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LEZIONE 26/01/09 GENETICA MOLECOLARE

Nella seguente figura è mostrata una serie di situazioni (analisi di linkage AR, cioè

autosomico-recessivo, fibrosi cistica): nella prima situazione (quella più in alto) il padre è

portatore (Dd), la madre è portatrice (Dd), un figlio è affetto e per il nascituro occorre fare

una previsione. Poiché per il gene della fibrosi cistica non si sa nulla (è una falsità! Stiamo

considerando questa malattia come un puro esempio solo perché è AR) noi possiamo

lavorare sui marcatori associati (che noi conosciamo) al gene malattia autosomico

recessivo. Dalle analisi eseguite sui genitori ricaviamo che il padre è 11 e la madre è 22; il

figlio è 12 (e non poteva essere altro). Purtroppo, in questo caso non possiamo risalire alla

fase, cioè non possiamo capire nulla perché i marcatori sono in omozigosi. Non sappiamo

con quale marcatore ed in quale dei due cromosomi omologhi (per ciascun genitore) è

associato l’allele malattia. Pertanto la famiglia è informativa.

NON

Nel secondo caso assistiamo ad una famiglia pienamente informativa: i genitori sono

eterozigoti sia per quanto riguarda l’allele malattia sia per quanto riguarda il marcatore.

Poiché i genitori hanno già un figlio affetto che è 11, noi capiamo perfettamente che l’allele

malattia è in associazione con l’allele 1 sia nel padre sia nella madre. Di conseguenza,

quando genotipizziamo il probando possiamo ipotizzare dei risultati; per esempio, se è

omozigote 1 sarà probabilmente affetto (ammesso che non ci sia ricombinazione); se è

eterozigote 12 è sano (sempre ammesso che non ci sia ricombinazione); se è 22 è sano

(ammesso che non ci sia ricombinazione; ma è chiaro che sarebbe affetto pur essendo 22

solo se avranno ricombinato sia il padre sia la madre e questa coincidenza è più difficile).

Nel terzo caso la famiglia è parzialmente informativa: i genitori sono entrambi doppi

eterozigoti. Il figlio è omozigote per l’allele malattia ed eterozigote per l’allele marcatore.

Perché sia malato, il probando dovrà prendere o l’1 dal padre (l’1 nel padre è associato al

gene malattia?) e il 2 dalla madre (il 2 nella madre è associato al gene malattia?) oppure il

2 dal padre (il 2 nel padre è associato al gene malattia?) e l’1 dalla madre (l’1 nella madre

è associato al gene malattia?). Abbiamo un certo grado di incertezza. Tuttavia, possiamo

comunque osservare che se il probando è o 11 o 22 sarà sicuramente eterozigote per

l’allele malattia. La famiglia è parzialmente informativa perché alcune situazioni possono

essere determinate (l’essere malato 12 o portatore 11;22), altre no (non sappiamo il

linkage allele marcatore-allele malattia nel padre e nella madre). Inoltre, se il probando

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risulta essere 12 non è detto che sia necessariamente malato, anzi potrebbe essere

perfettamente sano. Infatti, se ammettessimo che l’1 (associato all’allele D) l’abbia

ereditato dal padre e il 2 (associato all’allele D) dalla madre, lui sarebbe genotipicamente

12 (quindi come il fratello malato per quanto riguarda l’allele marcatore) ma anche DD

(diversamente dal fratello che è omozigote recessivo, in quanto manifesta la malattia). In

tutto questo casino, ci viene in soccorso la famiglia: se il probando è 11 o 22 sarà

certamente portatore (da tutto questo stiamo omettendo le ricombinazioni).

In questo altro esempio viene

mostrata la genotipizzazione del

marcatore (MetH, distante dal gene

malattia (CF = Fibrosi Cistica) circa

1Mb). Come si vede, il genotipo del

padre è 12 e (dopo aver fatto PCR e

digerito con l’enzima di restrizione) in

elettroforesi appaiono due bande

dove una banda rappresenta

l’amplificato non tagliato e l’altra (in

realtà sono due piccole bandine

sovrapposte parzialmente)

rappresenta l’amplificato tagliato.

