulo rosso si trova con emoglobina non funzionante e

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diventa estremamente rigido. Da un punto di vista strutturale compaiono forme

anomale e rotte di questi globuli rossi. Questi globuli anomali vengono eliminati in

primis dalla milza e poi anche dal fegato che li riconoscono come anomali a causa

della loro forma (motivo per cui la milza e il fegato sono ingrossati). A questo punto i

problemi sono 2: il minor numero di globuli rossi induce il midollo osseo a produrre

su larga scala globuli rossi,che si manifesta esteriormente con l’inspessimento delle

ossa nella fronte perché tutte le sedi in cui non avviene normalmente emopoiesi si

riattivano x sopperire a mancanza cronica di globuli rossi (deformazione scheletrica a

lungo andare). Inoltre il midollo espelle molte forme immature di globuli rossi perché

non ha il tempo di produrli maturi prima che l’individuo smetta di effettuare la

respirazione. Il secondo problema è l’accumulo di ferro derivante dai globuli rossi

negli organi parenchimatosi (non solo fegato e milza, ma anche nel cuore) dando una

sorta di segnale infiammatori che sfocia in una fibrosi progressiva grave nel fegato e

nel cuore(insufficienza epatica e cardiaca). Per curare questi bambini si effettua

subito trasfusione a cadenza mensile, il problema è però l’accumulo di ferro dovuto

anche alle trasfusioni. E’ quindi necessario assieme alle trasfusioni anche un farmaco

che espella il ferro in eccesso (l’utilizzo di tale farmaco ha aumentato l’aspettativa di

vita di questi individui di 15 anni). Posso anche pensare di trapiantare il midollo (nel

midollo essendo cellule eterne posso effettuare terapia genica, che nella fibrosi cistica

aveva meno effetto in quanto le cellule del tessuto epiteliale si rinnovavano ogni

mese). I portatori eterozigoti sono portatori sani, individuabili con una lieve anemia

microcitica (MCV, volume corpuscolare medio minore della norma). Questo gene si

è mantenuto perché i portatori sono relativamente protetti dalla malaria (che infetta i

globuli rossi, ma più difficilmente infetta i globuli rossi leggermente difettosi). Il

portatore eterozigote in ambiente di malaria ha fitness maggiore di un omozigote

sano, anche se il prezzi da pagare sono gli individui omozigoti recessivi che

presentano fitness decisamente minore.

I motivi per cui le malattie recessive non scompaiono possono essere casi di isolato

genico oppure il fatto io abbia un vantaggio nell’avere un individuo eterozigote.

DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE

DOTT.SA ARRUGA: LA COME

ESEMPIO DI MALATTIA X­LINKED RECESSIVA

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Ottimo esempio di come lo studio di una malattia si sia evoluto con i progressi

tecnologici e con la conoscenza della patologia nell’ambito della genetica. E’ una

malattia che causa una degenerazione muscolare progressiva che si manifesta in 2

forme : di Duchenne (di cui parliamo oggi) e di Becker (meno severa, ma il gene

colpito è il medesimo). Essendo x­linked recessiva colpisce principalmente i maschi

(un solo cromosoma X). Una donna è più frequentemente portatrice e ha il 50% di

probabilità di avere progenie con gene alterato (nelle donne sarà portatrice, negli

uomini affetto). La malattia è stata individuata a metà dell’800, ma l’individuazione

del gene solo 150 anni dopo. Nel caso del gene della distrofina è avvenuto tramite

clonaggio posizionale partendo dal fatto che nei soggetti affetti c’erano alterazioni

visibili del cromosoma X (più piccolo,più grande o comunque morfologicamente

anomalo). E’ stato individuato un locus e attraverso tecniche di ricombinazione è

stata ricomposta l’intera sequenza del gene( si tratta del gene più grande del nostro

genoma che da solo occupa oltre l’1% dell’intero cromosoma X, solo la parte

codificante è 14000 paia di basi). La sua espressione viene regolata da promotori

diversi tessuto specifici e possono dare origine a diverse isoforme della stessa

proteina, ma ci sono comunque domini funzionali della proteina che vengono

mantenuti in tutte le sue forme. I 3 domini principali sono: un dominio di legame con

l’actina, uno di legame con proteine di membrana e un dominio centrale che si

comporta come una sorta di molla che si avvolge su se stessa e conferisce elasticità

alla proteina. La funzione di tale proteina è da una parte legare proteine di membrana

ancorandosi alla membrana e dall’altra di legarsi all’actina, per mantenere l’integrità

della cellula. In assenza di distrofina quando actina­miosina si contraggono, il resto

della cellula non seguirebbe il movimento. Nei soggetti affetti da malattia la

distrofina non resiste allo stress e si sfalda dando origine a necrosi in un primo tempo

della cellula e con il passare del tempo di tutto il tessuto muscolare. Altro ruolo della

distrofina è mantenere in sede sulla membrana alcune proteine che attraversano la

membrana cellulare, garantendo l’integrità della membrana. Secondaria ma non meno

importante è l’interazione della distrofina con l’ossido nitrico sintasi che sintetizza

l’ossido nitrico, un vasodilatatore di cui la cellula muscolare si serve per aumentare

l’apporto di ossigeno in caso di sforzo. Se l’ossido nitrico sintasi non è più in sede ciò

non avviene. Ciò che cambia tra la distrofia di Duchenne e quella di Becker è quello

che la mutazione comporta sul gene. Se una delezione o duplicazione mi mantiene la

cornice di lettura della proteina, essa è prodotta (in piccola parte oppure modificata) e

rallenta l’avanzamento della malattia. Se invece una delezione altera la cornice di

lettura generando stop codon prematuri si crea distrofina tronca che non è funzionale

e spesso l’RNA non senso prodotto non viene nemmeno tradotto. E’ stato descritto in

pazienti affetti da distrofia di Becker una mutazione frame­shift, ma in questi

particolari pazienti esistono fenomeni che cercano di bypassare tali mutazioni. Questi

fenomeni sono quelli di “exon skipping”, per cui se tale mutazione colpisce un esone,

in queste cellule si instaura un meccanismo che salta l’esone ricombinando la

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sequenza saltando quell’esone. Un altro fenomeno è quello di sfruttare uno start

alternativo. In questi casi la proteina non sarà completa, ma quella che c’è funziona.

L’altra eccezione è stata trovare in pazienti affetti da Duchenne mutazioni che non

alterano la cornice di lettura, ma che comunque mi generano uno stop codon

prematura. In questi casi la mutazione mi causa la perdita di una delle 2 estremità che

si legano all’actina e alle proteine di membrana, per cui la distrofina non fa più da

ponte e non funziona più. Esistono anche mutazioni puntiformi (più rare) e in questi

casi sono difficilmente identificabili (devo sequenziare il gene da 14000 paia di basi).

Dal punto di vista clinico i principali affetti sono gli uomini, più rare anche le donne.

Possono manifestarsi casi di portatrici che manifestano la malattia nei casi in cui

l’altro cromosoma X non compensi quello mutato. Ciò può avvenire per casi

fisiologici come ad esempio l’inattivazione per evitare ridondanza dell’X sano in

molte cellule può portare alla manifestazione della malattia. Un altro caso rarissimo

in cui può avvenire sono i casi di monosomia del cromosoma X(sindrome di Turner).

I principali segni che fanno sospettare della Duchenne sono la deambulazione tardiva,

ossia che se un bambino dopo i 16 mesi fa fatica a camminare, si stanca subito a fa

fatica a volersi muovere si può sospettare un disturbo di carattere distrofico. Più

tardivamente anche la postura lordotica è sintomo, x affaticare di meno i muscoli

posturali. Un altro tratto caratteristico è la pseudoipertrofia muscolare soprattutto nei

polpacci, dove i bambini piccoli hanno polpacci grandi come quelli degli atleti. Ciò è

dovuto al fatto che progressivamente si deposita tessuto fibroso. quando le cellule

muscolari muoiono inizialmente l’organismo produce nuove cellule che compensino

quelle morte e le cellule sane si ipertrofizzano per compensare la mancanza

temporanea. Questo avvenimento è limitato nel tempo, man mano che le cellule

muoiono il processo non è più in equilibrio e si ha una progressivo deposito di tessuto

connettivo non funzionale. Un altro segno è il cosiddetto “segno di Gowers”, ossia se

al bambino viene chiesto di alzarsi da terra si alza come si alzerebbe un anziano

facendo forza sulle braccia in quanto i muscoli delle gambe, che sono i primi a essere

colpiti dalla malattia, non sono abbastanza forti da reggere il peso durante il

sollevamento (sembra che cerchi di arrampicarsi per rimettersi in posizione eretta).

La malattia è progressivamente degenerativa e nei casi più gravi raggiunge

l’invalidità prima dei 12 anni. La degenerazione colpisce

principalmente i muscoli delle gambe per poi raggiungere

progressivamente anche gli arti superiori. Ciò causa

progressiva paralisi e anche una sorta di deformità scheletrica

dovuta all’irrigidimento muscolare. Queste deformità

risultano in difficoltà respiratorie e sarà più soggetto a

infezioni polmonari che risultano la

causa più frequente di morte

negli individui distrofici. Infatti 25

anche se lentamente la malattia raggiunge anche il muscolo cardiaco, generalmente

questi individui muoiono per infezione.

La distrofia di Becker è molto simile, con stessi sintomi, ma molto meno severa.

Soprattutto perché la sintomatologia può sorgere in un arco di tempo che va dagli 8 ai

25 anni. Infatti c’è una sorta di prognosi correlata all’età della diagnosi perché se la

patologia diventa invalidante nel giro di 20 anni dai primi sintomi, l’età a cui essi

compaiono diventa influente. Dal punto di vista qualitativo i sintomi sono molto

simili alla duchenne (difficoltà motoria, andatura sulle punte dovuta a irrigidimento

dei tendini,…) ma meno severa.

Quando va sospettata una Duchenne: indipendentemente dalla storia familiare di un

paziente, se un bambino ha difficoltà motorie dopo i 16­18 mesi è un sintomo

preoccupante, se presente il segno di Gowers anche su bambini più grandi questo è un

campanello d’allarme. Se nella storia familiare sono già stati descritti casi di

Duchenne, questo diventa un particolare molto importante da prendere in

considerazione. Anche un elevato livello di transaminasi è un campanello d’allarme,

in quanto nel bambino vengono prodotte dal fegato, ma anche dai muscoli.

Il paziente viene screenato tramite ricerca di creatinchisani, che viene rilasciata nel

torrente circolatorio se la cellula si sfalda (danno muscolare). Nell’adulto è il

principale marcatore d’infarto, nei bambini ciò è poco probabile. La diagnosi va

confermata con test genetici e biopsia e se la diagnosi è confermata si attiva una

terapia multidisciplinare che coinvolge non solo il bambino ma anche i familiare, non

solo sotto il punto di vista psicologico, ma anche di consulenza genetica (rischi

genetici a livello procreativo). Test genetici e biopsia vengono utilizzati per essere

confermati a vicenda, nel senso che il test genetico ci informa sulla mutazione, ma la

biopsia muscolare attraverso l’uso di anticorpi che agiscono sulla distrofina, permette

di analizzare il quantitativo di distrofina che viene ancora prodotto e valutare il grado

di gravità della malattia. Con la genetica posso effettuare uno screening prenatale e

scoprire prima se il bambino può essere affetto. A seconda del grado morfologico di

come sono disposte queste fibre e di come è disposta la distrofina io posso dare una

sorta di prognosi. Da un punto di vista terapeutico l’approccio è multidisciplinare,

perché la malattia parte dai muscoli ma poi interessa diversi apparati. La terapia si

basa su corticosteroidi che rallentano il processo infiammatorio e quindi la

degenerazione fibrotica dei muscoli, con però effetti collaterali. Chiaramente la

terapia è solo volta a migliorare la qualità della vita, ma non si può ancora curare.

