Genetica molecolare - Sbobinatura

Genetica molecolare

Gli studi di linkage sono volti ad esaminare la co-segregazione (segregazione verso lo stesso polo) di un genotipo con un marcatore polimorfico. Un tempo la diagnosi di anemia falciforme veniva fatta non come oggi (cioè progettando un oligonucleotide specifico) ma veniva fatta studiando l’associazione con marcatori. La cosa bella dei marcatori è che sono codominanti, cioè i marcatori polimorfici si riconoscono facilmente perché gli omozigoti mostrano una banda sola, mentre gli eterozigoti formano due bande (i primi marcatori, quelli usati da Morgan nelle sue osservazioni su Drosophila, erano dominanti/recessivi). Ricordiamo che, in genetica, nella codominanza l’eterozigote manifesta i fenotipi di entrambi gli omozigoti (dominanti e recessivi). Al contrario, nella dominanza incompleta, l’eterozigote manifesta invece un fenotipo intermedio tra quelli dei due omozigoti.

Caratteristiche dei marcatori polimorfici

• Dispersi in tutto il genoma
• Evidenziabili facilmente
• Devono essere molto polimorfici. In questi casi si parla di eterozigosità, cioè alta probabilità di “beccare” un eterozigote per il gene che vogliamo analizzare.
• Segregano in modo mendeliano

Il primo problema che si incontra nell’analisi di linkage è la determinazione della fase dove per fase si intende saper distinguere tra la condizione cis e la condizione trans. Se l’individuo doppio eterozigote AaBb ha gli alleli dominanti di ciascun gene sullo stesso cromosoma della coppia di omologhi, così come gli alleli recessivi sull’omologo, allora si dice i geni sono in cis; se invece i due alleli dominanti (così come i due alleli recessivi) non si trovano sullo stesso cromosoma della coppia di omologhi, allora si dice che i due geni sono in trans. Tuttavia, in genetica molecolare la distinzione tra cis e trans interessa relativamente perché noi lavoriamo con marcatori codominanti.

Concetto di informatività

Un altro concetto importante che dobbiamo sapere è quello di informatività, cioè la possibilità di determinare la fase, cioè stabilire se gli alleli dei marcatori sono in cis o in trans. Ciò è comunque importante perché stiamo ragionando su un sistema in cui si lavora su due loci associati. Determinare la fase vuol dire capire la disposizione del marcatore in relazione al gene. Il nostro compito primario è determinare la fase tra gene e marcatore. Ovviamente la fase si può determinare solo se gene e marcatore sono eterozigoti. Se il marcatore non fosse eterozigote, non potremmo mettere in evidenza la segregazione (se il marcatore fosse omozigote darebbe lo stesso segnale indipendentemente dall’allele del gene da studiare).

Dal seguente pedigree vediamo che il nonno è affetto, la figlia (cioè la madre) del nonno è affetta pure e due figli della signora sono affetti pure. La madre è eterozigote Dd 12 dove D è il gene dominante della malattia, mentre d è il gene recessivo della malattia; 1 e 2 sono gli alleli del marcatore. Come possono essere combinati questi quattro elementi? O in cis o in trans. Potremmo avere D1/d2 oppure D2/d1.

Vediamo meglio i figli: i due maschi sono Dd 11, la femmina è dd 12. Qual è la fase? Il padre è dd 11 quindi possiamo dire con sicurezza che il padre trasmette a tutti i figli un cromosoma con d1. Tutto ciò che nei figli non è d1 deriva dalla madre. In termini di genetica classica questo incrocio è un classico test-cross (si dice che l’incrocio più informativo sia proprio un test-cross). Sulla base di quanto detto finora, possiamo anche dire che ai figli maschi la madre avrà sicuramente trasmesso D1, mentre alla figlia la madre avrà dato d2. Possiamo allora in prima approssimazione immaginare che nella madre D sta con 1 e l’allele d sta con 2 (la madre sarebbe D1/d2). L’allele malattia è D e segregherebbe con 1. Questa è un’informazione importante perché, d’ora in poi, ogni volta che vediamo l’allele 1 possiamo pensare che è associato all’allele D.

Questa condizione potrebbe essersi presentata a causa un evento di crossing over che ha messo sullo stesso cromosoma D e 1, ma ciò dovrebbe essere accaduto in tutti e tre i figli. Tuttavia, la probabilità che il crossing over sia avvenuto in tutti e tre i figli in questo modo è molto piccola ma non impossibile.

È possibile capirci qualcosa di più salendo di una generazione. Se noi genotipizziamo nonno e nonna materni ci accorgiamo che la nonna è dd22, mentre il nonno è Dd12. Anche questo è un incrocio molto informativo perché si tratta di un reincrocio. Di conseguenza la nonna può passare alla figlia soltanto d2, per cui il nonno può averle passato soltanto D1. Quindi la fase nella madre è sicuramente D1, così come era nella nostra ipotesi. In una singola segregazione, la fase spesso non è definibile in modo assolutamente certo ma, lavorando su tre generazioni (con due meiosi e due segregazioni) la fase può essere determinata in modo certo a patto che gli incroci siano informativi (cioè che siano dei reincroci).

Analisi prenatale

Se si fa l’analisi di uno dei figli, ammettendo che debba ancora nascere, si fa l’amniocentesi e poi si cerca di vedere l’associazione. Poiché non è ancora nato, non sappiamo se sarà D o d perché non sappiamo nulla sul gene e non possiamo osservare il fenotipo. Tutte le informazioni le possiamo ricavare dal marcatore. Siccome già abbiamo un fratello 11 affetto e una sorella 12 non affetta, qualcosa ci dice che se troviamo dall’analisi solo l’allele 1 il nascituro (o probando) sarà affetto come il fratello e quindi sarà pure Dd, cioè sarà malato. Ma quanto può essere vera questa previsione?