Pertanto, abbiamo a che fare con due alleli (eterozigote per il marcatore); la madre invece

mostra una sola banda, quella dell’amplificato non tagliato, quindi è omozigote 11; il figlio

affetto da fibrosi cistica è come la madre, per cui è omozigote 11; il probando ha la stessa

situazione del padre, per cui il genotipo è 12; C è il controllo che si fa per vedere se

+

l’enzima di restrizione taglia. La famiglia è parzialmente informativa perché non sappiamo

se l’allele 1 che la madre trasmette al probando è associato all’allele recessivo per il gene

malattia oppure è associato all’allele dominante per il gene malattia. Quindi, non sappiamo

se il nascituro è portatore o sano. Sappiamo però con certezza che non è malato (stiamo

escludendo l’eventualità di una ricombinazione). In quest’altro esempio abbiamo

come marcatore Xv-2c, vicino al

gene malattia (CF = Fibrosi

Cistica) circa 200 kb. Il gel in

questo caso è molto più pulito, le

due bandine infatti si distinguono

molto bene. In questa situazione,

sia la madre sia il padre hanno

genotipo 12 per quanto riguarda il

marcatore; il figlio affetto è 12. In

questo stato non possiamo fare

un’associazione né del padre né

della madre (la trasmissione è 1p e

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2m oppure 1m e 2p, dove p = padre e m = madre). La famiglia nel suo insieme non è

informativa, tuttavia i risultati del probando ci dicono che è omozigote 11, quindi possiamo

almeno ricavarne che costui sarà probabilmente portatore (nella peggiore delle ipotesi).

A questo punto dobbiamo chiarire alcuni concetti:

Per Aplotipo si intende una particolare associazione fra gene e marcatore. Ad

- esempio D1 (sullo stesso filamento) è un aplotipo, nel senso che sono in

associazione su un singolo cromosoma, quindi in una condizione aploide. d

associato a 2 è un altro aplotipo (d2); potremmo avere pure D associato a 2 o d

associato a 1. Ogni associazione su un singolo cromosoma fra due alleli (allele

marcatore e allele gene malattia) è un aplotipo.

Linkage Disequilibrium (LD): Si fa il LD quando in una data popolazione l’allele

- malattia è sempre associato con uno specifico allele marcatore. Un caso di LD è

quello che riguarda l’anemia falciforme in Sicilia: è stato dimostrato che la

mutazione che provoca l’anemia falciforme in Sicilia proviene dalla Costa D’Avorio.

In Sicilia è passato non solo l’aplotipo (attraverso la deportazione) ma anche tutti gli

altri marcatori associati, attraverso cui scopriamo se c’è il gene mutato

nell’individuo. Basta identificare l’allele marcatore per dire ad occhi chiusi che c’è

anche la malattia. Se noi facciamo la stessa indagine in Costa D’Avorio, scopriamo

che le cose non stanno così. Troviamo invece che lì c’è il linkage equilibrium.

Linkage Equilibrium (LE): In questo caso, alla mutazione nel gene malattia

- possono essere associati diversi alleli marcatori. In Sicilia c’è un alto tasso di

anemia falciforme perché la condizione di eterozigote dava un certo vantaggio

selettivo nei confronti dell’infezione della malaria. E’ successo che l’allele che

portava il gene mutato è stato selezionato positivamente (si è conservato nelle

generazioni) e naturalmente vicino a lui si sono conservati tutti i marcatori associati;

di contro, tutti gli alleli che non avevano associato il gene malattia (con allele

mutato) si sono persi, perché non avevano la selezione favorevole. Pertanto, in

Costa D’Avorio troviamo tutti gli aplotipi possibili. Man mano che si sale verso la

Sicilia (dove c’è la malaria) si trovano soltanto quegli aplotipi che hanno invece il

vantaggio selettivo.

Il LE è una situazione bilanciata in cui sono presenti vari aplotipi per due (o più) alleli

in maniera più o meno omogenea (tant’è vero che “equilibrium” vuol dire situazione

bilanciata). Quando si verificano casi di deriva genetica, migrazione o selezione, si

determina piuttosto una situazione di LD, nel senso che tra tutti gli aplotipi possibili ne

vengono selezionati alcune in particolare. Questa non è una situazione stabile perché i

due loci, prima o poi, andranno incontro a ricombinazione e la situazione si riequilibra

(tostu poi ca prima). Infatti questa situazione viene indicata “disequilibrium” proprio per

il fatto di essere anomala. Il LD indica quindi una situazione instabile dal punto di vista

della popolazione. 75

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Guardiamo adesso la figura e supponiamo che il locus A corrisponda al gene malattia,

mentre il locus B al marcatore. Sulla base delle frequenze di Aa e di Bb, noi possiamo

prevedere che:

Se ci fosse Linkage equilibrium potremmo avere 49% ; 21% ; 21% ;

- 9% . Siccome ogni allele ha la sua frequenza non possiamo pretendere di

attenderci 25% in ciascun aplotipo.

- Se ci troviamo nella situazione in cui alcuni aplotipi prevalgono sugli altri (60% ;

10%

10% ; 20% ) siamo di fronte ad un linkage disequilibrium parziale.

Se ci troviamo nella condizione in cui solo due aplotipi sono presenti (70% ;

- 30% ) e non troviamo gli altri due aplotipi vuol dire che siamo di fronte ad un

perfetto linkage disequilibrium. Ci sono alleli che sono associati nettamente in

modo preferenziale rispetto a quello che ci si attenderebbe.

