Genetica molecolare

Genetica molecolare

Analisi della struttura dei genomi

Un genoma semplice è un genoma che si maneggia bene: è corto, si sequenzia facilmente e possiamo capire bene sia le funzioni che la struttura. Un genoma complesso è molto lungo e ha parecchio del suo contenuto ripetuto. All'interno della cellula, fatto da più molecole, umana troviamo 25 molecole diverse di DNA:

• 1 molecola di DNA mitocondriale
• 24 diverse molecole di DNA genomico (genoma nucleare)

Il sequenziamento completo del genoma mitocondriale risale al 1981. Il genoma mitocondriale è piccolo (16,6Kb), è presente in molte copie per cellula (perché i mitocondri sono presenti in molteplici copie all'interno della cellula) e dipende da che tipo di cellula si tratta (alcuni tipi di cellule che hanno bisogno di più energia rispetto a cellule che sono stabili e silenti). È 1/200.000 millesimo del genoma nucleare che è circa 3,2Gb. Il genoma mitocondriale è circolare e fornisce un vantaggio notevole perché essendo piccolo è semplice da inserirlo in vettori (vettori di clonaggio → generare parecchie copie di questo DNA che ci servono per facilitare gli studi di sequenziamento).

Se il genoma è circolare, quando io inizio a sequenziare da un punto e continuo, ad un certo punto mi ritroverò all'inizio, quindi so da dove parto e so qual è il punto finale perché, ad un certo punto, avrò una sequenza finale che si sovrappone a quella iniziale. Quando sequenzio un genoma lineare, so da dove comincio, finisco ad un certo punto, ma il resto, come faccio a sequenziarlo? Nel caso di un cromosoma non posso saperlo anche perché se ne inizio a sequenziare le estremità, ci sono un sacco di problemi; infatti queste sono composte da DNA ripetuto e quando c'è una ripetizione, spesso i meccanismi di sequenziamento fanno un sacco di errori (così come succede per i meccanismi di replicazione).

Sequenziamento del genoma nucleare

Sono stati inventati degli escamotage per sequenziare il genoma nucleare che ora è stato sequenziato del tutto sebbene ci siano delle zone che ancora restano nell'ombra a causa di problematiche tecniche dovute all'estrema ripetibilità di alcune parti. La maggior parte del genoma umano, però, è stato mappato e sequenziato. Agli inizi degli anni '80 si era ben lontani dall'averlo fatto. Uno degli escamotage per riuscire a sequenziare il genoma nucleare è stato quello di costruire una mappa genomica.

Che cos'è? È una mappa, un disegno schematico che contiene l'ordine dei locus genetici o di specifici marcatori e la distanza compresa tra loro su ciascun cromosoma. Se io ho un cromosoma di lunghezza X e riesco a metterci sopra un sacco di bandierine riesco ad avere una mappa. Anche se non l'ho sequenziato ho un'idea di quale sia la sua struttura e di quali possono essere i markers che possono permettere di ancorarci delle sequenze. Più marcatori ci sono e più sono vicini fra sé e più definita diventa la mappa. Le mappe possono essere divise in genetiche e fisiche a seconda dei metodi usati per costruirle e della unità di misura adoperate per valutare la distanza tra due marcatori.

La mappa fisica viene fatta guardando proprio il cromosoma ed io posso dire che su questo cromosoma, a quest'altezza, c'è una banda larga tot. La stessa cosa succede per i cromosomi umani riuscendo a marcare in maniera fluorescente particolari sequenze in determinati cromosomi. Molto diverso è per quanto riguarda la mappa genetica che si basa sulla presenza (per quanto riguarda l'uomo, questo studio viene fatto a partire da una malattia).

Ho una malattia che so che è determinata da una specifica mutazione in un determinato gene → studio la malattia → applico una serie di tecniche → localizzo la mutazione (metto la bandierina → metto il marker). La definizione di mappa dipende da quante malattie riesco a definire all'interno del cromosoma. Queste due mappe vengono messe insieme e grazie a questo posso fare una mappatura dell'intero genoma (più definite sono le mappe e meglio è).

Mappe genetiche

Possiamo farle per linkage o tramite l'utilizzo di markers polimorfici.