E’ un buon candidato per approcci di terapia genica, ma ci sono una serie di

complessità che non hanno ancora permesso l’uso di tale terapia. Un altro ausilio è di

tipo motorio (fisioterapia x migliorare la mobilità ed evitare di portare il muscolo

all’atrofia). Come terapia sperimentale anche sostituzione di antinfiammatori

corticosteroidi con altri non steroidei antifibrotici in generale ( in un periodo si è

pensato di somministrare anabolizzanti, poi si è capito che l’ipertrofia muscolare

rende solamente le fibre più soggette a danno).

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Più di carattere sperimentale sono approcci di tipo genetico. la terapia genica nel caso

della distrofia si avvale di 2 modelli: un modello murina, che ha dei limiti, in quanto

il difetto genetico è simile alla distrofia,ma il fenotipo e la sintomatologia sono

diversi, infatti non è una malattia progressivamente degenerativa, ma una malattia ad

esordio acuto che progressivamente migliora. Nonostante ciò il modello è utile per

screening farmacologico ed approcci di tipo cellulare (trapianti). Più innovativo il

modello zebrafish, molto utile perché lo zebrafish duchenne ha fibre distrofiche

fenotipicamente molto simili a quelle umane e mi permette di fare screen di farmaci

in maniera molto agevole. Dal punto di vista della terapia genica, la Duchenne è

indicata perché essendo una mutazione di un singolo gene, per cui teoricamente

basterebbe sostituire il gene.

In realtà il gene come abbiamo già detto è molto grosso, per cui sostituirlo è molto

difficile. Altro problema è distribuire tale gene a tutte le cellule. Generalmente si

usano vettori virali, ma un vettore virale non supporta un gene di 14000 paia di basi.

Si è quindi pensato di dare delle micro distrofine (in isoforme più piccole), il

problema è però il sistema immunitario e se la distrofina non è mai stata prodotta

dall’organismo essa viene considerata come non self.

L’altro approccio utilizzato è escludere l’esone mutato (exon skipping artificiale)

utilizzando oligonucleotidi antisenso che mascherano sequenze donatori e accettori

di splicing facendo passare un esone per un introne. Il problema è la stabilità di tali

molecole che possono essere degradate rapidamente perché corte e se vanno a legarsi

in punti sbagliati possono compromettere altri geni. Più recente (il mese scorso) è una

nuova tecnologia che prelevando un fibroblasto da pazienti Duchenne e facendoli de­

differenziare in staminali pluripotenti hanno corretto ex vivo il difetto tagliando via la

sezione mutata e riassemblando la sequenza di DNA. Queste cellule

reframe( corrette) sono state reimpiantate e hanno dato origine a cellule corrette. E’

stato osservato di un bambino che ha tratto beneficio da un trapianto di organo

(muscolo). Tale trapianto si può anche effettuare prelevando, modificando e

reimpiantando cellule muscolari affette. L’approccio è l’impianto di mioblasti, ma

così non riesco ad avere copertura sistemica perché non si riescono a diffondere in

tutto il corpo (non migrano).

BASI GENETICHE DELL'INDIVIDUALITÀ

Chiedersi quali siano le basi genetiche dell'individualità corrisponde a chiedersi quale

sia la macchina dell'umano che gestisce la maggior parte delle caratteristiche che

fanno sì che ciascuno di noi sia diverso l'uno dall'altro. Il problema della differenza

individuale è stato oggetto di grandi discussioni poichè, per secoli, non si riuscì a

trovare nulla che costituisse una base biologica delle differenze individuali. Cosa

dovrebbe avere un carattere per far sì che ognuno di noi sia diverso l'uno dall'altro?

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Deve essere un qualcosa che assorba al suo interno una grande variabilità. All'inizio

del secolo scorso, il colore degli occhi è stato utilizzato come marcatore: è un

carattere che si presta estremamente bene in quanto ha una variabilità molto

importante. L'altra domanda medica alla quale si è cercato di rispondere era come

fosse possibile fare dei trapianti fra individui. Il problema era che, andando senza

alcuna indicazione di tipo genetico, si aveva una probabilità di attecchimento del

trapianto sostanzialmente pari al 10­12%. Per fare un trapianto devo cercare una

situazione per la quale ne valga la pena (i trapianti hanno dei costi economici che

vanno dai 250 ai 600 mila euro) e che deve essere controllata in ogni suo punto.

Il punto di partenza sono stati i gemelli omozigoti, relativamente rari. Sono stati i

primi esempi a dimostrare che è possibile scambiarsi tessuti. Dopo di che, si è andato

a cercare nei modelli animali: ci sono voluti 15­20 anni di lavoro per costruire i ceppi

singenici, ceppi ottenuti da una batteria di inincroci (incroci tra madre e figlio) in

modo tale da generare una progenie che, negli anni, ha perso tutte le differenze (ad

esclusione di quelle sessuali). Una volta ottenuti topi identici fra di loro, si sono

costruiti dei modelli: i più semplici sono stati quelli basati sul trapianto di cute, che

consistono nel prendere un piccolo frammento di pelle del dorso del topo donatore e

trasferirlo sul topo ricevente. Se viene rigettato si ha una banale "crosta", o escara, e

quindi il pezzo di cute cade; se viene accettato si salda perfettamente: è un sistema

semplice e rapido per valutare la funzionalità di un trapianto.

Questo è quello che avviene in vivo quando si fa un trapianto: sulla destra si ha un

glomerulo renale in una fase che prende il nome di "rigetto acuto", che è lo stato

patologico a cui può andare incontro il paziente. Il rigetto acuto è caratterizzato dalla

presenza anomala di linfociti che, nel giro di pochi giorni, sono arrivati in sede, e che,

verosimilmente, sono i responsabili del rigetto acuto. Se si supera la fase di rigetto

acuto, lo stesso glomerulo perde ogni struttura e parvenza e diviene circondato da un

cercine fibroso che lo esclude totalmente. A sinistra, invece, c'è stata una sottilissima

risposta, che è durata mesi, in cui il glomerulo viene perso, come, del resto, tutto

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l'organo. Esistono quindi due azioni, una acuta e una tardiva, che sostanzialmente

portano allo stesso risultato: la perdita funzionale dell'organo trapiantato.

In maniera

estremamente

schematica, questa è la

base di partenza

dell'intera ricerca per la

definizione del

complesso maggiore di

istocompatibilità, che è

stata fatta su topi. Il

complesso di

istocompatibilità nei topi

si chiama H­2. Il grigio

trasferito sul grigio viene

totalmente accettato;

quando, invece, si lavora su due ceppi differenti si ha il rigetto. Abbiamo un tessuto,

la cute in questo caso, che viene accettato o meno: deve avere, da una parte, qualcosa

che "viene visto" e, dall'altra, qualcosa che "vede", con un sistema effettore che

regola l'accettazione. Si ha a che fare con qualcosa della superficie della cute che

viene vista dal ricevente che, di conseguenza, attiva dei meccanismi effettori.

Il verde trapiantato

sul blu, come atteso,

dà origine ad un

rigetto primario

rapido, che si

manifesta entro una

decina di giorni. Se

l'esperimento viene

ripetuto, il tempo

necessario perchè si

manifesti il rigetto si

riduce a pochi giorni.

Questo dato,

avvenuto mesi prima,

è stata memorizzato e

quindi si ipotizza che

le cellule abbiano una

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memoria: cellule della memoria, quindi, si ricordano e, di conseguenza, intervengono

eliminando quello che riconoscono come antigene. Prendendo i linfociti del primo si

può riprodurre l’intera struttura, dimostrando che sono i linfociti i responsabili del

rigetto. Questa azione è, da una parte, legata all'individuo; dall'altra, legata ad una

memoria cellulare. E' possibile, facendo queste operazioni, regolare e indurre delle

tolleranze in base a scambio di tessuti e a scambio di memoria. Così facendo, negli

anni '50 e '60, questi dati di pura origine animali sono stati fiancheggiati ad

osservazioni che venivano da altri sistemi polimorfici con caratteristiche molto simili.

I globuli rossi, che sono completamente diversi da cute e linfociti, hanno sulla loro

superficie degli antigeni lipidici che hanno una funzione molto simile.

La svolta è avvenuta quando queste osservazioni sono state trasferite ad un modello

umano. Quello che è stato fatto è partito da un'osservazione del tutto casuale: a

Torino, all'ospedale ginecologico, un gruppo di ginecologi ha messo insieme i

linfociti del marito con il siero della moglie, e viceversa (il siero è la parte non

corpuscolata, cioè liquida, del sangue, dopo che è stato indotta la coagulazione; il

plasma è ciò che si ottiene bloccando la coagulazione, avendo così accesso a tutte le

popolazioni del sangue). Si è osservato, con una certa sorpresa, che il siero, quindi la

componente proteica anticorpale del marito, non presentava nulla dei linfociti della

moglie. La situazione cambiava completamente quando il siero della moglie veniva

esposto con i linfociti del marito: tutti gli anticorpi si attaccavano sulla superficie dei

linfociti maritali. Ciò è dovuto ad una sensibilizzazione contro antigeni maritali

indotta dalla esposizione a tutto ciò che la moglie riconosceva come estraneo, almeno

al 50%, durante la gravidanza. Si ha a che fare con un processo di

alloimmunizzazione, cioè di immunizzazione fra individui della stessa specie che

avviene fisiologicamente durante una gravidanza. Una volta scoperto che la moglie

possedeva degli anticorpi contro gli antigeni maritali, ci si è chiesti se questa reazione

riguardasse solo gli antigeni maritali oppure anche altri antigeni maschili, e si è giunti

alla conclusione che la moglie riconosca solo gli antigeni del marito. Ciò fornisce uno

strumento sierologico, quindi basato sul siero, che consente di vedere una diversità.

Famiglie numerose sono state convocate e hanno donato il siero costruendo la prima

sieroteca di sieri in grado di riconoscere le diversità in una popolazione normale. Il

passo successivo è stato definire una struttura adatta alla routine clinica: semplice,

rapida, economica e riproducibile. E' stato inventata la tecnica della linfocito­tossicità

complemento dipendente. Terasaki è riuscito a stabilire un metodo per dire se il siero

di una qualunque donna è in grado di legare o meno i linfociti a cui è esposta.

Nei suoi studi, ha realizzato questo sistema che è tutt'ora usato e che ha il pregio di

necessitare di 4 ml di sangue e qualche migliaio di cellule. Se si prendono i linfociti

di un individuo e li si mettono insieme con il siero di una donna , l'anticorpo lega il

bersaglio cellulare esposto sulla superficie. Avendo cellule, anticorpi e complemento

(cascata di proteine di origine epatica che rappresenta un sistema di difesa innato e,

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inoltre, semplice, rapido ed economico), quest’ultimo si va a depositare sulla

porzione legante il complemento delle immunoglobuline; a questo punto parte

l'attività litica. Se non c'è l'anticorpo legato non si forma niente.

