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LEZIONE 26/01/09 GENETICA MOLECOLARE

che i due geni sono in trans. Tuttavia, in genetica molecolare la distinzione tra cis e trans

interessa relativamente perché noi lavoriamo con marcatori codominanti.

Un altro concetto importante che dobbiamo sapere è quello di informatività, cioè la

possibilità di determinare la fase, cioè stabilire se gli alleli dei marcatori sono in cis o in

trans. Ciò è comunque importante perché stiamo ragionando su un sistema in cui si lavora

su due loci associati. Determinare la fase vuol dire capire la disposizione del marcatore in

relazione al gene. Il nostro compito primario è determinare la fase tra gene e marcatore.

Ovviamente la fase si può determinare solo se gene e marcatore sono eterozigoti. Se il

marcatore non fosse eterozigote, non potremmo mettere in evidenza la segregazione (se il

marcatore fosse omozigote darebbe lo stesso segnale indipendentemente dall’allele del

gene da studiare). Dd 12 dd 22

dd 11 Dd 12

Dd 11 dd 12 Dd 11

Dal seguente pedigree vediamo che il nonno è affetto, la figlia (cioè la madre) del nonno è

affetta pure e due figli della signora sono affetti pure. La madre è eterozigote Dd 12 dove

D è il gene dominante della malattia, mentre d è il gene recessivo della malattia; 1 e 2

sono gli alleli del marcatore. Come possono essere combinati questi quattro elementi? O

in cis o in trans. Potremmo avere D1/d2 oppure D2/d1. Vediamo meglio i figli: i due maschi

sono Dd 11, la femmina è dd 12. Qual è la fase? Il padre è dd 11 quindi possiamo dire con

sicurezza che il padre trasmette a tutti i figli un cromosoma con d1. Tutto ciò che nei figli

non è d1 deriva dalla madre. In termini di genetica classica questo incrocio è un classico

test-cross (si dice che l’incrocio più informativo sia proprio un test-cross). Sulla base di

quanto detto finora, possiamo anche dire che ai figli maschi la madre avrà sicuramente

trasmesso D1, mentre alla figlia la madre avrà dato d2. Possiamo allora in prima

approssimazione immaginare che nella madre D sta con 1 e l’allele d sta con 2 (la madre

sarebbe D1/d2). L’allele malattia è D e segregherebbe con 1. Questa è un’informazione

importante perché, d’ora in poi, ogni volta che vediamo l’allele 1 possiamo pensare che è

associato all’allele D. Questa condizione potrebbe essersi presentata a causa un evento di

crossing over che ha messo sullo stesso cromosoma D e 1, ma ciò dovrebbe essere

accaduto in tutti e tre i figli. Tuttavia, la probabilità che il crossing over sia avvenuto in tutti

e tre i figli in questo modo è molto piccola ma non impossibile.

E’ possibile capirci qualcosa di più salendo di una generazione. Se noi genotipizziamo

nonno e nonna materni ci accorgiamo che la nonna è dd22, mentre il nonno è Dd12.

Anche questo è un incrocio molto informativo perché si tratta di un reincrocio. Di

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conseguenza la nonna può passare alla figlia soltanto d2, per cui il nonno può averle

passato soltanto D1. Quindi la fase nella madre è sicuramente D1, così come era nella

nostra ipotesi. In una singola segregazione, la fase spesso non è definibile in modo

assolutamente certo ma, lavorando su tre generazioni (con due meiosi e due

segregazioni) la fase può essere determinata in modo certo a patto che gli incroci siano

informativi (cioè che siano dei reincroci). Se si fa l’analisi di uno dei figli, ammettendo che

debba ancora nascere, si fa l’amniocentesi e poi si cerca di vedere l’associazione. Poiché

non è ancora nato, non sappiamo se sarà D o d perché non sappiamo nulla sul gene e

non possiamo osservare il fenotipo. Tutte le informazioni le possiamo ricavare dal

marcatore. Siccome già abbiamo un fratello 11 affetto e una sorella 12 non affetta,

qualcosa ci dice che se troviamo dall’analisi solo l’allele 1 il nascituro (o probando) sarà

affetto come il fratello e quindi sarà pure Dd, cioè sarà malato. Ma quanto può essere vera

questa previsione?