Mappe genetiche per linkage:

• Mappe costruite mediante associazione genetica, determinando la frequenza con cui due marcatori sintenici (ossia associati e quindi localizzati sullo stesso cromosoma) sono ereditati insieme
• Non è necessario conoscere la localizzazione sul cromosoma dei markers studiati, in quanto nella costruzione di queste mappe si cerca di svelare l'associazione tra due o più locus.
• Le mappe di riferimento sono costruite sulla base della vicinanza dei vari geni sui cromosomi che determinano fenotipi mutanti
• Se le mutazioni vengono ereditate insieme si suppone che si trovino vicine nel genoma
• La frequenza di ricombinazione dà una stima della vicinanza dei due geni
• Locus che sono molto vicini sul cromosoma hanno una probabilità maggiore di essere ereditati insieme rispetto a loci distanti.

L'utilizzo di markers polimorfici:

• Affinché un marker possa essere usato per costruire mappe genetiche, deve essere preferenzialmente polimorfico.
• Qualsiasi caratteristica fisica o molecolare ereditata nella progenie e che differisce tra gli individui di una popolazione e che abbia una frequenza superiore all'1% è un potenziale marker genetico.
• I markers possono essere o regioni di DNA esprimibili o segmenti di DNA anonimi dei quali non si conosce niente

Mappe fisiche

Suddivise in:

• Alta risoluzione
• Bassa risoluzione

A bassa risoluzione:

Tecnica degli ibridi cellulari. Cellule somatiche ibride interspecifiche derivano dalla fusione di cellule provenienti da specie differenti. Gli ibridi più usati per la mappatura derivano dalla fusione di cellule umane e di roditore, comunemente topo o hamster, indotta da sostanze chimiche, come il polietilenglicole, in grado di creare dei pori a livello della membrana plasmatica. Le cellule ibride che inizialmente tendono a perdere in maniera casuale e progressiva cromosomi umani, in seguito si stabilizzano fino a contenere il set cromosomico del roditore e il cromosoma umano che assicura un vantaggio selettivo all'ibrido, insieme a cromosomi ritenuti casualmente.

Ibridazione in situ. Permette di localizzare direttamente una sonda, marcata in modo non radioattivo, sulla corrispondente regione cromosomica.

Mappe ad alta risoluzione:

Collezione di frammenti clonati di DNA provenienti da un intero cromosoma o parti di esso (genoteche totali o parziali). Analisi per elettroforesi di frammenti di DNA ottenuti mediante digestione con enzimi di restrizione "rare cutter" che producono macroframmenti.

Costruzione della mappa fisica ad alta risoluzione

1. Avere a disposizione frammenti di DNA, precedentemente isolati e inseriti in vettori di clonaggio
2. I cloni ricombinanti sono successivamente ordinati nelle loro rispettive localizzazioni sul cromosoma
3. Determinare la sequenza di basi di ciascun frammento ordinato

Genoteca a DNA

Come si fa ad ottenerla? La tecnica del clonaggio è alla base della generazione di genoteche. Innanzitutto, consideriamo che abbiamo delle cellule nucleate, ogni cellula contiene un nucleo e ogni nucleo conterrà una copia di un cromosoma. Se io facessi una lisi di un mix di cellule nucleate otterrò parecchie copie. Mettiamo che abbiamo 4 cromosomi o, ci sono delle sequenze che vengono riconosciute dagli enzimi di restrizione, enzimi che riconoscono specifiche sequenze e tagliano lì precisamente. Se io prendo l'enzima di restrizione e questo ci faccio tagliare questo mix di molecole, se ce lo tengo indefinitamente l'enzima di restrizione li taglierà tutti; io lo tengo un po', l'enzima taglierà a caso, cioè taglia fin dove riesce a tagliare, poi io blocco la reazione e quindi mi taglia in pochi punti.