Per vedere qualcosa si butta una goccia di colorante vitale e la cellula con il buco

viene colorata, mentre l'altra no. Tutto ciò ha consentito di avere a disposizione della

comunità un sistema rapido ed economico e che dà una risposta sì/no. In sintesi, il

primo passo è stato raccogliere famiglie di donne poligravide sensibilizzate contro

antigeni maritali; il secondo è stato mettere insieme queste reattività e formare le

cluster designation (CD).

Qual è stata la differenza cimentando i linfociti del donatore con quelli del ricevente?

I sieri delle poligravide riconoscevano (o no) i linfociti del ricevente: se li

riconoscevano voleva dire che erano identici. Ciò a fatto sì che i trapianti passassero

da una probabilità di attecchimento del 10­12% ad una probabilità del 45%.

HLA CLASSE I

I sieri reagivano su tutte le cellule

dell'organismo: ciò vuol dire che il

bersaglio è ubiquitario, ad

esclusione del cervello e di alcuni

piccoli tessuti. Abbiamo a che fare

con l'identificazione di una

molecola di superficie che sta su

tutte le cellule, ed è stata la prima

ad essere riconosciuta con questo

sistema che pare "primitivo". E’

un’ eteromolecola transmembrana

costituita da tre domini, ossia

sequenze di tipo iterativo. Si dice "eteromolecola" perchè include anche una beta2­

microgloblulina, appartenente alla famiglia delle chaperonine, che fa parte anch'essa

della struttura dei domini ripetitivi e che ha il compito di accompagnare l'espressione

(ossia il montaggio sulla superficie) dell'altra molecola. Tuttavia, se circa il 50% dei

trapianti attecchisce e l'altro 50% no, vuol dire che esiste un'altra componente che

non è stata considerata.

Una volta trovata quella molecola, si è andati a cercare il gene codificante. Questo è

stato fatto grazie alla genetica cellulare somatica. Il genetista Guido Pontecorvo

cominciò a fare una serie di esperimenti ritenuti "bizzarri": fuse tra di loro cellule che

non appartenevano alla stessa specie. 31

Dopo aver fuso cellule provenienti da animali di specie diverse, passò a fondere

cellule umane con cellule di topo. Si formò, di conseguenza, un sincarionte, secondo

un processo che prevede che la cellula inizialmente abbia due nuclei che poi si

fondono insieme. Ad un certo punto, la cellula inizia a eliminare cromosomi. Ciò che

fu fatto allora, grazie agli studenti sotto esame, fu costruire la più grande celloteca di

ibridi somatici con l'intero set di cromosomi murini, facilmente riconoscibili in

quanto hanno la forma di una "V" rovesciata, con uno, due o tre cromosomi umani.

Per cui, si è andato a controllare se questi ibridi esprimevano o meno (sempre grazie

alla tecnica della linfocito­tossicità complemento dipendente) sulla superficie la

molecola ricercata. Tutte le volte che c'era il cromosoma 6 oppure il braccio corto del

cromosoma 6 si aveva l'espressione di questa molecola.

Questo consentì la prima rappresentazione grafica di localizzazione genica di un

complesso di questo tipo ed è stato anche uno dei primi esempi di terapia genica per

vedere se il tratto genetico "tumore" era dominante sul normale. Avendo a

disposizione antisieri, cellule di umano a iosa e trapianti, si trattava di dare una

risposta convincente a quello che non viene visto. Studenti della facoltà di medicina

di Torino furono sottoposti ad un esame che consisteva nel fare un trapianto di cellule

di topo su cellule di umano.

Prima di tutto, il professor Ceppellini, tipizzò tutti i potenziali donatori e identificò un

gruppo di individui che erano identici in base alle tecniche allora note, ossia che

avevano HLA identici, mentre mise da parte il gruppo di quelli che non avevano un

partner identico. Il secondo passaggio consisteva nel trapianto di una piccola

porzione di cute di individuo su un altro, a prescidere che fosse uguale o diverso.

Metà dei riceventi non furono soggetti a rigetto e, quindi, erano identici; l'altra metà,

invece, ne fu soggetta. Ciò voleva dire che, accanto all'identità allora nota, c'era una

quota di diversità.

Dunque, fu messo in piedi un sistema per identificare questa quota di diversità e ciò

fu fatto mettendo da una parte quelle colture MLC (mixed lymphocyte reaction), che

sono la riproduzione in vitro di un trapianto. Se metto in un terreno di coltura i

linfociti riconoscono ciò che è estraneo e tentano di eliminarlo (e lo stesso fa il

partner) e, quindi, hanno una grande reattività locale che può essere controllata in una

maniera molto semplice: inibendo uno dei due partner. E' un test biridirezionale: si

ottiene una risposta di tipo cellulare che è in grado di cogliere le differenze. Prima

abbiamo utilizzato un test sierologico, adesso ci si affida ad un sistema molto più

raffinato che è quello del riconoscimento linfocitario, che coinvolge reazioni

linfocitarie miste. Servono, tuttavia, dei punti di riferimento: sulla nostra superficie

abbiamo una dose di istocompatibilità (HLA) proveniente dalla madre e una

proveniente dal padre, cioè abbiamo un prodotto di due complessi che, tenendo conto

del grande polimorfismo, vengono entrambi coespressi, cioè sono codominanti.

Essendo altamente polimorfici, affidandosi esclusivamente al caso, è impossibile

avere due dosi uguali. Nel matrimonio tra consanguinei, tuttavia, c'è una probabilità

32

di 1/16 che i figli ricevano lo stesso HLA dal padre e dalla madre. Si sono presi

questi individui, che erano HLA identici per la parte che mancava, e sono state fatte

reazioni con questo pannello di cellule identiche. C'è stato un periodo in cui si

analizzavano soggetti appartenenti a questo tipo di famiglie.

La mononucleosi è un virus endemico nella popolazione caucasoide: tutti noi

abbiamo un equilibrio misurato fra il virus quiescente e le difese che lo tengono a

bada. Quando questo equilibrio si rompe, il virus emerge. Nella popolazione africane

lo stesso virus è responsabile di una grave leucemia: lo stesso virus ha, quindi, una

capacità patogenetica diversa. Se prendiamo i linfociti di un umano e li mettiamo in

vitro, molte di queste cellule in cui scompaiono le difese diventano delle linee

continue, dette linee linfoblastoidi in cui il virus dà origine a quello che succede alle

popolazioni africane in quanto mancano le difese locali, essendo in vitro, e quindi si

ottiene una linea continua che non muore mai, secondo un processo di

"immortalizzazzione".

Gli individui figli di consanguinei (cugini primi, per esempio) sono stati tutti

"immortalizzati" in vitro, per avere a disposizione un background genetico

omogeneo, dal punto di vista dell'istocompatibilità., e queste cellule sono state usate

per misurare la capacità di risposta degli effettori. In coltura si può avere l'attivazione

o la non attivazione: se si inserisce in coltura dei precursori di acidi nucleici, le

cellule che si attivano li fagocitano, le altre no. Si ottengono quindi cellule radioattive

e cellule che non lo sono, a seconda che si siano attivate o meno. E' un sistema che

prende il nome di colture miste linfocitarie. Il sistema delle colture miste linfocitarie

ha consentito di tipizzare, oltre alla parte

sierologica, la parte cellulo­mediata

riconosciuta da linfociti. Dalla

probabilità di attecchimento dei trapianti

del 50% si è passati alla probabilità del

75%. Mettendo insieme i risultati delle

due tipizzazioni si è giunti ad una

componente enormemente superiore in

pochi anni. Dietro a questa componente

cellulare che è stata identificata

successivamente c'è un eterodimero a due

catene, entrambe transmembrana, che, a

differenza delle molecole di HLA di

classe I, sono a distribuzione ristretta,

cioè si trovano solo su alcune cellule, prevalentemente monociti e linfociti B, e ciò fa

dedurre una funzione biologica diversa. Queste molecole possiedono la capacità di

33

attraversare al membrana plasmatica e questa caratteristica fa pensare ad una

funzione di segnalazione. Sul cromosoma 6 dell'uomo e sul cromosoma 15 del topo si

è riusciti ad identificare un "supergene" che viene mantenuto intatto e che non viene

mai spezzato nei suoi complessi componenti in filogenesi, perchè pressioni selettive

favoriscono questo accertamento, dal momento che senza di esso non c'è vita. Tutti i

sistemi biologici che conosciamo sono dotati di un sistema simile a questo.

Il colore rosso sta ad indicare

la famiglia degli antigeni di

istocompatibilità di classe ; il

colore giallo, invece, la

famiglia degli antigeni di

istocompatibilità di classe II,

che hanno un'espressione

molto più limitata. Inoltre, si

è scoperto la presenza altri

geni apparentemente non

legati all'istocompatibilità: geni che codificano fattori solubili, fattore del

complemento, etc... ;

potrebbe trattarsi di un

sistema che si è evoluto,

partendo da uno stadio di

partenza primitivo fino ad

arrivare ad un sistema

raffinato ed estremamente

polimorfico.

Dunque, il supergene serve,

innanzitutto, a determinare

se un trapianto è fattibile o

meno. Inoltre, viene

utilizzato per quelle malattie

di cui non si conosce la patogenesi e delle quali ci si chiede perchè un individuo sia

affetto e un altro no e se tutti coloro che siano affetti sono uguali fra di loro. La

spondilite anchilosa è una patologia che colpisce le donne intorno ai trent'anni.

Insorge a freddo e fa assumere alla colonna una forma "a canna di bambù" che porta

ad un ingravescente stato di limitazione funzionale. Dal momento che non si conosce

il responsabile di tale patologia, si è andati ad identificare l'impronta genetica in una

popolazione di individui affetti. E' emerso che il 98% degli individui affetti

esprimono l'antigene HLA­B27. Ciò non vuol dire che l'antigene sia il responsabile

della malattia, in quanto non tutti coloro che presentano l'antigene sono affetti, ma

34

funge da marcatore che serve a fare una distinzione fra gli individui affetti e quelli

che non lo sono. In questi casi, in assenza di segni diagnostici, si può ricorrere al

background genetico.

SUPERGENE HLA

Super gene HLA è composto da due grandi famiglie di geni: HLA classe I e HLA

classe II, espressi seppur variamente sulla superficie di tutte le cellule del nostro

organismo.

Queste molecole sono codificate da gruppi di geni che sono all’interno del supergene,

il quale contiene anche altre sequenze con funzioni codificanti, che apparentemente

sembrano non avere nulla a che fare con istocompatibilità e altre funzioni attese:

HLA di classe III sono dei geni codificanti fattori del complemento,

- immunomodulatori come Tumor Necrosis Factor, proteine del complemento

( C2, C4 e Fattore B)

Geni irrilevanti immunologicamente come 21­Idrossilasi, RNA Helicase,

- Caesin Kinase, Heat Shock Protein 70 (cheperonine), Sialidase;

Come dobbiamo spiegare questa associazione mai escissa?

In queste centinaia di geni ci sono dei fattori per cui è davvero difficile capire la loro

funzione nel supergene, questi fattori non sono più presenti negli umani, cioè

analizzando l’espressione di questi geni troviamo livelli molto vicini allo zero,

decisamente trascurabili.