Tutto dipende dalla ricombinazione, che noi in qualche modo possiamo prevedere. La

probabilità della ricombinazione è uguale alla distanza di mappa. Quindi, se la

distanza tra D e 1 è pari a 5 cM (centi Morgan), vuol dire che la nostra previsione è vera al

95%. La distanza di mappa è la % di ricombinazione che può avvenire. In questo caso tra

D e 1 c’è il 5% di probabilità che la ricombinazione avvenga nello spazio compreso tra i

due loci. Nel 1913 uno studente di Morgan, Alfred Sturtevant, suggerì che la percentuale

di ricombinanti potesse essere utilizzata come una misura quantitativa della distanza tra

una coppia di geni sulla mappa genetica. La distanza viene misurata in unità di mappa

(um), dove 1 unità di mappa è definita come l’intervallo nel quale avviene l’1% di crossing

over (la frequenza di ricombinazione è utilizzata direttamente per stabilire le unità di

mappa). Le unità di mappa vengono chiamate a volte anche centimorgan (cM) in onore di

Morgan. E’ importante notare che per una coppia di geni concatenati la frequenza di

crossing over non è la frequenza di ricombinazione. La prima si riferisce alla frequenza

degli scambi fisici tra cromosomi in meiosi per una data regione tra i geni, mentre la

seconda si riferisce alla frequenza di ricombinazione dei marcatori genetici in un incrocio,

determinata analizzando i fenotipi della progenie. I genetisti seguono i marcatori genetici

negli incroci ed i risultati sono dati sotto forma di frequenze di ricombinazione.

Loci sullo stesso cromosoma non sono necessariamente in linkage: Supponiamo

che un individuo sia eterozigote per due loci, con gli alleli D e M di derivazione paterna, d

e m di derivazione materna, localizzati sullo stesso cromosoma. I geni che sono sullo

stesso cromosoma sono detti sintenici (letteralmente, “sullo stesso filamento”),

indipendentemente da quanto siano vicini o separati sul cromosoma. Come si comportano

questi alleli durante la meiosi? Sappiamo che avvengono da 1 a 4 eventi di ricombinazione

su tutti i cromosomi durante la meiosi allo stadio di quattro filamenti, cioè quattro cromatidi

per coppia di cromosomi. Se non avviene nessun evento di ricombinazione tra i loci, i

cromosomi nei gameti saranno, DM e dm, uguali ai cromosomi di origine parentale; un

cromosoma parentale è quindi un cromosoma non ricombinante. Se si verificano

ricombinazioni nel segmento dei cromatidi tra i loci, i cromatidi risultanti saranno Dm e dM,

che sono diversi dai cromatidi di origine parentale; un cromosoma non parentale è quindi

un cromosoma ricombinante. Una, due, o più ricombinazioni che avvengono tra due loci

allo stadio di 4 cromatidi, producono il 50% dei gameti ricombinanti (non parentali) e l’altro

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50% di gameti non ricombinanti (parentale), che è esattamente la stessa proporzione

osservata per i loci non associati. Così, se due loci sintenici sono sufficientemente separati

sullo stesso cromosoma da consentire almeno un crossing-over tra loro ad ogni meiosi, si

otterranno genotipi ricombinanti e non ricombinanti in uguale proporzione, e i due loci

sembreranno non associati, come se appartenessero a due cromosomi differenti. L’analisi

di linkage genetico utilizza le frequenze di ricombinazione alla meiosi come misura della

distanza genetica di due diversi loci. Se avviene almeno un crossing-over nel segmento

cromosomico tra i due loci, ritroveremo in uguale proporzione entrambi i genotipi non

ricombinanti DM e dm e quelli ricombinanti Dm e dM. Se i due loci sono invece

strettamente associati sullo stesso cromosoma in modo che non avviene nessun evento di

ricombinazione, c’è il linkage completo. I genotipi non ricombinanti sono trasmessi insieme

contemporaneamente, si avranno solo le combinazioni di alleli non ricombinanti DM e dm,

e la frequenza dei genotipi ricombinanti Dm e dM sarà 0. Tra questi due estremi vi è una

situazione in cui i due loci sono abbastanza lontani che solo in alcune meiosi avviene la

ricombinazione. Osserveremo combinazioni di alleli ricombinanti e non ricombinanti nei

figli, ma la frequenza dei genotipi ricombinanti sarà compresa tra 0% (completamente

associati) e 50% (completamente non associati): tanto più piccola è la frequenza di

ricombinazione, quanto più vicini sono i due loci. La frequenza di ricombinazione viene

indicata con la lettera greca theta, Abbiamo detto che la frequenza di ricombinazione