Che succede? Che le varie molecole verranno tagliate a caso e quindi avrò la generazione di frammenti di lunghezza diversa e li avrò tutti mescolati nella mia provetta. Se io volessi fare una sequenza a questo punto non avrei alcun tipo di risultato. Allora come si fa? La cosa fondamentale è quella di riuscire a separare ognuno di questi frammenti in maniera univoca, cioè io so che ho solo quel frammento lì. Per separare i frammenti li inserisco in vettori di clonaggio. Normalmente il vettore è circolare. Se io prendo un frammento tagliato con enzimi di restrizione, io conosco le sue estremità; se io prendo un vettore circolare e lo taglio con quell'enzima di restrizione anche il vettore avrà quelle due estremità (utilizzo lo stesso enzima di restrizione). A quel punto li faccio legare, cioè faccio una reazione enzimatica per cui il frammento entra all'interno del vettore. Il successo del clonaggio è il fatto che un vettore prende quasi sempre un solo frammento. I vettori vengono inseriti all'interno di cellule che sono in grado di trasportare e far replicare questo vettore. Normalmente sono cellule batteriche, però ci sono anche altri tipi di cellule, anche eucariotiche. Ogni singola cellula batterica deve prendere un solo vettore e statisticamente questo succede, infatti è improbabile che una cellula batterica si prende due vettori perché già l'evento di inserimento è raro, figuriamoci se ne prende due. Una volta che la mia cellula batterica ha preso il vettore, si replicherà in molteplici copie e non solo, se io spero nella maniera giusta, farò in modo di avere una serie di colonie che potrebbero contenere un clone, cioè una cellula batterica che si è divisa n-volte e contiene all'interno n-molecole di questo vettore contenente il frammento. Ognuna di quelle piccole colonie conterrà uno dei frammenti. Ognuno di questi cloni, poi, va sequenziato.

Quindi il primo approccio per sequenziare il DNA nucleare è tramite genoteche a DNA. Il problema è che io non so quali frammenti ci sta nei batteri, come lo faccio a sapere? Mettiamo che io prenda una colonia qualunque, prendo il DNA e lo sequenzio, ottengo ad esempio la sequenza del frammento 1, come faccio a sapere dove sta? Bo! Allora faccio la sequenza del frammento 2, anche quello non so dove sta; faccio la sequenza del frammento 3 e poi del frammento 4 e questi comunque non sono in ordine (anche perché è da considerare che le loro estremità sono tutte uguali → hanno lo stesso sito di restrizione). Ma andando avanti con il sequenziamento, prima o poi mi ritroverò una sequenza identica al frammento 1 e al frammento 2. Questo è stato il modo attraverso il quale è stato possibile riordinare i diversi frammenti e ci ha permesso di ordinare le varie sequenze e capire come fossero fatte. Si sta parlando di frammenti di cromosomi. Il sequenziamento fatto in questo modo si chiama whole genome shotgun sequencing (un modo da sequenziare un po' a caso).

Ora, come inserisco il concetto di markers? Se io faccio un sequenziamento e uno dei miei frammenti contiene una sequenza unica che io so che deve stare, per esempio, a metà del cromosoma 1, io posso fare l'ancoraggio, cioè lo posiziono esattamente. Se io riesco a fare questo sequenziamento gerarchico (un sequenziamento 5'→3') e riesco a trovare dei marcatori, riesco ad identificare i pezzettini di sequenza. Questo si da solamente se si ottengono dei frammenti relativamente piccoli. Allora per fare il sequenziamento del DNA umano si è aggiunto un altro passaggio: la generazione del contig di cloni contenenti grandi inserti. Che cosa è stato fatto? Per prima cosa è stato fatto il sequenziamento gerarchico di vari cloni contenenti grandi inserti. È stato necessario trovare dei vettori che potessero contenere grandi inserti, infatti, se io prendessi un plasmide e ci volessi infilare un frammento di 20.000pb non lo riesco a fare, ma bisogna ottenere dei vettori molto più grandi e inserirli ovviamente non in una cellula batterica, ma in cellule quasi sempre di lievito (cioè cellule più grandi eucariotiche). Una volta superato il problema dei vettori, si è potuto fare il contig di cloni, quindi generazione di colonie contenenti il frammento, stavolta più grande, che viene sequenziato; solitamente ne vengono sequenziate le estremità e se ne fa un ordine gerarchico. A quel punto, ognuno di questi cloni viene frammentato di nuovo e nella fase successiva ogni frammento viene inserito in vettori di dimensioni più piccoli, sequenziati e ancorati.