Questi geni sono messi da parte perché non più utili all’individuo: per cui questo

geneticamente RIDONDANTE,

sistema è definito in altre parole l’organismo sta

bene che ci sia o meno questo fattore (ridondanza ordinata), questa ridondanza non

modifica significativamente la fitness della specie umana.

Nel supergene HLA può esser letta la storia filogenetica dell’evoluzione tenuti

insieme perché

fondamentali alla vita: è

cioè un serbatoio che la

pressione selettiva ha

sempre tenuto insieme,

perché vantaggioso averla

insieme seppur espressa a

livelli pari a 0.

Alcuni di questi geni

interni al super gene sono

già ampiamente sfruttati 35

nella pratica clinica come il Tumor Necrosis Factor utilizzato come terapie in

determinate leucemie.

Nel supergene infine troviamo diversi tipi di molecole: Molecole di superficie, fattori

idrosolubili, enzimi e tante altre cose, anche sconosciute.

CARATTERISTICHE DEL COMPLESSO HLA

I geni delle regioni HLA sono:

­ POLIGENICI: ce ne sono tanti HLA­A, HLA­B, HLA­C

­ POLIALLELICI: ciascuno locus ha centinaia di alleli – HLA­B(, HLA_B15, HLA­

B27)

­ POLIMORFICI: queste molecole cambiano moltissimo, variazioni piccole che sono

fondamentali, soprattutto nella sequenza amminoacidica.

Per la classe I i Locus A e B hanno oltre migliaia di varianti, e ciò ci fa capire che

sono quelle filogeneticamente più antiche, e considerando che ciascuno di noi eredita

un HLA sia materno che paterno, le combinazioni diventano davvero tantissime.

La stesso discorso può esser affrontato con gli HLA di classe II.

Questi alleli sono ereditati in blocco, questi blocchi sono chiamati APLOTIPI, un

aplotipo materno e uno materno,

L’aplotipo è un ulteriore GOD (generatore di diversità) importante perché ciascuno di

noi ha due aplotipi, e sono queste le cose determinanti per le applicazioni cliniche:

Se si segue la distribuzione degli aplotipi in una famiglia, si ottiene:

­HLA IDENTICI 25%

­HLA aploidentici 50%

­HLA non identici 25%

Questi dati sono fondamentali soprattutto per il trapianto di midollo, ormai utilizzato

in molte leucemie quando le terapie convenzionali non danno i risultati attesi, inoltre

è fondamentale lo studio nelle famiglie perché la probabilità di trovare persone con

HLA identici o Aploidentici sono enormemente maggiori nella famiglia piuttosto che

nella popolazione mondiale.

HLA CLASSE I E CLASSE II

Tutte le molecole HLA classe I formano un

complesso eterodimerico esposto, transmembrana

che sporge nella matrice extracellulare, formato da 4

36

domini funzionali che formano un groove, una tasca, destinato a trasdurre segnale.

Hanno un espressione ubiquitaria e non specifica.

La subunità Beta2 è una delle proteine più antiche e conservate, pesa 12 kDa è uno

dei primi prodotti di distruzione delle cellule, sia normali che tumorali, se il rene non

funziona più lascia passare questa proteina, e per questo è utilizzata come test della

funzionalità renale. Infine è anche un marcatore tumorale per diversi tipi i cancro.

HLA Classe II sono anch’esse assai polimorfiche, solitamente formate da due

molecole che si legano tramite un legame peptidico aventi due segmenti

transmembrana e due code citoplasmatiche,

e 4 domini extracellulari. Entrambe le

molecole sono codificate da geni nella

regione HLA e anche loro hanno la

capacità di formare il groove, la tasca.

Queste molecole hanno un espressione

ristretta alle cellule presentanti l’antigene e

nella maggioranza delle cellule attivate.

Questo sistema così polimorfico, si

distribuisce nella popolazione non in

maniera casuale, come si potrebbe pensare,

questo lo possiamo verificare perché se si analizzano popolazioni di diverse zone del

mondo (africane, asiatiche e caucasoidi) e la distribuzione di questi polimorfismi non

è casuale, bensì alcuni alleli, i più semplici, hanno una distribuzione diversa, è ciò

vuol dire che l’ambiente ha selezionato l’uomo.

Ad esempio la febbre gialla ha influenzato la distribuzione dell’ HLA­A2, che in

africa è molto più frequente che nei caucasoidi.

Ciò vuol dire che quell’allele ha rappresentato un vantaggio selettivo in un

determinato ambiente(l’Africa in questo caso) piuttosto che in un altro.

variabile geograficamente e non casuale

l’HLA presenta un polimorfismo del tipo

Ad esempio in Sardegna si son sviluppati dei fenotipi ben precisi che hanno una

distribuzione assai variabile rispetto al resto della terra proprio perché Questi isola è

geograficamente chiusa.

APPLICAZIONI CLINICHE

Se si ha un marcatore cosi polimorfico lo si può utilizzare per capire ciò che il dottore

non può riuscire a capire: ci sono tantissime malattie IDIOPATICHE, di cui non son

note cause esterne. Questi polimorfismi possono esser analizzati per diversi tipi di

Malattie Assocciate al complesso HLA,

malattie note come come la

37

NARCOLESSIA(attimi di assenza anche molto lunghi), con un relativo rischio

approssimato.

L’indicazione che abbiamo è che le persone che presentano queste patologie hanno

un background genetico rispetto al resto delle popolazione.

Queste malattie hanno in comune due cose:

non sono malattie importanti, variazioni cliniche modeste, ed è quindi

- verosimile che qui le pressioni selettive non abbiano avuto tempo e gioco per

giocarci su,

sono tutte malattie a tarda insorgenza

- poco clinicamente definibili, perché solo sintomi vari.

-

Come si valutano i vantaggi di una pressione selettiva, grazie ad un indicatore del

vantaggio selettivo?

I risultati del vantaggio selettivo, sono costituiti dal numero di figli che uno fa e

quindi dalla quantità e specificità di DNA che passa alle generazioni successive.

Quindi se viene passato qualcosa di molto svantaggioso questo viene perso subito,

dopo poche generazioni.

Se il fenotipo è debolmente svantaggioso, questo è mantenuto nel tempo, o comunque

per esser perso richiede un numero di generazioni molto maggiori piuttosto che altri

fenotipi svantaggiosi.

Ecco giustificata quindi l’esistenza di MALATTIE ASSOCIATE A HLA, alcune

poco frequenti altre molto più frequenti.

La tipizzazione e l’HLA sono utilizzate tutt’ora in tutte le definizioni di quadri

clinici incerti.

Come la pressione selettiva è in grado di modificare il nostro genotipo?

In un esperimento sono stati presi 4 paesi in Sardegna distanti due chilometri di

distanza ma 1 chilometro di altezza, due paesi in riva al mare e due in alto.

La distribuzione degli alleli HLA non si dimostra uguale come dovrebbe si potrebbe

pensare a questi pochi kilometri di distanza: è emerso che è cosi in quanto la

differenza è dettata dal selettore “malaria” che è operativo solo in riva al mare.

Questo ha fatto si che 4 paesi fossero molto diversi tra di loro pertando ad una

conseguenza non trascurabile sotto diversi punti di vista sia scientifico, che culturale,

che religiosi e filosofici perché dimostra che è l’ambiente a modificare l’uomo, e non

l’uomo a modificare l’ambiente.

Le isole sono state molto studiate molto in questi anni, ad esempio gli islandesi hanno

venduto tutto il loro DNA in cambio di 30 anni di assistenza medicale gratuita. Le

company hanno tipizzato tutta la popolazione sfruttando anche l’ottimo sistema

informatico islandese, facendo un match molto accurato genotipi/malattie,

38

identificando dei genotipi a pericolo e con altro rischio di malattia in cui si può

intervenire tramite stili di vita: questo è stato l’avvio dell’identificazione sempre più

affidabile di genotipo di quadri che riescano ad annunciare una predisposizione per

alcune malattie aiutando gli individui.

Queste malattie sono dette ASSOCIATE(termine tecnico) poiché il prodotto di quel

gene non è causa della malattia ma la testimonia.

Cosa fanno queste molecole?

Queste molecole stanno sulla superficie e sono dei recettori per l’esterno; inoltre

hanno la caratteristica di ospitare sulla superficie dei peptidi che possono venire

dall’interno delle cellule o dall’esterno. Dal punto di vista generale la molecola agisce

come un cestello che ospita pezzi di proteina.

L’affinità tra peptidi e molecole di superficie è regolata dal polimorfismo genetico di

queste proteine. Alcuni alleli legano meglio peptidi di origini tumorale, altre legano

meglio peptidi che vengono da virus esterni e quindi abbiamo che sulla superficie c’è

un pool di tutte queste molecole, e ciascuno di noi varia per la capacita di esporre

queste molecole e questi peptidi.

Esistono delle molecole che sono ottimi presentatori di antigeni e altri che sono

cattivi presentatori. La variabilità genetica è quella che regola la capacità di

presentare questi peptidi.

I Proteasomi sono sistemi di recupero di proteine dell’organismo, che vengono

riciclate o usate come bersaglio, essendo portate in superficie dove vengono inserite

nel cesto( cioè le molecole di superficie).

I tumori, sono i primi presentatori di antigeni nel corpo di un individuo e il

proteasoma è uno dei maggiori bersagli delle terapie anti tumorali, perché solo in

questo modo si permette al tumore di non replicarsi.

IL RECETTORE DEI LINFOCITI T

Se c’è un presentatore estremamente

variabile che espone dei peptidi ci

devono anche essere dei recettori che

interagiscono con questi presentatori:

il RECETTORE DEI LINFOCITI T

(TCR). 39

L’ipotesi del riconoscimento è basato sull’adesione, cioè sul fatto che le cellule

effettrici riconoscono il presentatore con il peptide, con una diversa affinità.

Come si può trovare il recettore?

Il recettore può esser trovato grazie a un ligando marcato. Il recettore è esposto dai

linfociti T, che appartengono alla grande famiglia di linfociti che si dividono in due

tipi : linfociti di tipo T e di tipo B.

I linfociti di tipi T che sono quelli che nascono nel midollo e si maturano nel timo;

successivamente assumono grazie a un processo “casuale”(o non conosciuto) espone

un recettore, che è in grado di riconoscere a caso qualcosa. Ovviamente il pericolo è

che si riconosca anche ciò che è self, ovvero che riconosca se stesso.

Noi dobbiamo esser in grado di riconoscere tutto ciò che è diverso da noi, non però

nasciamo con la capacità di riconoscere tutto, ma ci sono meccanismi casuali in grado

di generare sequenze che posson riconoscere tutto, senza riconoscere se stesso.

La natura ci ha fornito un sistema in grado di riconoscere ciò che è specifico per noi e

lo degrada. Un neonato fa fuori qualche ettogrammo di timociti alla settimana in un

sistema dove tutto è tarato al minimo costo.

I linfociti di tipo B che hanno origine gursale da linfonodi, milza, tonsille, hanno(o

comunque si pensa abbiano), anch’essi, all’interno una centrale che origina sequenze

di riconoscimento casuale.

Uno dei problemi più importanti è l’interazione tra noi e il mondo a noi esterno:

abbiamo delle macchine con meccanismi di risposta cellulo­mediata dai linfociti T e

quella mediata dai linfociti B, che rispondono a determinati segnali.