Tutto dipende dalla ricombinazione, che noi in qualche modo possiamo prevedere. La probabilità della ricombinazione è uguale alla distanza di mappa. Quindi, se la distanza tra D e 1 è pari a 5 cM (centi Morgan), vuol dire che la nostra previsione è vera al 95%. La distanza di mappa è la % di ricombinazione che può avvenire. In questo caso tra D e 1 c’è il 5% di probabilità che la ricombinazione avvenga nello spazio compreso tra i due loci.

Teoria della distanza genetica

Nel 1913 uno studente di Morgan, Alfred Sturtevant, suggerì che la percentuale di ricombinanti potesse essere utilizzata come una misura quantitativa della distanza tra una coppia di geni sulla mappa genetica. La distanza viene misurata in unità di mappa (um), dove 1 unità di mappa è definita come l’intervallo nel quale avviene l’1% di crossing-over (la frequenza di ricombinazione è utilizzata direttamente per stabilire le unità di mappa). Le unità di mappa vengono chiamate a volte anche centimorgan (cM) in onore di Morgan.

È importante notare che per una coppia di geni concatenati la frequenza di crossing-over non è la frequenza di ricombinazione. La prima si riferisce alla frequenza degli scambi fisici tra cromosomi in meiosi per una data regione tra i geni, mentre la seconda si riferisce alla frequenza di ricombinazione dei marcatori genetici in un incrocio, determinata analizzando i fenotipi della progenie. I genetisti seguono i marcatori genetici negli incroci ed i risultati sono dati sotto forma di frequenze di ricombinazione.

Loci sullo stesso cromosoma

Loci sullo stesso cromosoma non sono necessariamente in linkage: supponiamo che un individuo sia eterozigote per due loci, con gli alleli D e M di derivazione paterna, d e m di derivazione materna, localizzati sullo stesso cromosoma. I geni che sono sullo stesso cromosoma sono detti sintenici (letteralmente, “sullo stesso filamento”), indipendentemente da quanto siano vicini o separati sul cromosoma.

Come si comportano questi alleli durante la meiosi? Sappiamo che avvengono da 1 a 4 eventi di ricombinazione su tutti i cromosomi durante la meiosi allo stadio di quattro filamenti, cioè quattro cromatidi per coppia di cromosomi. Se non avviene nessun evento di ricombinazione tra i loci, i cromosomi nei gameti saranno, DM e dm, uguali ai cromosomi di origine parentale; un cromosoma parentale è quindi un cromosoma non ricombinante. Se si verificano ricombinazioni nel segmento dei cromatidi tra i loci, i cromatidi risultanti saranno Dm e dM, che sono diversi dai cromatidi di origine parentale; un cromosoma non parentale è quindi un cromosoma ricombinante.

Una, due, o più ricombinazioni che avvengono tra due loci allo stadio di 4 cromatidi, producono il 50% dei gameti ricombinanti (non parentali) e l’altro 50% di gameti non ricombinanti (parentale), che è esattamente la stessa proporzione osservata per i loci non associati. Così, se due loci sintenici sono sufficientemente separati sullo stesso cromosoma da consentire almeno un crossing-over tra loro ad ogni meiosi, si otterranno genotipi ricombinanti e non ricombinanti in uguale proporzione, e i due loci sembreranno non associati, come se appartenessero a due cromosomi differenti.

L’analisi di linkage genetico utilizza le frequenze di ricombinazione alla meiosi come misura della distanza genetica di due diversi loci. Se avviene almeno un crossing-over nel segmento cromosomico tra i due loci, ritroveremo in uguale proporzione entrambi i genotipi non ricombinanti DM e dm e quelli ricombinanti Dm e dM. Se i due loci sono invece strettamente associati sullo stesso cromosoma in modo che non avviene nessun evento di ricombinazione, c’è il linkage completo. I genotipi non ricombinanti sono trasmessi insieme contemporaneamente, si avranno solo le combinazioni di alleli non ricombinanti DM e dm, e la frequenza dei genotipi ricombinanti Dm e dM sarà 0. Tra questi due estremi vi è una situazione in cui i due loci sono abbastanza lontani che solo in alcune meiosi avviene la ricombinazione. Osserveremo combinazioni di alleli ricombinanti e non ricombinanti nei figli, ma la frequenza dei genotipi ricombinanti sarà compresa tra 0% (completamente associati) e 50% (completamente non associati): tanto più piccola è la frequenza di ricombinazione, quanto più vicini sono i due loci. La frequenza di ricombinazione viene indicata con la lettera greca theta ().

Abbiamo detto che la frequenza di ricombinazione nella progenie non può superare il 50%. Infatti, se i geni segregano in modo indipendente, ci attendiamo nella progenie un ugual numero di ricombinanti e parentali, così che la frequenza dei ricombinanti è pari al 50%. Se si ottiene una frequenza di ricombinazione del 50%, si conclude che i due geni sono indipendenti. I geni possono risultare indipendenti (cioè mostrano il 50% di ricombinazione) sia nel caso che si trovino su cromosomi diversi sia quando i geni stanno sullo stesso cromosoma molto lontano. Il secondo caso può essere spiegato così: singoli crossing-over tra un paio di cromatidi non fratelli originano due cromosomi parentali e due ricombinanti; cioè il 50% di ricombinanti fra i discendenti.