Genetica molecolare - Sbobinatura

Analisi dei casi familiari

Nel secondo caso assistiamo ad una famiglia pienamente informativa: i genitori sono eterozigoti sia per quanto riguarda l'allele malattia sia per quanto riguarda il marcatore. Poiché i genitori hanno già un figlio affetto che è 11, noi capiamo perfettamente che l'allele malattia è in associazione con l'allele 1 sia nel padre sia nella madre. Di conseguenza, quando genotipizziamo il probando possiamo ipotizzare dei risultati; per esempio, se è omozigote 1 sarà probabilmente affetto (ammesso che non ci sia ricombinazione); se è eterozigote 12 è sano (sempre ammesso che non ci sia ricombinazione); se è 22 è sano (ammesso che non ci sia ricombinazione; ma è chiaro che sarebbe affetto pur essendo 22 solo se avranno ricombinato sia il padre sia la madre e questa coincidenza è più difficile).

Nel terzo caso la famiglia è parzialmente informativa: i genitori sono entrambi doppi eterozigoti.

Il figlio è omozigote per l'allele malattia ed eterozigote per l'allele marcatore. Perché sia malato, il probando dovrà prendere o l'1 dal padre (l'1 nel padre è associato al gene malattia?) e il 2 dalla madre (il 2 nella madre è associato al gene malattia?) oppure il 2 dal padre (il 2 nel padre è associato al gene malattia?) e l'1 dalla madre (l'1 nella madre è associato al gene malattia?). Abbiamo un certo grado di incertezza. Tuttavia, possiamo comunque osservare che se il probando è o 11 o 22 sarà sicuramente eterozigote per l'allele malattia. La famiglia è parzialmente informativa perché alcune situazioni possono essere determinate (l'essere malato 12 o portatore 11;22), altre no (non sappiamo il link allele marcatore-allele malattia nel padre e nella madre). Inoltre, se il probando risulta essere 12 non è detto che.

Sia necessariamente malato, anzi potrebbe essere perfettamente sano. Infatti, se ammettessimo che l'1 (associato all'allele D) l'abbia ereditato dal padre e il 2 (associato all'allele D) dalla madre, lui sarebbe genotipicamente 12 (quindi come il fratello malato per quanto riguarda l'allele marcatore) ma anche DD (diversamente dal fratello che è omozigote recessivo, in quanto manifesta la malattia). In tutto questo casino, ci viene in soccorso la famiglia: se il probando è 11 o 22 sarà certamente portatore (da tutto questo stiamo omettendo le ricombinazioni).

In questo altro esempio viene mostrata la genotipizzazione del marcatore (MetH, distante dal gene malattia (CF = Fibrosi Cistica) circa 1Mb). Come si vede, il genotipo del padre è 12 e (dopo aver fatto PCR e digerito con l'enzima di restrizione) in elettroforesi appaiono due bande dove una banda rappresenta l'amplificato non tagliato e l'altra (in realtà sono due) rappresenta l'amplificato tagliato.

piccole bandine sovrapposte parzialmente) rappresenta l'amplificato tagliato. Pertanto, abbiamo a che fare con due alleli (eterozigote per il marcatore); la madre invece mostra una sola banda, quella dell'amplificato non tagliato, quindi è omozigote 11; il figlio affetto da fibrosi cistica è come la madre, per cui è omozigote 11; il probando ha la stessa situazione del padre, per cui il genotipo è 12; C'è il controllo che si fa per vedere se l'enzima di restrizione taglia. La famiglia è parzialmente informativa perché non sappiamo se l'allele 1 che la madre trasmette al probando è associato all'allele recessivo per il gene malattia oppure è associato all'allele dominante per il gene malattia. Quindi, non sappiamo se il nascituro è portatore o sano. Sappiamo però con certezza che non è malato (stiamo escludendo l'eventualità di una ricombinazione).

quest’altro esempio abbiamo come marcatore Xv-2c, vicino al gene malattia (CF = Fibrosi Cistica) circa 200 kb. Il gel in questo caso è molto più pulito, le due bandine infatti si distinguono molto bene. In questa situazione, sia la madre sia il padre hanno genotipo 12 per quanto riguarda il marcatore; il figlio affetto è 12. In questo stato non possiamo fare un’associazione né del padre né della madre (la trasmissione è 1p e 2m oppure 1m e 2p, dove p = padre e m = madre). La famiglia nel suo insieme non è informativa, tuttavia i risultati del probando ci dicono che è omozigote 11, quindi possiamo almeno ricavarne che costui sarà probabilmente portatore (nella peggiore delle ipotesi). A questo punto dobbiamo chiarire alcuni concetti: Per Aplotipo si intende una particolare associazione fra gene e marcatore. Ad esempio D1 (sullo stesso filamento) è un aplotipo, nel senso che sono

inassociazione su un singolo cromosoma, quindi in una condizione aploide. dassociato a 2 è un altro aplotipo (d2); potremmo avere pure D associato a 2 o dassociato a 1. Ogni associazione su un singolo cromosoma fra due alleli (allelemarcatore e allele gene malattia) è un aplotipo.