Ogni giorno nascono almeno 50 molecole diverse da chimica e altro, e non potremmo

mai esser in grado di riconoscere il mondo fin dalla nascita, ne il buono ne il cattivo,

per questo è fondamentale avere questi meccanismi di riconoscimento di sequenze

casuale.

Mentre i linfociti T hanno il TCR, i linfociti B sono in grado di secernere una

struttura simile, ma solubile, cioè le immunoglobuline o anticorpi, e ogni linfocito è

specifico per una caratteristica capacità di rispondere a determinante sequenza.

In un determinato istante, ciascun linfocita T ha un recettore diverso dall’altro e

ciascuno di noi dovrebbe avere miliardi di linfociti T, a meno che :

­ non ci siano infezioni in corso, con espansione del linfocito T specifico

dell’infezione,

­ espansione di tipo tumorale, cioè le leucemie, dando vita a cellule tutte uguali tra di

loro con uguale TCR. 40

Questo è stato uno strumento utilizzato anche grazie agli anticorpi monoclonali,

anticorpi che riconoscono una singola sequenza: grazie ad una omogeneizzazione

dell’effettore e una capacità di legare una singola molecola con gli anticorpi

monoclonali, si è dimostrato che i due parametri di difese cellulari, di tipo T e B

sono sostanzialmente e strutturalmente uguali, uno sulla superficie e l’altro

idrosolubile.

RICONOSCIMENTO RISTRETTO

Come si fa ad avere un recettore T o B per ogni antigene?

E’ impossibile, ma grazie al riarrangiamento di set di geni, si può pensare di avere

difese contro ogni antigene, perché le macchine interne ai linfociti collaborano

insieme per aver un migliore risposta immunitaria: la macchina taglia dei pezzi per il

riarrangiamento, e con un numero finito di sequenze possiamo generare un numero

quasi infinito di sequenza, o comunque un numero di sequenze molto maggiori che ci

permettono un più ampio spettro di difesa.

In poche parole è una macchina per generare DNA prona a fare errori, e proprio

questi errori garantiscono la generazione di nuove sequenze, giungendo così alla

storia della macchina che interagisce con il complesso HLA di classe I o II legandosi

insieme : il riconoscimento è particolare, è RISTRETTO, c’è un fattore di

limitazione.

È stato dimostrato che il TCR è in grado di riconoscere un peptide quando presentato

da una cellula, ma le due cellule che interagiscono( di riconoscimento e

presentazione) devono esser uguali geneticamente.

RICONOSCIMENTO è RISTRETTO

Il dalla base genetica in quanto il TCR ha

un riconoscimento duale o doppio(Dual Recognition) è come se il TCR riconoscesse

e parlasse solo con se stesso stesso, ma questo rappresenta una grande difficoltà

durante i trapianti.

Infine possiamo perciò dire che il riconoscimento tra chi presenta e chi riconosce è

mediato da:

il peptide, cioè la specificità

- dal background genetico.

-

Le probabilità di trovare due individui HLA identici sono troppo basse, perciò si

cerca di fare delle previsioni, pensando a possibili modificazioni e rendendo simili

ma non patogeni alcune situazioni particolari.

Tutto ciò è alla base dei vaccini, che ormai nascono grazie a previsioni

computeristiche, che devono esser buoni per tutti, senza restrizioni geografiche.

41

Associazioni con questi peptidi sono alla base delle diffusioni di malattie infettive

dominanti, che hanno causato una distribuzione di HLA in grado alla capacità di

presentare peptidi dell’agente patogeno o no.

In Italia, ad esempio, per il diabete, che pur essendo una malattia non infettiva, ha una

base genetica molto forte, grazie ad un marcatore genetico si è riusciti a fare delle

importanti divisioni in malattie come il diabete, tipo I e tipo II, che è importante

dividere sia per sintomi che per insorgenza.

L’aplotipo ancestrale va insieme a fattori positivi e negativi ed a volte è proprio

l’ambiente in cui si vive che fa prevalere gli uni sugli altri.

Ma cosa vuol dire questa associazione?

È verosimile attendersi che il gene marcatore è molto vicino al gene dominantemente

responsabile per la malattia, con malattie associate all’HLA. Questi alleli sono in

Linkage disequilibrium, non si staccano mai, e marcano la malattia.

L’autoimmunità è la più rappresentativa di tutto ciò, perché quando nascono i

linfociti T, tutti sono eliminati, ma posson rimanerne alcuni che sono sufficienti in

una vita ad espandersi e raggiungere un livello di patogenicità , e infatti malattie

autoimmuni saltano fuori molto avanti negli anni, quando quel clone si espanso a

livelli molto alti.

Mimesi molecolare è un ipotesi secondo cui alcuni antigeni HLA hanno sequenze

simili o vengono copiati, come da agenti patogeni: ad esempio l’EBV, è un virus così

astuto che si è preso come recettore di entrata nelle cellule il recettore del

complemento, proprio come ha fatto HIV che usa CD4. Questi sono sistemi di astuzie

messi li in milioni di anni, che sono stati capaci di trovare il punto debole e sfruttarlo

a proprio favore. (Molecular Mimicry)

LINKED,

Esistono delle malattie che sono in fortissima associazione con i geni

dell’HLA, il gene associato è , a differenza delle precedenti che testimoniano la

malattia, direttamente responsabile della malattia.

La più frequente è la 21­idrossilasi, responsabile di gravi alterazioni del sistema di

produzione di cortisone per cui deve esser curata immediatamente, ed è stata una

delle prime malattie ad esser curata in utero, grazie a iniezioni in utero di cortisone

che evitano modificazione fenotipiche patologiche.

Altre sono causate da deficit del complemento, come la iperplasia surrenale.

Tutto ciò e fondamentale per i trapianti, per cui è fondamentale l’Istocompatibilità

che regola la risposta immunitaria in modo altamente specifico.

I trapianti sono compatibili quando si usa un sistema di tipizzazione per valutare la

similitudine tra chi dona e chi riceve e si verifica che i soggetti sono Istocompatibili.

42

Questo è possibile solo se il paziente può attendere, perché può sopravvivere grazie a

delle terapie( ed es. il rene artificiale, per aspettare la persona giusta, macchine salva

vita).

Quando questo non è possibile si può bloccare il sistema precendentemente descritto

in due modi:

­ Bloccando il sistema TCR contro il suo antigene con anticorpi; tuttora è utilizzata

questo metodo (OKT3 è l’anticorpo).

­ Oppure tramite meccanismi molto meno precisi che prevedono l’accetazione di

tessuti anche se derivante da un donatore non compatibile al 100%( solitamente

moduliamo la risposta spegnendola, pur se ci sono effetti collaterali come numero più

alti di tumori e bassa risposta immunitaria, nonostante ciò stai dando ad un paziente

un aspettativa di vita molto Sistema con PRO e CONTRO)

ALCUNE TIPOLOGIE DI TRAPIANTI

Trapianti da cadaveri: il più importante è la cornea, che ha la caratteristica di non

aver alcun HLA, ciascuna cornea va bene per tutti, e ciascun centro ha delle banche

delle cornee, con un successivo spostamento dell’età di accettazione.

Negli ultimi anni ci sono investimenti su immunosoppressori quanto meno dannosi

possibile e si sta investendo anche in trapianti da animali, ad esempio il fegato dal

maiale, che viene utilizzato in trattamenti pre­operatorio per pulizia del sistema

interno che è gravissimo.

I limiti sono rappresentanti dal fatto che non si sa ancora che esitano malattie non al

momento note, che possono insorgere dopo il trapianto: organi ad esempio infetti da

HIV, per questo chi dona deve esser sano.

I trapianti di midollo formano una categoria a parte e sono di pertinenza degli

ematologi che hanno osservato che durante una leucemia è bene utilizzare un

trapianto, in cui viene preso il midollo adeguato e viene azzerato il midollo al

paziente, che vive un periodo di aplasia in ambienti sterile.

Successivamente viene iniettato il midollo delo stesso paziente o di un familiare

simile, questo è uno dei più difficili trapianti, perché tocchi tutte le cellule staminali

ed è importantissimo fare delle valutazioni accurate nei familiari.

Sono necessari dei controlli che hanno portato ad una situazione estremamente

favorevole, e la trapiantologia è una delle più brillanti negli anni, e si va avanti anche

nelle metodologie chirurgiche, ad esempio ultimamente i reni

43

MALATTIE COMPLESSE

malattie complesse

Si definiscono quelle malattie multifattoriali ovvero in cui è

chiaramente riconoscibile una doppia componente: da un lato una suscettibilità

genetica e dall’altro una componente ambientale che agisce spesso come fattore

scatenante. Ne sono esempi il diabete di tipo 2, alcune forme di cancro, l’ipertensione

e probabilmente le malattie neurodegenerative, malattie cognitive anche infantili

come l’autismo. La complessità è situata proprio nel comprendere quanto incidono i

fattori genetici e quanto i fattori ambientali. Inoltre spesso non si parla di un singolo

fattore genetico determinante, e quindi di malattie monofattoriali, in cui tutti gli

individui affetti presentano la mutazione e al contempo tutti i non affetti non la

presentano: ci sono infatti molteplici fattori genetici che contribuiscono ad aumentare

la predisposizione. Quindi risulta importante e anche difficile riconoscere il

contributo di questi geni, dal momento che spesso sono molti e ciascuno di essi ha

poca influenza. polimorfismi

Occorre quindi parlare non tanto di mutazioni quanto di (si ricorda che

tali concetti indicano entrambi una variazione nella sequenza, ma la mutazione è rara

e porta spesso con sé il concetto di malattia, di patologia, mentre il polimorfismo è

meno raro, ed è legato al concetto di variabilità interindividuale). Infatti la presenza

di molti elementi variabili all’interno del patrimonio genetico di una persona può

aumentare la suscettibilità ad una determinata malattia, ma questi elementi sono

molti, e spesso hanno un contributo piccolo. Un raro esempio di gene che incide

molto nello sviluppo di una malattia è quello che codifica per la variante E4 della

apolipoproteina E, il quale pur essendo presente nella metà degli individui affetti da

morbo di Alzheimer, non determina la patologia in tutti gli individui che la

presentano. Quindi riconoscere i soggetti geneticamente a rischio non risulta

semplice, a tal punto che risulta forse più facile correggere e migliorare le influenze

ambientali. Tali malattie complesse sono molto frequenti nella popolazione adulta, e

rappresenteranno un peso notevole per i sistemi sanitari in quanto la popolazione

mondiale sta invecchiando.

Occorre, al fine di comprendere meglio tali patologie, parlare di caratteri , in quanto

la complessità si applica a tutta una serie di caratteri che sono sotto il controllo di più

continue

geni. Tali caratteri presentano delle variazioni che non sono discrete, ma

ovvero aventi una distribuzione del fenotipo da un estremo ad un altro con tutta una

serie di gradazioni di piccole differenze. Si può quindi organizzare la popolazione che

si sta studiando tracciando una curva “a campana”, che può essere più o meno stretta

a seconda della variabilità della popolazione, con valori estremi organizzati attorno

ad un valor medio centrale. Ciascun gene agisce su quel carattere in maniera additiva

o nulla e la sua trasmissione è comunque regolata dalle leggi di Mendel. Esistono poi

44

variabilità nella penetranza e nella espressività di alcuni geni, inoltre le mutazioni in

taluni geni possono essere dominanti oppure recessive.