.

nella progenie non può superare il 50%. Infatti, se i geni segregano in modo indipendente,

ci attendiamo nella progenie un ugual numero di ricombinanti e parentali, così che la

frequenza dei ricombinanti è pari al 50%. Se si ottiene una frequenza di ricombinazione

del 50%, si conclude che i due geni sono indipendenti. I geni possono risultare

indipendenti (cioè mostrano il 50% di ricombinazione) sia nel caso che si trovino su

cromosomi diversi sia quando i geni stanno sullo stesso cromosoma molto lontano. Il

secondo caso può essere spiegato così: singoli crossing-over tra un paio di cromatidi non

fratelli originano due cromosomi parentali e due ricombinanti; cioè il 50% di ricombinanti

fra i due loci (Totale = 2/4 ricombinanti). Doppi crossing-over possono coinvolgere due, tre

o tutti e quattro i cromatidi. Nel caso di doppi crossing-over che coinvolgano gli stessi

due cromatidi non fratelli (chiamati doppi crossing-over a due filamenti) tutti e quattro i

cromosomi risultanti sono parentali (Totale = 0/4 ricombinanti). Per doppi crossing-over a

tre filamenti (doppi crossing-over che coinvolgono tre dei quattro filamenti), risulteranno

due cromosomi parentali e due ricombinanti (Totale = 2/4 ricombinanti). Nel caso di doppi

crossing-over a quattro filamenti, tutti e quattro i cromosomi saranno ricombinanti.

Considerando tutti i possibili siti di crossing-over, il 50% dei prodotti sarà ricombinante per

i due loci (8/16 ricombinanti tra tutti i crossing-over possibili = 50%). Analogalmente, per

qualsiasi numero di crossing-over multipli tra loci molto lontani, esaminando un gran

numero di meiosi si troverà che il 50% dei cromosomi è ricombinante. Questa è la ragione

del limite del 50% della frequenza di ricombinazione mostrata da geni non concatenati

sullo stesso cromosoma.

Il punto che si vuol mettere in evidenza è che, se due geni mostrano il 50% di

ricombinazione, ciò non significa necessariamente che siano localizzati su cromosomi

diversi. E’ necessario un maggior numero di dati per determinare se i geni sono sullo

stesso cromosoma o su cromosomi diversi. Un modo per scoprirlo è mappare altri geni

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dello stesso gruppo di concatenazione (le mappe geniche si costruiscono sulla base

delle frequenze di ricombinazione). Per esempio, se a e m mostrano una percentuale

del 50% di ricombinazione, forse troveremo che a mostra 27% di ricombinazione con e ed

e mostra il 36% di ricombinazione con m. Questo risultato ci indicherebbe che a e m fanno

parte dello stesso gruppo di concatenazione, approssimativamente a 63 um di distanza.

Lo studio del linkage è uno studio

probabilistico, perché non possiamo

scegliere, normalmente, fra l'ipotesi della

associazione e quella della ricombinazione.

Si basa su tre elementi:

1. fenotipo e marcatore (o due marcatori)

θ

2. frazione di ricombinazione (theta)

3. una particolare distribuzione statistica che prende il nome di

'distribuzione binomiale'.