Secondo il test d’ipotesi, l’ipotesi zero (cioè l’ipotesi di riferimento) è in questo caso il

linkage equilibrium. La situazione limite è il linkage disequilibrium, in cui c’è

un’associazione preferenziale tra gli alleli. Il rapporto tra l’ipotesi zero e la situazione limite

ci dà l’entità dell’anomalia. 76

LEZIONE 26/01/09 GENETICA MOLECOLARE

Ammettiamo che l’allele A in seguito ad una mutazione diventi allele C. Questo vuol dire

che nella popolazione avremo cromosomi con l’allele A e cromosomi con l’allele C, con le

possibili combinazioni genotipiche negli individui (AA, AC, CC). Ammettiamo che in

vicinanza del gene che stiamo studiando ci sia G, che naturalmente è presente su

entrambi i cromosomi omologhi. Se G muta in C, ci sono due possibilità: o muta sul

cromosoma dove c’è A oppure muta sul cromosoma in cui c’è C, ma non

contemporaneamente su tutti e due perché la mutazione è un evento assolutamente raro

e casuale. Per cui noi abbiamo la mutazione nel locus G, ma possiamo stare sicuri che

questa mutazione cadrà solo su uno dei due cromosomi (nell’esempio in figura la

mutazione di G è ricaduta sul “cromosoma C”. I cromosomi A continuano ad avere G.

Inoltre, la mutazione non ha colpito tutti i cromosomi C, ma uno solo. Quindi noi avremo il

linkage AG (che è quello ancestrale), CG (in cui C deriva dalla mutazione di A) e CC (che

si è creato casualmente in terza battuta).

Abbiamo tre aplotipi.

Questi aplotipi sono inizialmente in

linkage disequilibrium, perché si sono

generati attraverso mutazioni casuali. Col

tempo succede che i tre aplotipi possono

ricombinarsi, ma dovremo aspettare tante

generazioni. Nell’uomo, ad esempio, la

ricombinazione è un evento abbastanza

raro. Mediamente nel maschio ne

avviene poco meno di una ogni 20 Mb,

mentre nella donna po’ più di una ogni 10

Mb nella donna (c’è anche questa

differenza tra uomo e donna). Un evento di ricombinazione potrebbe generare l’aplotipo

AC, che si aggiunge agli altri tre. Alla fine avremo AG, CG, CC e AC, di cui alcuni sono

ancestrali (AG), altri provengono da mutazioni (CG, CC) ed altri ancora da eventi di

ricombinazione (AC). Ci chiediamo allora: avviene prima la mutazione (per esempio da un

gene normale ad un gene malattia) oppure c’è prima il polimorfismo? (In realtà il caso

l’abbiamo già esaminato quando abbiamo parlato dell’anemia falciforme) Se avviene prima

la mutazione, allora vuol dire che avremo il polimorfismo (C) solo nei cromosomi mutati (C)

e non nei cromosomi normali (A). Se noi diciamo che viene prima il polimorfismo (C), la

mutazione al gene malattia (C) avviene in linkage con un allele particolare e non con

l’altro. In realtà, quello che succede deve essere poi bilanciato dalla ricombinazione. Ecco

perché è così difficile capire questo problema. Ed ecco perché si riscontrano problemi in

genetica delle popolazioni (infatti gli aplotipi fanno riferimento alle popolazioni). L’Africa è

la culla dell’umanità presumibilmente perché lì è presente il più alto numero di aplotipi,

cioè è presente la più grande variabilità genetica in termine di combinazione di alleli;

mentre negli altri continenti l’uomo ci è arrivato in seguito alla migrazione ed ha portato

con sé soltanto un piccolo nucleo di aplotipi, non tutto chiaramente (effetto del fondatore:

quando una piccola popolazione si separa da una popolazione più grande, si porterà con

sé solo una piccola parte del corredo di aplotipi). Ecco perché in Europa, in Asia, in

America è presente una minore quantità di aplotipi. 77

LEZIONE 26/01/09 GENETICA MOLECOLARE

A ciò segue un’altra considerazione: i cromosomi sono mosaici. Se inizialmente (ai

tempi di Adamo ed Eva) c’erano pochi aplotipi, gli effetti della ricombinazione, delle

mutazioni, gli effetti della selezione ecc. hanno prodotto una combinazione di alleli.

Nell’uomo, così come in tutti gli altri organismi viventi, c’è la tendenza a tramandare i

cromosomi così come sono. In aggiunta, ci possono essere dei movimenti, dovuti alla

ricombinazione, alla mutazione, alla selezione naturale, che portano a rimescolare il

patrimonio e ad estrarne delle combinazioni “vincenti” che meglio si adattano a quel

particolare ambiente in cui quel particolare organismo si trova a vivere. La creazione di

mosaici di cromosomi enfatizza la nozione di individualità genetica umana: ciascun

cromosoma ereditato da un figlio non è mai essenzialmente uguale a una delle due copie

di quei cromosomi dei genitori ma contiene invece alcuni segmenti derivati dai cromosomi

del nonno e della nonna.