Quindi, riassumento, i caratteri poligenici hanno le seguenti caratteristiche principali:

1) I caratteri poligenici sono solitamente misurati più che contati;

2) Due o più geni contribuiscono al fenotipo in maniera additiva. L’effetto esercitato

da alcuni alleli può essere minimo o addirittura nullo;

3) L’espressione fenotipica dell’ereditarietà poligenica varia nell’ambito di un

intervallo molto ampio. Questa variazione è analizzabile più adeguatamente a livello

di popolazione piuttosto che di individui, i quanto ampie coorti di pazienti

permettono di cogliere le più piccole differenze.

Per caratteri influenzati da un singolo gene la cui presenza determina fenotipi con

variazioni discrete è possibile quindi distinguere fenotipi diversi, Molti tratti tuttavia

non cadono in categorie discrete, ma continue. Esempi sono l’altezza, il BMI, il

colore della pelle, ecc. Questi tratti sono definiti quantitativi.

Il concetto che non tutta la variabilità di un carattere venga determinata da differenze

“Nature vs Nurture”

genetiche fra individui ha aperto il dibattito (Ovvero natura vs

coltura, allevamento, predisposizione ambientale), con le dovute implicazioni in

campo sociale e politico.

Come è possibile quindi determinare quanto influisca la predisposizione genetica e

quanto influisca l’ambiente?

Josef Gottlieb Kolreuter, botanico contemporaneo a Mendel, incrociando piante di

tabacco appartenenti a popolazioni con fenotipi opposti e distinti (Piante alte e piante

basse) si attendeva risultati simili a quelli ottenuti dagli esperimenti mendeliani.

Tuttavia egli otteneva una F1 il cui fenotipo era intermedio ai due estremi della

generazione parentale, e una F2 che presentava i due fenotipi della P1, più una serie

di fenotipi intermedi. Questo tipo di risultato si può spiegare solo se ipotizziamo che

l’altezza sia controllata non da un solo gene, ma da più geni, ad esempio due. Quindi

al fenotipo “pianta alta” corrisponderà un genotipo AABB, al fenotipo pianta bassa

un genotipo aabb. Si può dunque immaginare che la variante allelica di ciascun gene

indicata con le lettere maiuscole aggiunga all’altezza base, rappresentata dalla

variante indicata con le lettere minuscole e quantificata ad esempio in 2 piedi, una

misura discreta, quantificata ad esempio con 1 piede.

Pertanto il fenotipo della F1 originato da un incrocio aabb X AABB, avrà genotipo

AaBb, ovvero un altezza pari a 2+1+1 piedi, ovvero 4, altezza intermedia a quelle

45

parentali. E ancora, la F2 presenterà tutta una serie di fenotipi intermedi dovuti alle

varie combinazioni di queste due varianti alleliche di questi due geni.

Se più geni ancora influenzassero un determinato carattere si dovrebbero immaginare

ancora più classi fenotipiche, le cui discontinuità sono così minime da renderli

continui.

Si ricorda inoltre l’esperimento di Johannsenn condotto sui fagioli, in cui egli

incrociò piante che davano origine a fagioli estremamente pesanti a piante che

davano origine a fagioli estremamente leggeri, ovvero due fenotipi opposti e distinti.

Tuttavia egli da questi incroci otteneva piante i cui fagioli non avevano mai lo stesso

fenotipo estremo della generazione parentale. Anche incroci di piante che davano

fagioli molto pesanti con piante dello stesso tipo davano come risultato piante con

fagioli leggermente più leggeri. Il risultato di questo esperimento può essere spiegato

tenendo conto delle interazioni ambientali: è possibile infatti che quella determinata

pianta che avuto fagioli eccezionali abbia beneficiato di condizioni ambientali

relativamente eccezionali che non si riproducono nella generazione successiva. Nella

l’interazione

manifestazione di un carattere complesso interviene quindi anche

ambientale, che modifica il modo di esprimersi di un fenotipo.

EREDITÀ COMPLESSA DI CARATTERI

QUANTITATIVI: IL MODELLO ADDITIVO A SOGLIA

La malattia invece è qualcosa che noi arbitrariamente

definiamo, che ha un confine prestabilito e ben

definito, oltre il quale si è malati e prima del quale non

lo si è. Si introduce quindi un modello definito modello

additivo a soglia, che serve per spiegare la

distribuzione discontinua di alcuni caratteri multifattoriali. Secondo questo modello,

la suscettibilità per una malattia genetica è distribuita tra gli individui lungo una

curva a campana. Questa predisposizione è causata da un certo numero di geni,

ognuno dei quali agisce in modo additivo. Solo quegli individui che hanno una

predisposizione genetica sopra una certa soglia si ammalano se esposti a determinate

condizioni ambientali. È possibile immaginare questo concetto tramite la metafora

del bicchiere, in cui l’acqua rappresenta la predisposizione genetica che ciascuno di

noi ha per una determinata malattia e i dadi rappresentano le condizioni ambientali a

cui andiamo incontro. Se noi partiamo con un livello di acqua “basso”, anche con

condizioni ambientali sfavorevoli potremo non sviluppare la patologia, cioè l’acqua

non tracimerà dal bicchiere. Viceversa un livello di acqua di partenza alto e quindi

46

predisposizioni genetiche favorevoli allo sviluppo della patologia oppure condizioni

ambientali estremamente sfavorevoli potranno far tracimare l’acqua, ovvero

determinare la comparsa della patologia.

Come è quindi possibile determinare la soglia, ovvero l’ereditabilità di un

determinato carattere?

Si parte da una serie di osservazione sulle famiglie e sugli individui. Anzitutto si nota

che spesso i parenti di un affetto da una determinata malattia sono posizionati

omogeneamente più a destra nella curva a campana, e in generale questo diminuisce

con il grado di parentela. Questa considerazione fa supporre che vi sia un contributo

genetico nella comparsa di alcune patologie. Su queste patologie oggi si fanno le

consulenze genetiche, diverse da quelle che si effettuano per le patologie

monofattoriali per le quali è richiesta una diagnosi di certezza. Infatti non è possibile

certificare la presenza di una malattia complessa con certezza, ma si offre una serie di

test di suscettibilità in particolare per le malformazioni. La diagnosi è quindi una

diagnosi di probabilità, ancor di più per le malattie complesse dell’età adulta, per cui

non si fa altro che stimare delle probabilità, dal momento che tutto ciò riguarda il

concetto di polimorfismo. Di fatto ogni polimorfismo incide molto poco, e quindi è

difficile stimare quanto una determinata persona sia predisposta a sviluppare una

patologia.

VARIABILITÀ, RISCHIO RELATIVO

2

(h )

Quello che si cerca di fare è la stima dell’ereditabilità che esprime quanto la

variazione fenotipica osservata sia dovuta a differenze genotipiche. È osservabile a

2

livello di popolazione e non di singoli individui, è cioè un valore statistico. Se h è

2

alta, la variazione fenotipica è essenzialmente genetica, se h è bassa, il contributo

47 varianza genetica

genetico è minimo. Viene espressa come il rapporto fra la

(varianza fenotipica di un carattere in una popolazione attribuibile a differenze

varianza

genotipiche) e la varianza totale (ovvero la somma di varianza genetica e

ambientale, che indica la varianza fenotipica di un carattere in una popolazione

attribuibile a differenze ambientali). 2

Esistono patologie e caratteri che hanno valore di h molto vicino ad 1 e sono cioè

molto geneticamente determinate, e patologie con valori vicino a 0, e cioè poco

2

geneticamente determinate. H viene calcolata sulla base di osservazioni effettuate fra

parenti poiché è nota la frazione di geni condivisa. Per prima cosa si stima quindi il

rischio relativo (λ ), cioè la probabilità che una persona sviluppi una certa patologia

r

sapendo che appartiene ad un determinato nucleo familiare. viene quindi calcolato

λ r

come il rapporto fra la prevalenza della patologia in un parente e la prevalenza della

patologia nella popolazione. =1 indica che un parente di un affetto non ha più

λ r

probabilità di sviluppare una patologia rispetto a qualunque individuo della stessa

popolazione. Tutto ciò risulta utile per la diagnostica prenatale conoscendo il per

λ r

una determinata malattia. studi sulle famiglie,

Vengono quindi effettuati in primis in quanto i membri di una

famiglia condividono una proporzione maggiore di alleli rispetto ad individui non

parenti. Una caratteristica primaria delle patologie ad eredità complessa è la presenza

di una aggregazione famigliare. Nondimeno il contrario non è necessariamente vero,

in quanto l’aggregazione famigliare di una patologia non implica un contributo

genetico dal momento che fattori non genetici possono avere lo stesso effetto: le

famiglie non condividono solo alleli, ma molto spesso anche cultura, comportamento,

dieta ed esposizioni ambientali. Nello specifico analizzando le famiglie si possono

concordanza,

avere fenomeni di in cui due individui della stessa famiglia sviluppano

la stessa patologia sia nel caso in cui condividano gli stessi alleli, sia nel caso opposto

fenocopie. discordanza

in cui non li condividono, e in tal caso si parla di In casi di

invece alcuni membri di una famiglia hanno una patologia, altri no: ciò si può

spiegare tramite la presenza o meno di alleli malattia, oppure a fenomeni di

penetranza incompleta. La penetranza incompleta e le fenocopie contribuiscono alla

difficoltà nella identificazione dei geni malattia. Il secondo gruppo di individui che

gemelli

vengono studiati per cercare di distinguere geni e ambiente sono i che

possono essere monozigoti (derivanti cioè da embrioni geneticamente identici) e

dizigoti che sono equivalenti a fratelli. I gemelli sono informativi in quanto è

possibile osservare la concordanza o la discordanza di una determinata patologia. Se

il tratto è geneticamente determinato mi aspetto di trovarlo in entrambi i gemelli con

una concordanza del 100 % in caso di gemelli monozigoti e del 50 % nel caso di

gemelli dizigoti. Lo studio deve essere condotto su moltissime coppie di gemelli che

vanno seguiti nel tempo, tramite studi osservazionali. Sono nati a tal fine in Europa e

48

in Italia studi coordinati dai vari ministeri della salute chiamati Registri gemelli, in

cui vengono condotti studi di tipo osservazionale su varie coppie di gemelli,

intervistati periodicamente sullo stato di salute. Sebbene non si trovino mai

percentuali come 100 % e 50 % per malattie multifattoriali come detto

precedentemente, ciò che guida la ricerca è il fatto di trovare un maggior tasso di

concordanza nei monozigoti piuttosto che nei dizigoti, suggerendo quindi il ruolo

della predisposizione genetica . Si fanno quindi confronti fra i tassi di concordanza

dei vari tipi di gemelli. Dopo un primo livello puramente osservazionale si passa ad

un secondo livello di prelievo di materiale biologico, che permette analisi a livello

genetico più preciso e specifico. Le obiezioni mosse a tale studio riguardano il fatto

che molto spesso gemelli monozigoti condividono non soltanto il patrimonio genetico

ma anche le interazioni ambientali (per ciò che riguarda la vita intrauterina del tutto

uguali, per la maggior parte simili invece nel resto della vita). L’immagine riportata

mostra i tassi di concordanza per determinate patologie per gemelli monozigoti e

dizigoti. Vengono inoltre condotti studi su gemelli che sono stati separati alla nascita

e hanno condotto quindi vite diverse, venendo sottoposti quindi a diverse pressioni

ambientali. Questi ultimi rappresentano però una categoria piuttosto rara di individui,

e quindi difficilmente analizzabili. L’ultima categoria di individui analizzati sono gli

individui adottati, persone ovvero che non condividono varianti alleliche con la

famiglia di adozione ma che subiscono spesso la grande maggioranza delle influenze

ambientali. Tali studi hanno che la durata della vita è ampiamente influenzata da

fattori genetici, ma non è influenzata da fattori genetici quando la morte sia dovuta a

malattie cardiovascolari. In particolare se un parente adottivo muore prima dei 50

anni per patologie cardiovascolari, i figli adottivi hanno un rischio di morte per

patologie cardiovascolari fino a 3 volte superiore rispetto ad un individuo scelto a

caso nella popolazione generale.