Questi tre elementi ci danno il cosiddetto valore di

'maximum likelihood', cioè massima verosimiglianza, nella

distinzione fra parentali e ricombinanti. 72

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Nella seguente figura è mostrata una serie di situazioni (analisi di linkage AR, cioè

autosomico-recessivo, fibrosi cistica): nella prima situazione (quella più in alto) il padre è

portatore (Dd), la madre è portatrice (Dd), un figlio è affetto e per il nascituro occorre fare

una previsione. Poiché per il gene della fibrosi cistica non si sa nulla (è una falsità! Stiamo

considerando questa malattia come un puro esempio solo perché è AR) noi possiamo

lavorare sui marcatori associati (che noi conosciamo) al gene malattia autosomico

recessivo. Dalle analisi eseguite sui genitori ricaviamo che il padre è 11 e la madre è 22; il

figlio è 12 (e non poteva essere altro). Purtroppo, in questo caso non possiamo risalire alla

fase, cioè non possiamo capire nulla perché i marcatori sono in omozigosi. Non sappiamo

con quale marcatore ed in quale dei due cromosomi omologhi (per ciascun genitore) è

associato l’allele malattia. Pertanto la famiglia è informativa.

NON

Nel secondo caso assistiamo ad una famiglia pienamente informativa: i genitori sono

eterozigoti sia per quanto riguarda l’allele malattia sia per quanto riguarda il marcatore.

Poiché i genitori hanno già un figlio affetto che è 11, noi capiamo perfettamente che l’allele

malattia è in associazione con l’allele 1 sia nel padre sia nella madre. Di conseguenza,

quando genotipizziamo il probando possiamo ipotizzare dei risultati; per esempio, se è

omozigote 1 sarà probabilmente affetto (ammesso che non ci sia ricombinazione); se è

eterozigote 12 è sano (sempre ammesso che non ci sia ricombinazione); se è 22 è sano

(ammesso che non ci sia ricombinazione; ma è chiaro che sarebbe affetto pur essendo 22

solo se avranno ricombinato sia il padre sia la madre e questa coincidenza è più difficile).

Nel terzo caso la famiglia è parzialmente informativa: i genitori sono entrambi doppi

eterozigoti. Il figlio è omozigote per l’allele malattia ed eterozigote per l’allele marcatore.

Perché sia malato, il probando dovrà prendere o l’1 dal padre (l’1 nel padre è associato al

gene malattia?) e il 2 dalla madre (il 2 nella madre è associato al gene malattia?) oppure il

2 dal padre (il 2 nel padre è associato al gene malattia?) e l’1 dalla madre (l’1 nella madre

è associato al gene malattia?). Abbiamo un certo grado di incertezza. Tuttavia, possiamo

comunque osservare che se il probando è o 11 o 22 sarà sicuramente eterozigote per

l’allele malattia. La famiglia è parzialmente informativa perché alcune situazioni possono

essere determinate (l’essere malato 12 o portatore 11;22), altre no (non sappiamo il

linkage allele marcatore-allele malattia nel padre e nella madre). Inoltre, se il probando

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risulta essere 12 non è detto che sia necessariamente malato, anzi potrebbe essere

perfettamente sano. Infatti, se ammettessimo che l’1 (associato all’allele D) l’abbia

ereditato dal padre e il 2 (associato all’allele D) dalla madre, lui sarebbe genotipicamente

12 (quindi come il fratello malato per quanto riguarda l’allele marcatore) ma anche DD

(diversamente dal fratello che è omozigote recessivo, in quanto manifesta la malattia). In

tutto questo casino, ci viene in soccorso la famiglia: se il probando è 11 o 22 sarà

certamente portatore (da tutto questo stiamo omettendo le ricombinazioni).

In questo altro esempio viene

mostrata la genotipizzazione del

marcatore (MetH, distante dal gene

malattia (CF = Fibrosi Cistica) circa

1Mb). Come si vede, il genotipo del

padre è 12 e (dopo aver fatto PCR e

digerito con l’enzima di restrizione) in

elettroforesi appaiono due bande

dove una banda rappresenta

l’amplificato non tagliato e l’altra (in

realtà sono due piccole bandine

sovrapposte parzialmente)

rappresenta l’amplificato tagliato.