Queste cose noi le dimostriamo grazie ai milioni di SNP che sono presenti nel genoma. Ce

ne sono così tanti che se prendiamo casualmente due persone qualunque si dice che si

distinguono per almeno un nucleotide ogni 100. Teoricamente dovremmo prendere tutti i

cromosomi umani di tutte le persone del mondo, li mettiamo a confronto e le stime sono

che una posizione ogni 100 cambia. Ovviamente se confrontiamo solo due italiani la stima

non sarà di un nucleotide ogni cento. Sarà invece 1:10000. Alla fine noi otterremmo tanti

aplotipi diversi. Tutti questi studi sugli aplotipi sono fondamentali per la

farmacogenomica. Gli studi di linkage si fanno per esempio tra marcatori e sensibilità al

farmaco, ossia stiamo parlando di fenotipi. La malattia genetica finora ci è stata utile solo

per fare un esempio. Anche la malattia genetica ha il risvolto fenotipico. Pertanto,

avremmo potuto fare altri esempi riferendoci alla capacità di risposta ad un farmaco, che è

misurabile, e quindi è un fenotipo. La ricerca farmaceutica sta iniziando a tenere conto che

ogni persona reagisce a suo modo ai farmaci (c’è chi è sensibile al farmaco ma c’è anche

chi è assolutamente refrattario). Ci sono persone (cui si fa la chemioterapia) che hanno

tumori resistenti ai farmaci e si prendono tutti gli effetti collaterali senza prendersi benefici.

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Applicazioni degli studi di associazione:

diagnostica molecolare;

 studi di popolazione;

 mappatura e Identificazione di geni

 mappatura di fenotipi (phenotyping mapping)

 farmacogenetica e farmacogenomica;

 miglioramento delle razze di allevamento;

 Epidemiologia;

 Studi di predisposizione genetica

 Malatie multifattoriali

 QTL (Quantitative Trait Loci)

 ecc...

Mappatura ed identificazione di geni: gli studi di associazione hanno permesso di

mappare i geni (mappe geniche), anche geni malattia, perché le posizioni dei geni e dei

loci marcatori nei cromosomi sono sempre fisse.

Mappatura di fenotipi: quando noi non sappiamo quale sia il gene coinvolto ma solo il

fenotipo. riusciamo a mappare un fenotipo su un cromosoma. Per esempio, l’epilessia è

presente in varie forme e non è una malattia genetica vera e propria, è legata a diversi

disordini neurologici; l’autismo, più che essere una malattia è una condizione. Attraverso i

marcatori si possono mappare certi fenotipi in particolari regioni dei cromosomi. Si

mappano con la speranza di andare a beccare i geni responsabili.

Epidemiologia molecolare: studia l’associazione tra i marcatori molecolari e la malattia.

QTL (non è in programma): sono studi di associazione che si basano sulla possibilità di

selezionare pezzi di cromosoma sulla base dei marcatori presenti. La selezione artificiale,

ad esempio per il miglioramento delle razze di allevamento, non si basa così sulla

selezione fenotipica (che è una selezione empirica e casuale), è più ragionata.

Malattie multifattoriali: Genetica delle patologie ad eredità complessa

Molte delle più comuni patologie umane sono a carattere ereditario. Malattie come i difetti

congeniti, l’infarto del miocardio (IM), il cancro, le malattie mentali, il diabete, la malattia di

Alzheimer (AD), sono causa di morbosità e morte in due individui su tre. Anche se queste

malattie sono causate in alcune famiglie da una mutazione in un singolo gene, non sono in

genere malattie monogeniche. Piuttosto derivano da un’interazione complessa tra un certo

numero di fattori predisponenti, incluso il genotipo di uno o più loci e una serie di

esposizioni ambientali che promuovono, accelerano o peggiorano il processo patologico.

In questa situazione, la comparsa della patologia nelle famiglie non segue il semplice

andamento dell’eredità mendeliana ma piuttosto quella dell’eredità complessa o

multifattoriale.

Una delle caratteristiche principali delle malattie ad ereditarietà complessa è che i soggetti

affetti tendono a concentrarsi in famiglie (aggregazione familiare) poiché condividono un

maggior numero di geni rispetto a individui presi a caso nella popolazione. Il contrario,

tuttavia, non è necessariamente vero: l’aggregazione familiare di una malattia non significa

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
A.A.: 2010-2011

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Novadelia di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Genetica molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università La Sapienza - Uniroma1 o del prof Bozzoni Irene.

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