ANALISI DI LINKAGE E STUDI GENOME WIDE

Quindi molto spesso le malattia complesse o multifattoriali sono malattia che

riguardano l’età adulta (in quanto il substrato genetico interagisce con una serie di

sollecitazioni ambientali), a differenza di quelle mendeliane o monofattoriali che

sono quasi tutte malattie dell’infanzia. Pertanto le principali difficoltà

nell’identificazione di geni coinvolti in malattie complesse riguardano la variazione

di più geni diversi, molto spesso eterogenei, che interagiscono fra loro , il fatto che

queste variazioni influenzino poco il fenotipo e che esse siano spesso presenti anche

in individui sani. È pertanto difficile individuare test genetici che esprimano il rischio

di sviluppare una tale patologia. Lo sforzo della ricerca in questi ultimi anni è teso

quindi ad individuare le varianti alleliche di questi geni, conducendo studi sulle

49

analisi di linkage

popolazione. Si effettuano pertanto simili a quelle effettuate sulle

malattie mendeliane, cioè si cerca di trovare degli elementi di variabilità genetica o

polimorfismi che vanno sempre insieme al tratto patologico. Quindi si cerca, nella

zona di variabilità trasmessa assieme al fenotipo patologico, se ci possono essere dei

geni che possono risultare coinvolti nello sviluppo della patologia. Tuttavia la

dimostrazione che quel polimorfismo predisponga ad essa è molto difficile, in quanto

le prove di laboratorio sono meno stringenti (si parla infatti di suscettibilità e non di

determinazione della patologia).

Altri studi che sono stati effettuati nella identificazione delle varianti ad alto impatto

genome wide,

sono gli studi di associazione che escono dal concetto di famiglia ed

entrano in quello di popolazione. Si costruiscono pertanto due popolazioni, una di

casi e una di controlli, con un numero di campioni molto elevato (migliaia di

individui). Ci si chiede se esistono elementi di variabilità genetica che ricorrono più

frequentemente nei casi rispetto ai controlli, effettuando uno studio genome wide, in

maniera asettica, paragonando milioni di polimorfismi. Tuttavia valutare 10­12

milioni di polimorfismi allo stesso momento risulta molto difficile. Ma a causa del

concetto di linkage esiste una sorta di gerarchia fra polimorfismi, ovvero a

determinati polimorfismi (detti Tagging SNPs) corrispondono una serie di

polimorfismi ad esso associati. Questo fenomeno permette un’analisi di pochi

polimorfismi (il 10 % del totale, circa 1,5 milioni) per avere un’idea dell’intero

genoma. Pertanto si può sapere se un determinato polimorfismo è significativamente

più presente nel caso rispetto al controllo.

I problemi associati a tali studi riguardano principalmente la scelta dei casi e dei

controlli. Per il primo gruppo di individui risulta infatti necessario avere a

disposizione materiale genetico di un numero elevato di persone valutate, con lo

stesso criterio, come malati per una determinata patologia. Per il secondo gruppo di

individui si hanno ancora più difficoltà, in quanto un “buon controllo” è una persona

dello stesso sesso e della stessa età che però non ha quella patologia, deve perciò

essere age and sex matched. Inoltre è necessario considerare anche l’etnia di

provenienza, in quanto le popolazioni riflettono la storia genetica di quella

determinata popolazione. Si deve cioè avere la stessa rappresentazione etnica fra casi

casi e controlli

e controlli. La scelta di risulta molto spesso complicata anche dal

fatto che spesso la scelta della soglia fra salute e malattia è arbitraria, pertanto se fra

gli individui ci controllo c’è una sovra espressione di individui borderline, cioè di

individui vicino alla soglia, lo studio condotto potrebbe non tenere conto di

polimorfismi importanti e significativi.

Ultimamente inoltre vengono effettuate più che altro meta analisi, ovvero analisi che

tengono conto di grosse analisi provenienti da molte parti del mondo e ne

confrontano i risultati. Nondimeno tutto ciò dal punto di vista medico e clinico ha

poca rilevanza, in quanto non si riesce a ideare un test che individua i soggetti a

50

rischio e permette di mettere in atto modifiche della componente ambientale per

impedire lo sviluppo della malattia.

Inoltre sono stati sviluppati studi che cercano di analizzare e misurare le componenti

ambientali, non sempre scontate per molte patologie. I test epidemiologici attuali

utilizzano e sfruttano sostanze presenti nel sangue come degli indizi di un danno ad

una esposizione ambientale. Da qui la nuova scienza dell’esposomica, che analizza

condizioni oggettive per misurare l’esposizione ambientale. L’individuazione della

componente genetica potrebbe inoltre aprire nuove strade per l’ideazione di farmaci

per patologie che attualmente sono incurabili.

PATOLOGIA DI ALZHEIMER (INTRODUZIONE)

Tale patologia risulta

significativa in quanto

l’approccio storico che è

stato usato per affrontarla

ha sfruttato le

metodologie

precedentemente

descritte.

Anzitutto la patologia di Alzheimer è una demenza caratterizzata dalla progressiva

perdita delle capacità associate alla corteccia cerebrale, a partire dalla perdita di

memoria e con il conseguente coinvolgimento di funzioni cerebrali quali linguaggio,

capacità visuo­spaziali, personalità e comportamento. Attualmente esiste una terapia

di natura sintomatica, e non sono noti dei sistemi di prevenzione. Venne identificata

più di 100 anni fa, tramite l’esame autoptico dei cervelli degli individui con la

sintomatologia descritta. In questi individui si notava un ridotto spessore della

corteccia.

Il primo studioso che ha definito le anomalie patologiche microscopiche fu George

amiloide

Glenner, il quale ha identificato nella sostanza la principale componente

β

delle placche che caratterizzano il cervello degli affetti. La diagnosi di certezza di

questa patologia è quindi una diagnosi bioptica post mortem. Tale diagnosi identifica

neurofibrillary tangles,

queste placche, insieme ai cosiddetti ovvero delle

precipitazioni di sostanza amorfa presenti all’interno dei neuroni. Si pensa che tale

materiale amorfo interrompa la conduzione nervosa, e costituisca un elemento di

tossicità per i neuroni che vanno incontro ad apoptosi, causando così la progressiva

perdita di materiale cerebrale.

È una malattia comune in grandissimo aumento, e la sua prevalenza è direttamente

proporzionale con l’età. Il costo sociale di questa malattia è molto elevato, in quanto

le persone con questa patologia hanno bisogno di una assistenza totale. Non esistono

51

farmaci che combattono questa patologia, nel giro di qualche anno la persona diventa

totalmente non autosufficiente.

La diagnosi non è semplice, ed è un problema rilevante. I pazienti vengono sottoposti

ad una serie di test per stimare le capacità cerebrali, uniti all’utilizzo del

neuroimaging e del functional neuroimaging. Nel secondo di questi si ha la

somministrazione di una sostanza tracciante, come glucosio radioattivo, e la

conseguente richiesta di svolgere una qualche attività (motoria o di calcolo) per

vedere quali aree cerebrali si accendono e sono attivate. Unendo quindi questi tre tipi

di test (questionario, imaging, imaging funzionale) si arriva a dare una diagnosi di

questa malattia. Esistono vari tipi di Alzheimer:

Esistono famiglie in cui questa malattia si distribuisce come una malattia

- mendeliana, e costituisce meno dell’1 % di tutti i casi. In tali casi si comporta

come una patologia autosomica dominante, con insorgenza precoce (50/60

enni)

La maggior parte dei pazienti sono caratterizzati da una patologia per la quale

- sono stati condotti studi di eredibilità. Si è visto che per il fatto di appartenere a

una famiglia con un individuo malato si ha un rischio di 4 o 5 volte superiore

rispetto alla popolazione generale. Inoltre per i gemelli monozigoti si è visto

che se un gemello è affetto esiste il 50% di probabilità che il gemello la

sviluppi. Quindi in questi casi la malattia non è solamente geneticamente

determinata, anche se la componente genetica di suscettibilità è importante e

consistente.

GENETICA DELL’ALZHEIMER

La patologia di Alzheimer è caratterizzata dalla presenza nelle cellule nervose di

residui della proteina i quali precipitano diventando sostanza amorfa che

β­amiloide

da un lato danneggia i neuroni riempiendone il citoplasma di una sostanza che non

può essere degradata, dall’altro agisce come isolante impedendo la trasmissione del

segnale nervoso.

Esistono due varianti della malattia:

­Early onset: a insorgenza precoce

­Late onset: a insorgenza tardiva

Analizzando la prima delle due forme si nota che a livello familiare ha una

distribuzione di tipo autosomico dominante, quindi si è ipotizzato che questa malattia

fosse dovuta alla mutazione di un singolo gene. Successivamente in realtà si sono

individuati 3 geni, i quali però sono funzionalmente correlati.

52

Il primo di questi geni è quello per la proteina precursore della gli altri

β­amiloide,

presenilina 1 presenilina 2

due codificano per due enzimi detti (cromosoma 14) e

precursore delle

(cromosoma 1) che sono responsabili del taglio del Se i

β­amiloide.

frammenti che vengono tagliati superano la lunghezza di 42 amminoacidi precipitano

formando le placche di sostanza amorfa sopracitata, il problema è dato dal fatto che

questi aggregati peptidici sono poco solubili e quindi vengono eliminati con difficoltà

dal sistema della microglia cerebrale (sistema dei macrofagi cerebrali).

Essendo quindi una patologia da accumulo i danni si iniziano a notare solo dopo 4 o 5

decenni di vita del paziente, è rilevante in tal senso il fatto che i portatori di sindrome

di down i quali hanno una trisomia del cromosoma 21, sul quale è presente il gene per

il precursore della sviluppino al raggiungimento di tale età il morbo di

β­amiloide,

Alzheimer.

(I due enzimi presenilina 1 e 2 sono anche detti e secretasi).

γ β

I cervelli di individui che sviluppano la patologia in età avanzata presentano le stesse

lesioni di quelli che hanno una forma familiare ma non si sono evidenziate le stesse

mutazioni. Si è però notato un fattore di rischio che aumenta circa di 20­30 volte la

possibilità di sviluppare la malattia, il gene in questione è quello per la

apolipoproteina E4 la quale è coinvolta nella degradazione della proteina β­amiloide

ma è poco efficiente; questa mutazione non è però sufficiente per l’insorgenza della

malattia ma devono intervenire altre mutazioni non ancor note.