Linkage Disequilibrium (LD): Si fa il LD quando in una data popolazione l'allele- malattia è sempre associato con uno specifico allele marcatore. Un caso di LD èquello che riguarda l'anemia falciforme in Sicilia: è stato dimostrato che lamutazione che provoca l'anemia falciforme in Sicilia proviene dalla Costa D'Avorio.In Sicilia è passato non solo l'aplotipo (attraverso la deportazione) ma anche tutti glialtri marcatori associati, attraverso cui scopriamo se c'è il gene mutatonell'individuo. Basta identificare l'allele marcatore per dire ad occhi chiusi che c'èanche la malattia. Se noi facciamo la

Stessa indagine in Costa D'Avorio, scopriamo che le cose non stanno così. Troviamo invece che là c'è il linkage equilibrium.

Linkage Equilibrium (LE): In questo caso, alla mutazione nel gene malattia possono essere associati diversi alleli marcatori. In Sicilia c'è un alto tasso di anemia falciforme perché la condizione di eterozigote dava un certo vantaggio selettivo nei confronti dell'infezione della malaria. È successo che l'allele che portava il gene mutato è stato selezionato positivamente (si è conservato nelle generazioni) e naturalmente vicino a lui si sono conservati tutti i marcatori associati; di contro, tutti gli alleli che non avevano associato il gene malattia (con allele mutato) si sono persi, perché non avevano la selezione favorevole. Pertanto, in Costa D'Avorio troviamo tutti gli aplotipi possibili. Man mano che si sale verso la Sicilia (dove c'è la malaria) si

trovano soltanto quegli aplotipi che hanno invece il vantaggio selettivo. Il LE è una situazione bilanciata in cui sono presenti vari aplotipi per due (o più) alleli in maniera più o meno omogenea (tant'è vero che "equilibrium" vuol dire situazione bilanciata). Quando si verificano casi di deriva genetica, migrazione o selezione, si determina piuttosto una situazione di LD, nel senso che tra tutti gli aplotipi possibili ne vengono selezionati alcune in particolare. Questa non è una situazione stabile perché i due loci, prima o poi, andranno incontro a ricombinazione e la situazione si riequilibra (tostu poi ca prima). Infatti questa situazione viene indicata "disequilibrium" proprio per il fatto di essere anomala. Il LD indica quindi una situazione instabile dal punto di vista della popolazione. Guardiamo adesso la figura e supponiamo che il locus A corrisponda al gene malattia, mentre

Il locus B al marcatore. Sulla base delle frequenze di Aa e di Bb, noi possiamo prevedere che:

Se ci fosse Linkage equilibrium potremmo avere 49% ; 21% ; 21% ; - 9%. Siccome ogni allele ha la sua frequenza non possiamo pretendere di attenderci 25% in ciascun aplotipo.

Se ci troviamo nella situazione in cui alcuni aplotipi prevalgono sugli altri (60% ; 10% ; 10% ; 20%) siamo di fronte ad un linkage disequilibrium parziale.

Se ci troviamo nella condizione in cui solo due aplotipi sono presenti (70% ; - 30%) e non troviamo gli altri due aplotipi vuol dire che siamo di fronte ad un perfetto linkage disequilibrium. Ci sono alleli che sono associati nettamente in modo preferenziale rispetto a quello che ci si attenderebbe.

Secondo il test d'ipotesi, l'ipotesi zero (cioè l'ipotesi di riferimento) è in questo caso il linkage equilibrium. La situazione limite è il linkage disequilibrium, in cui c'è un'associazione preferenziale tra gli alleli.

Rapporto tra l'ipotesi zero e la situazione limite ci dà l'entità dell'anomalia.

LEZIONE 26/01/09 GENETICA MOLECOLARE

Ammettiamo che l'allele A in seguito ad una mutazione diventi allele C. Questo vuol dire che nella popolazione avremo cromosomi con l'allele A e cromosomi con l'allele C, con le possibili combinazioni genotipiche negli individui (AA, AC, CC). Ammettiamo che in vicinanza del gene che stiamo studiando ci sia G, che naturalmente è presente su entrambi i cromosomi omologhi. Se G muta in C, ci sono due possibilità: o muta sul cromosoma dove c'è A oppure muta sul cromosoma in cui c'è C, ma non contemporaneamente su tutti e due perché la mutazione è un evento assolutamente raro e casuale. Per cui noi abbiamo la mutazione nel locus G, ma possiamo stare sicuri che questa mutazione cadrà solo su uno dei due cromosomi (nell'esempio in figura la mutazione di G è).

ricaduta sul "cromosoma C". I cromosomi A continuano ad avere G. Inoltre, la mutazione non ha colpito tutti i cromosomi C, ma uno solo. Quindi noi avremo il linkage AG (che è quello ancestrale), CG (in cui C deriva dalla mutazione di A) e CC (che si è creato casualmente in terza battuta). Abbiamo tre aplotipi. Questi aplotipi sono inizialmente in linkage disequilibrium, perché si sono generati attraverso mutazioni casuali. Col tempo succede che i tre aplotipi possono ricombinarsi, ma dovremo aspettare tante generazioni. Nell'uomo, ad esempio, la ricombinazione è un evento abbastanza raro. Mediamente nel maschio ne avviene poco meno di una ogni 20 Mb, mentre nella donna può più di una ogni 10 Mb nella donna (c'è anche questa differenza tra uomo e donna). Un evento di ricombinazione potrebbe generare l'aplotipo AC, che si aggiunge agli altri tre. Alla fine avremo AG, CG, CC e AC, di cui alcuni sono ancestrali e altri sono derivati da mutazioni.