Quindi, cos'è il contig di cloni? È una serie di cloni in cui gli inserti si sovrappongono parzialmente all'estremità di quelli adiacenti e rappresenta una sequenza continua di DNA di un cromosoma o parte di esso. Come si fa a fare? In pratica, consideriamo che io ho una serie di frammenti tagliati in maniera casuale, ottenuti con la tecnica dell'incubazione con enzimi di restrizione che tagliano in maniera non completa (quindi dei frammenti casuali); alcuni di questi possono essere sovrapponibili e questo mi aiuta a metterli uno dopo l'altro, però i frammenti sono troppo grandi. Allora come si fa? Si prende uno dei tanti frammenti, si fa un sub-clonaggio della parte finale (in pratica se ne prende un pezzo e si clona inserendolo in vettori), si sequenzia e si costruisce una sonda sulla base di questa sequenza. Questa sonda si utilizza per saggiare tutte le copie che ho a disposizione, dove vedo il segnale avrò dei frammenti che contengono una sequenza uguale alla sonda. A questo punto so che nel clone dove c'è il segnale avrò cloni che hanno una sequenza che sta a valle rispetto al frammento (questa tecnica si chiama chromosome walking). È una tecnica abbastanza complicata e lunga perché chiaramente ognuno dei grossi frammenti è usato per generare delle sonde; però è un metodo che ci permette in maniera molto efficiente di ordinare i vari cloni.

I markers quindi rappresentano delle sequenze uniche, generalmente brevi, e vengono chiaramente localizzati nel genoma umano.

• Sequenze polimorfiche che vengono individuate tramite saggi specifici
• Sequenze uniche che possono essere saggiate tramite PCR

Marcatore di DNA

Polimorfico:

• Rflp (Restriction fragment length polymorphism → un polimorfismo, cioè mutazioni con frequenza maggiore dell'1% del genoma umano che porta alla perdita o all'acquisizione di un sito di restrizione; quindi se io allestisco una PCR utilizzando un primer che riconosce una sequenza che dovrebbe contenere un Rflp posso chiaramente localizzare lui e le sequenze adiacenti all'interno del genoma umano
• Microsatelliti → sequenze che contengono per lo meno 10 ripetizioni in tandem di un motivo che va da 1 a max 4 nucleotidi
• SNP (polimorfismo a singolo nucleotide) → cambiamento di un singolo nucleotide, anche questo spesso associato a malattie

Non polimorfico (non molto facilmente inducibile tramite PCR):

• Sequence-tagged site (STS) → sequenze di DNA uniche, in una precisa posizione nei cromosomi, può essere saggiata tramite PCR perché se io ci costruisco primers specifici posso poi andare ad analizzare le sequenze vicine
• Expressed sequence tag (EST) → cioè una STS che si trova all'interno di sequenze espresse, cioè di sequenze che vengono trascritte

Normalmente le sequenze marcatrici si localizzano in un punto preciso del cromosoma e tramite ibridazione in situ si determina la sua esatta posizione e la sua unicità (in pratica, io costruisco delle sonde che si basano su questa sequenza precisa e le faccio ibridare al mio genoma, sui miei cromosomi, e a quel punto vedo di preciso dove si trovano).

Progetto genoma umano

Nasce negli anni '80 grazie ad un Consorzio Internazionale per il sequenziamento del genoma umano, costituito da una ventina di centri di ricerca con poteri di calcolo enormi e affiancati da molti piccoli laboratori nel mondo specializzati nella mappatura e nella caratterizzazione dei geni malattia.

Obiettivi:

• Il completamento di una mappa genetica ad alta risoluzione del genoma umano
• Il completamento di una serie di mappe fisiche ad alta risoluzione di tutti i cromosomi umani
• Acquisizione di una collezione di cloni di DNA ordinati che coprano l'intero genoma
• Determinazione della sequenza nucleotidica completa di un genoma di riferimento
• Determinazione della sequenza nucleotidica completa del genoma umano
• Mappatura di tutti i geni

Cioè non è solo la sequenza, ma anche capire dove sono i geni e tutte le caratteristiche associate ad essi. In realtà il consorzio non si prefiggeva solo lo studio del genoma umano, ma anche lo studio di altri genomi di riferimento quali E. Coli, C. elegans, Drosophila Melanogaster e il topo, che tra tutti è il genoma più vicino a quello umano.

Tappe del sequenziamento del DNA umano

1. Mappe genetiche di singoli cromosomi, inizialmente con risoluzione molto bassa → nel 1987 vengono fuori le prime mappe genetiche complete basate su RFLP. RFLP è un polimorfismo che determina la perdita o l'acquisizione di un sito di restrizione. Se io ho un allele in cui c'è una mutazione e io perdo questo sito di restrizione, questo taglio non avviene e io otterrò solo un unico frammento. Questi tipi di mutazioni sono polimorfismi quando ovviamente hanno una frequenza superiore all'1%, non è che io posso considerare questo tipo di mutazione come markers a caso, ma devono avere una certa frequenza. Si possono saggiare con PCR, per esempio utilizzando dei primers che amplificano del