Genetica molecolare

LIGAZIONE

Utilizza la DNA ligasi. Passaggio molto importante, perché è l'unione del frammento con il vettore scelto. La DNA ligasi è un enzima chiave nella biologia molecolare, catalizza legami fosfodiesterici tra l'estremità 3'OH libera e 5'P libera di molecole di DNA che possono essere diverse (intermolecolari come nel caso del clonaggio oppure all'interno della stessa molecola (intramolecolare); in questo caso la ligasi può catalizzare anche la chiusura di tagli a singolo filamento (nicks). La DNA ligasi più utilizzata in laboratorio è codificata dal fago T4, è un enzima ATP-dipendente, quindi c'è bisogno di dare ATP durante la reazione, può legare sia estremità steaky che, con minore efficienza le blunt. Le ligazioni blunt si fanno di meno perché sono meno efficienti. Reazione che catalizza la DNA ligasi: la ligasi interagisce con l'ATP formando un complesso.

realtà il rapportotipico è sempre più alto (10:1). Quando le ligazioni non si sono mai fatte, si fanno sempre conpiù rapporti (1:1, 3:1, 10:1→ tre prove e vado avanti con l’esperimento con tutte e tre leligazioni). La BM non è una scienza esatta. Quando si fanno questi clonaggi si usa sempreuna molecola circolare perché ha più possibilità di entrare all’interno della cellula perché nonha cariche libere (gruppi liberi), invece una molecola linearizzata ha più difficoltà. Il dettagliodella ligazione è che non sempre si formano i prodotti che voglio, ad esempio la formazionedel concatamero, quindi una serie di frammenti che si appaiano tra loro (questo è un altromotivo per cui si fa un rapporto diverso dall’1:1 perché molti dei frammenti vanno persi vistoche fanno un concatamero, questo perché essendo piccoli è più probabile che si incontrino

traloro piuttosto che incontrare il vettore); oppure si forma il vettore chiuso (senza frammento).

Come si può fare per evitare che il vettore si chiuda? C'è una tecnica basata sull'utilizzo dellafosfatasi alcalina (un enzima) che catalizza la rimozione dei gruppi P al 5' di un frammento edi un vettore aperto. Un vettore aperto ha dei gruppi P al 5' e dei gruppi OH al 3', se iorimuovo i gruppi fosfato, non può avvenire la reazione. Una volta che ho tagliato il mio vettorecon l'enzima di restrizione che mi interessa, non faccio altro che incubare con la fosfatasialcalina che rimuove i gruppi fosfato. Se usassi la ligasi non avrei alcuna reazione, ma seusassi il frammento che ha i gruppi P potrebbero avvenire almeno due reazioni: quelle in cuiil fosfato può essere accettore di AMP e a questo punto la ligasi chiude i nick (cioè i tagliettiss che avvengono anche casualmente in una sequenza di DNA); quindi, una volta che

DNApolimerasi I di E. Coli priva dell'attività esonucleolitica 5'→3', tale enzima è utilizzato per sintetizzare un filamento di DNA a partire dal suo complementare e richiede:

• Un filamento che funga da stampo
• Un oligonucleotide che funga da innesco

TRASFORMAZIONE (inserimento di DNA nella cellula ricevente)

Introduzione di DNA eterologo in una cellula ospite viva capace di replicarlo. L'efficienza di questo passaggio è cruciale per garantire il successo di qualunque clonaggio. Per trasformazione si intende il trasferimento di DNA in cellule batteriche, mentre per infezione il trasferimento genico mediato da batteriofagi o virus.

OSPI

• coltura
• METODI DI INSERIMENTO DI DNA ESOGENO

CARATTERISTICHE: Elevata efficienza; Bassa tossicità; Riproducibilità in vitro e in vivo

PROBLEMATICHE: Come superare le barriere naturali? DNA: fortemente polare (carica negativa); membrana cellulare lipofila.