Per identificare queste altre mutazioni si possono fare degli studi chiamati genome­

wide, grazie ai quali si riescono ad evidenziare aree polimorfiche più frequentemente

associate con la malattia. Nell’immagine seguente sono riportati i principali

polimorfismi legati al morbo di Alzheimer:

­Apolipoproteina E4

­CLU: è una apolipoproteina presente nel Golgi che aiuta il normale folding delle

proteine

­PICALM: modula la produzione, il trasporto e il controllo del corretto folding della

β­amiloide.

­CR1

Ad oggi la ricerca si sta concentrando soprattutto sulle forme di prevenzione

all’insorgenza di questa malattia perché i danni già presenti non possono essere

riparati.

GENETICA DEL CANCRO

53

I tumori si accompagnano sempre ad un danno genetico, inoltre anche la progressione

della malattia da uno stadio benigno ad uno stadio metastatico è sempre legata a

mutazioni genetiche. I bersagli delle terapie contro

questa patologia sono:

­La capacità intrinseca della

cellula tumorale di proliferare

e non morire

­L’interazione tra cellule

tumorali e ambiente, in

particolare la mancata risposta

del sistema immunitario.

Un sistema che si sta

sperimentando attualmente

riguarda l’azione di due

anticorpi detti PD1 e PDL1. PD1 è un recettore espresso dai linfociti T ed è un

inibitore, serve cioè a spegnere la proliferazione, molti tumori esprimono il lignado di

questo recettore così da reprimere l’azione dei linfociti T che entrano nella massa

tumorale.

Le cellule cancerose inoltre smettono di esprimere le proteine del complesso

maggiore di istocompatibilità così da non poter essere controllate dai linfociti.

Melanoma: Molti pazienti presentano una mutazione nella chinasi BRaf che

partecipa alla cascata delle Map chinasi, così si sono introdotti degli inibitori a monte

e a valle del sistema di queste chinasi ottenendo grandi risultati iniziali seguiti però

da delle ricadute.

Si stanno tuttavia progettando delle possibili terapie che combinano inibitori della

proliferazione cellulare con degli anticorpi che inibiscono PDL1 espresso dal tumore

stesso così da permettere ai linfociti T del paziente di riconoscere e aggredire le

cellule cancerose.

Tumore alla mammella: Alle donne a cui è diagnosticato un tumore alla

mammella vengono fatti diversi esami genetici per sapere ad esempio se sono

presenti i recettori degli estrogeni così da poter utilizzare gli anti­estrogeni come

farmaci per la cura del cancro.

Un altro esame frequente riguarda l’oncogene ERB2, questo codifica per una tirosina

chinasi espressa sulla superficie delle cellule e quando è presente in grandi quantità

può essere utilizzato come farmaco un anticorpo monoclonale.

Leucemia: Il tumore nel corso del tempo non si mantiene sempre uguale a se stesso

ma intervengono nuove mutazioni, per questo è opportuno ripetere gli esami genetici

sistematicamente, soprattutto dopo aver praticato delle terapie che abbiano eliminato

gran parte della massa tumorale. 54

Infatti in un tumore che presenta gruppi di cellule con mutazioni diverse, l’azione di

un farmaco potrebbe portare all’eliminazione di alcuni di questi gruppi lasciando agli

altri un ambiente più favorevole in cui svilupparsi.

Nell’esempio sottostante vediamo che le cellule leucemiche iniziali sono mutate

prevalentemente nel gene che viene indicato in grigio, nella colonia seguente al

trattamento invece la mutazione più importante è quella arancione, le due malattie,

quella iniziale e la recidiva, si possono considerare come distinte.

EREDITABILITÁ DELLE MUTAZIONI

In generale il cancro non è una malattia ereditaria perché la mutazione colpisce le

cellule somatiche e non i gameti ma è possibile talvolta ereditare una predisposizione

alla patologia.

Le mutazioni ereditabili colpiscono però solo gli oncosoppressori, in quanto gli

oncogeni hanno un valore positivo nella regolazione della proliferazione e per questo

basta una mutazione in un singolo allele per generare il tumore, se questo fosse

ereditato l’embrione svilupperebbe subito dei tratti tumorali.

Le mutazioni caratteristiche degli oncosoppressori sono invece del tipo loss of

function, sono cioè mutazioni inattivanti che necessitano della perdita di funzionalità

di entrambi gli alleli per avere un effetto sul fenotipo. Per questo è possibile ereditare

un allele mutato che predispone alla malattia.

Individuare questa predisposizione non indica necessariamente che il soggetto

svilupperà un tumore ma può talvolta essere utile per stimarne la probabilità, anche

considerando il fatto che ogni mutazione favorisce la comparsa di nuove mutazioni.

Esofago di Barret:

Si tratta di una metaplasia intestinale che colpisce l’ultimo tratto dell’esofago il quale

non è fisiologicamente predisposto al contatto con pH acidi ma che in caso di reflusso

può essere sottoposto a questo tipo di stress. Per questo le cellule della mucosa

esofagea acquisiscono dei cambiamenti di tipo genetico che possono diventare una

forma di predisposizione allo sviluppo di un cancro. I pazienti a cui è diagnosticata

questa malattia sono sottoposti a endoscopie frequenti e alla rimozione periodica del

tessuto danneggiato così da prevenire la formazione di un tumore che comporterebbe

interventi chirurgici molto più invasivi.

oncogeni:

Esistono due forme di mutazione negli

­Quantitative: amplificazione del gene, ne è un esempio il gene di c­erbB o quello di

Myc che viene amplificato a tal punto da costituire metà del cromosoma a cui

appartiene, la cellula diventa quindi invasa dal mRNA di Myc e avvia un processo

proliferativo anche in assenza di segnali extracellulari. Sapere se nei pazienti con un

55

tumore è mutato il gene di Myc ha un valore prognostico in quanto indica uno stadio

già avanzato del cancro, (1/3 dei soggetti con un carcinoma invasivo presenta

l’amplificazione di Myc).

­Qualitative: formazione di proteine iperattive generate solitamente da mutazioni

puntiformi, l’esempio classico è quello di Ras traslocazioni.

Nelle neoplasie del tessuto emopoietico diventano importanti anche le

oncosoppressori

Le mutazioni più frequenti relative agli sono invece:

­Delezione dell’intero gene

del promotore

­Metilazione del gene e conseguente silenziamento del gene stesso.

Questa è la forma più comune di perdita del secondo allele nel caso di mutazioni

ereditarie; si tratta di un controllo trascrizionale di tipo epigenetico che viene detto

perdita dell’eterozigosità.

Se viene ereditato un allele mutato in un oncosoppressore come p53 la malattia sarà

molto grave e probabilmente multi­organo in quanto questa proteina ha un ruolo di

controllo della proliferazione in ogni tessuto.

Se invece l’oncosoppressore mutato è BRCA1 il problema è di minore entità perché

questo gene viene espresso quasi esclusivamente nel tessuto della ghiandola

mammaria e in quello ovarico, perciò se si individua una predisposizione allo

sviluppo di una neoplasia si può intervenire chirurgicamente eliminando i tessuti a

rischio.

I tumori con una forma di ereditarietà familiare si riconoscono in genere perché nella

famiglia si sono registrati casi multipli dello stesso tipo di neoplasia e questa malattia

si ripresenta in più generazioni dimostrando così una dipendenza dal patrimonio

genetico; inoltre le persone colpite sono spesso più giovani della media dei pazienti e

il tumore colpisce generalmente più organi nel soggetto.

Sindrome Li Fraumeni:

La mutazione ereditaria è a carico di p53 e si constatano neoplasie in tutte le

generazioni della famiglia in questione, i tumori però non colpiscono sempre lo stesso

organo ma tessuti anche molto diversi fra loro.

I soggetti sviluppano la malattia in età molto giovane e la forma di trasmissione è di

tipo dominante perché non c’è salto di generazione ma la vera e propria patologia si

manifesta solo in caso di mutazione anche del secondo allele.

Carcinoma alla mammella:

È una patologia ereditaria nel 10­12% dei casi, per questo si è stimata la probabilità

di contrarre la malattia per una donna che abbia una parente malata.. Si è constatato

con questi studi che, se la probabilità per una donna della popolazione generale è di

1/12 di sviluppare un carcinoma alla mammella (life time) per una donna con una

parente di primo grado malata la probabilità aumenta a 1/8 e si innalza ancora a ¼ se

la parente ha un età vicina ai 40 anni, se le persone colpite dalla malattia in una

56

famiglia sono due (con meno di 40 anni), le parenti di primo grado hanno una

probabilità che si avvicina a 1/3 di sviluppare il carcinoma.

Per questo se sono presenti casi di questa neoplasia in una famiglia è consigliato far

eseguire un test genetico alle parenti per prevenire la formazione della stessa malattia,

ovviamente se anche il test risultasse negativo questo non indicherebbe

necessariamente che la trasmissione non sia di tipo ereditario ma che non riguarda

uno dei geni che attualmente sono conosciuti in relazione a tale patologia.

I geni incriminati in questo tipo di carcinoma sono BRCA1 e BRCA2:

­BRCA1: le mutazioni identificate sono oltre 300, perciò nel caso in cui una donna

richieda una consulenza genetica per questo gene viene effettuato un sequenziamento

della regione, nel caso in cui venga rilevata una di queste mutazioni la probabilità che

la paziente contragga il tumore variano dal 50 all’80 %.

­BRCA2: anche in questo caso si sono identificate molte mutazioni e perciò viene

sequenziato l’intero gene. In questo caso viene consigliato di richiedere una

consulenza genetica anche ai parenti di sesso maschile perché BCRA2 ha un ruolo

anche in altri tessuti come ad esempio la prostata, la laringe o il pancreas.

(la prof. ha caricato su campusnet degli articoli con il funzionamento molecolare dei

due geni per chi volesse approfondirlo).

Carcinoma del colon retto:

È su base ereditaria per il 15­20 % ma sono presenti due forme distinte:

adenomatosa familiare:

­Poliposi il gene mutatato è quello di APC, la presentazione

clinica tipica è data dalla presenza di numerosi polipi nel colon di questi soggetti, il

trattamento si basa su colonscopie frequenti e rimozione dei polipi così da non

permettere alla malattia di svilupparsi in una forma invasiva.

La progressione di questa patologia è stata studiata e presenta una serie di mutazioni

che portano alla progressione del tumore da uno stadio benigno ad uno maligno in

tempi relativamente lunghi. Per questo si consiglia alla popolazione di effettuare una

colonscopia intorno ai 50 anni, infatti se non sono presenti polipi difficilmente si

presenterà un carcinoma a quest’organo prima di altri 20 anni.

di Lynch:

­Sindrome i geni mutati posso essere MSH2 nel cromosoma 2 o MLH1

nel cromosoma 3. I due geni fanno parte del complesso di mismatch repair per questo

facilitano l’insorgenza di nuove mutazioni che possono essere molto variabili. Questa

patologia non porta alla formazione di polipi per cui è più difficilmente identificabile,

inoltre non ha un decorso conosciuto come quello della poliposi adenomatosa ma

presenta mutazioni successive sempre diverse.

Retinoblastoma:

Sono presenti due forme una familiare e una sporadica.

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in medicina e chirurgia (ordinamento U.E. - 6 anni) (ORBASSANO - TORINO)
SSD:
Università: Torino - Unito
A.A.: 2016-2017

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Medicina96 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Basi biologiche e genetica umana e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Torino - Unito o del prof Malavasi Fabio.

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