Pertanto, abbiamo a che fare con due alleli (eterozigote per il marcatore); la madre invece

mostra una sola banda, quella dell’amplificato non tagliato, quindi è omozigote 11; il figlio

affetto da fibrosi cistica è come la madre, per cui è omozigote 11; il probando ha la stessa

situazione del padre, per cui il genotipo è 12; C è il controllo che si fa per vedere se

+

l’enzima di restrizione taglia. La famiglia è parzialmente informativa perché non sappiamo

se l’allele 1 che la madre trasmette al probando è associato all’allele recessivo per il gene

malattia oppure è associato all’allele dominante per il gene malattia. Quindi, non sappiamo

se il nascituro è portatore o sano. Sappiamo però con certezza che non è malato (stiamo

escludendo l’eventualità di una ricombinazione). In quest’altro esempio abbiamo

come marcatore Xv-2c, vicino al

gene malattia (CF = Fibrosi

Cistica) circa 200 kb. Il gel in

questo caso è molto più pulito, le

due bandine infatti si distinguono

molto bene. In questa situazione,

sia la madre sia il padre hanno

genotipo 12 per quanto riguarda il

marcatore; il figlio affetto è 12. In

questo stato non possiamo fare

un’associazione né del padre né

della madre (la trasmissione è 1p e

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2m oppure 1m e 2p, dove p = padre e m = madre). La famiglia nel suo insieme non è

informativa, tuttavia i risultati del probando ci dicono che è omozigote 11, quindi possiamo

almeno ricavarne che costui sarà probabilmente portatore (nella peggiore delle ipotesi).

A questo punto dobbiamo chiarire alcuni concetti:

Per Aplotipo si intende una particolare associazione fra gene e marcatore. Ad

- esempio D1 (sullo stesso filamento) è un aplotipo, nel senso che sono in

associazione su un singolo cromosoma, quindi in una condizione aploide. d

associato a 2 è un altro aplotipo (d2); potremmo avere pure D associato a 2 o d

associato a 1. Ogni associazione su un singolo cromosoma fra due alleli (allele

marcatore e allele gene malattia) è un aplotipo.

Linkage Disequilibrium (LD): Si fa il LD quando in una data popolazione l’allele

- malattia è sempre associato con uno specifico allele marcatore. Un caso di LD è

quello che riguarda l’anemia falciforme in Sicilia: è stato dimostrato che la

mutazione che provoca l’anemia falciforme in Sicilia proviene dalla Costa D’Avorio.

In Sicilia è passato non solo l’aplotipo (attraverso la deportazione) ma anche tutti gli

altri marcatori associati, attraverso cui scopriamo se c’è il gene mutato

nell’individuo. Basta identificare l’allele marcatore per dire ad occhi chiusi che c’è

anche la malattia. Se noi facciamo la stessa indagine in Costa D’Avorio, scopriamo

che le cose non stanno così. Troviamo invece che lì c’è il linkage equilibrium.

Linkage Equilibrium (LE): In questo caso, alla mutazione nel gene malattia

- possono essere associati diversi alleli marcatori. In Sicilia c’è un alto tasso di

anemia falciforme perché la condizione di eterozigote dava un certo vantaggio

selettivo nei confronti dell’infezione della malaria. E’ successo che l’allele che

portava il gene mutato è stato selezionato positivamente (si è conservato nelle

generazioni) e naturalmente vicino a lui si sono conservati tutti i marcatori associati;

di contro, tutti gli alleli che non avevano associato il gene malattia (con allele

mutato) si sono persi, perché non avevano la selezione favorevole. Pertanto, in

Costa D’Avorio troviamo tutti gli aplotipi possibili. Man mano che si sale verso la

Sicilia (dove c’è la malaria) si trovano soltanto quegli aplotipi che hanno invece il

vantaggio selettivo.

Il LE è una situazione bilanciata in cui sono presenti vari aplotipi per due (o più) alleli

in maniera più o meno omogenea (tant’è vero che “equilibrium” vuol dire situazione

bilanciata). Quando si verificano casi di deriva genetica, migrazione o selezione, si

determina piuttosto una situazione di LD, nel senso che tra tutti gli aplotipi possibili ne

vengono selezionati alcune in particolare. Questa non è una situazione stabile perché i

due loci, prima o poi, andranno incontro a ricombinazione e la situazione si riequilibra

(tostu poi ca prima). Infatti questa situazione viene indicata “disequilibrium” proprio per

il fatto di essere anomala. Il LD indica quindi una situazione instabile dal punto di vista

della popolazione. 75


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
A.A.: 2010-2011

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Novadelia di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Genetica molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università La Sapienza - Uniroma1 o del prof Bozzoni Irene.

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