METODI CHIMICI

1. CaCl2→ Gli ioni bivalenti formano un ponte tra DNA e LPS batterico. HEATSHOCK: rende la membrana più permeabile. PROTOCOLLO: Scongelare in ghiaccio un' aliquota di cellule competenti (circa 100 microl); +DNA (100 ng) in ghiaccio 30min; Heat Shock: 42°C per 45 seconds, Ice 2 min; Centrifugare e risospendere in LB per 60 min. Vantaggi: economico e relativamente versatile
2. Calcio fosfato (cellule di mammifero in monostrato)→ Il DNA a contatto con una soluzione di fosfato di calcio forma dei precipitati i quali, con un meccanismo poco noto (probabilmente per endocitosi) entrano nelle cellule. Vantaggi: economico e relativamente versatile; svantaggi: tecnicamente delicato (forma e dimensioni del precipitato,

influenzato da variazioni anche minime di pH), efficienza bassa, elevatacitotossicità, non funziona con alcuni tipi cellulariil primo metodo usato per l'introduzione di DNA nelle cellule

3. DEAE-DESTRANO→eucariote. DESTRANO: Polisaccaride costituito da unità di D-glucosio legatemediante legami di tipo alfa1/4 o alfa1/6. Quando viene associato a gruppi carichipositivamente (DEAE dietilamminoetile) è in grado di legare il DNA e di mediarnel'ingresso attraverso le membrane. VANTAGGI: Molto semplice; SVANTAGGI:Molto poco efficiente, Solo transfezioni transienti

4. LIPOSOMI→ misto di lipidi policationici e neutri, permette la formazione di vescicoleliposomiali unilamellari che portano una carica netta positiva. La testa cationica delcomposto lipidico si associa ai gruppi P negativi dell'acido nucleico. I complessi lipidi-DNA si fondono con le membrane cellulari e rilasciano spontaneamente il lorocontenuto nelle cellule. VANTAGGI: Bassa tossicità.

• SVANTAGGI: Difficile produrre liposomi, Alta variabilità.

METODI FISICI

1. Elettroporazione→ Le cellule vengono poste in una soluzione contenente DNA, e vengono esposte ad un breve impulso elettrico che produce transitoriamente dei pori nelle loro membrane.
• VANTAGGI: Può essere utile per quei tipi cellulari in cui non si ottengono risultati con i metodi classici. Il DNA entra direttamente senza passare attraverso il compartimento endosomiale dove può aver luogo la degradazione dell'acido nucleico.
• SVANTAGGI: Necessità di ottimizzare le condizioni del campo elettrico - intensità e durata - Elevato livello di tossicità (50%).
2. Microiniezione→ il DNA viene inserito nella cellula - nel citoplasma o nel nucleo - attraverso un capillare di vetro, con un sistema ad alta pressione. Date le ridotte dimensioni delle cellule (alcune decine di micron di diametro) la microiniezione richiede una sofisticata apparecchiatura che comprende: un microscopio, un micromanipolatore,

Un iniettore

VANTAGGI: effettuare il trasferimento selettivamente nel citoplasma o nel nucleo, aumenta efficienza di espressione, modulare facilmente il livello di espressione.

SVANTAGGI: Tecnicamente impegnativa, Poche cellule alla volta, COSTOSO.

Gene gun

Rivestiti di DNA sulla parete interna di una cartuccia di plastica direttamente sul bersaglio.

VANTAGGI: Possibilità di lavorare in situ, Applicabile a quei sistemi cellulari poco responsivi ad altri carrier per il trasferimento genico anche in vivo; Possibilità di fare studi di espressione genica in condizioni fisiologiche: espressioni tessuto specifiche, studi sullo sviluppo; Possibilità di usare meno DNA e meno cellule di partenza.

SVANTAGGI: Trattamento invasivo, Efficienza fortemente dipendente dal tipo cellulare; Molti parametri da controllare; COSTOSO

PIASTRAMENTO (crescita in terreno selettivo)

Permette di selezionare le cellule che

FRAMMENTO ALL'INTERNO DI UN VETTORE: STRATEGI