Genetica molecolare - 237 pagine

Antiga Alessia 2017 - Genetica molecolare

Organizzazione del genoma umano

I geni contengono l’informazione. Le malattie genetiche originano da alterazioni nell’informazione o nel modo in cui viene utilizzata. I tumori possono essere malattie genetiche acquisite.

Struttura di un gene

Dogma centrale della biologia molecolare: trascrizione + splicing e maturazione + traduzione + modificazioni post-traduzionali (la variazione può avvenire a livello di uno qualsiasi di questi processi).

Sintesi RNA

Promotore: azione in cis. Fattori di trascrizione: azione in trans (geni si trovano altrove). Box. Enhancer e silencer.

Espressione genica differenziale

• Geni costitutivi (housekeeping).
• Geni tessuto-specifici.

Struttura della cromatina

• Eterocromatina
• Eucromatina

Processamento RNA

• Capping.
• Poliadenilazione.
• Splicing: importanti sequenze. Mutazione a livello delle sequenze adiacenti agli introni, coinvolte nello splicing, causa l’aberrazione o il salto dello splicing.

Ingrandimento delle sequenze con dimensione lettere in base alla frequenza della base. Altre mutazioni che alterano lo splicing, possono non essere a livello dei dinucleotidi, ma di altre sequenze adiacenti.

mRNA maturo: porzione codificante + codoni inizio e stop + regioni non tradotte 5’ e 3’ (stabilità, legame ribosomi) + possibile sequenza Kozak (consenso per migliorare traduzione).

Traduzione

Sequenze Kozak. tRNA. Codice genetico. Codice genetico mitocondriale.

Modificazioni post-traduzionali

Genoma umano

• Genoma nucleare.
• Genoma mitocondriale. Quasi tutto estremamente conservato, tranne regione loop regolatoria.

ESOMA = analisi porzione codificante del genoma.

Geni ad RNA

Classi di RNA

DNA codificante

• Usato per produrre mRNA (polipeptidi) e trascritti ad RNA non codificanti (geni ad RNA).
• Sequenze codificanti spesso appartengono a famiglie di sequenze correlate (famiglie geniche) che possono essere organizzate in clusters o disperse.
• Sequenze duplicate hanno avuto origine sa vari eventi di duplicazione genica durante l’evoluzione.
• Questi stessi meccanismi danno origine a sequenze gene-correlate, non funzionali (pseudogeni e frammenti genici), circa 20,000 per genoma, aumentano sempre più.

Duplicazione genica

• Durante la meiosi, per crossing over diseguale (tempi evoluti lunghi), si originano cromosomi con 2 copie di un determinato gene e cromosomi senza alcuna copia di quel gene.
• Può avvenire ricombinazione tra corte sequenze di DNA ripetute (es. ripetizioni Alu), in tandem o intersperse (trasposoni).

Può avvenire:

• Mantenimento della stessa funzione: in presenza di una pressione selettiva.
• Acquisizione di nuove funzioni.
• Perdita di funzionalità.

DNA non codificante

Una ampia parte del genoma umano consiste di sequenze di DNA ripetitive, non codificanti:

• Ripetute in tandem:
  • 6,5% (200 Mb).
  • Blocchi di ripetizioni in tandem di sequenze semplici (110 nt) o più o meno complesse (10→ 100 nt).
  • Ripetizioni testa-coda.
  • Eterocromatina.
  • No geni.
• Ripetute intersperse:
  • 45%.
  • Derivano da elementi trasponibili (trasposoni).
  • Classificazione secondo modalità di trasposizione:
    • Trasposizione: trasposizione conservativa.
    • Retrotrasposizione: trasposizione duplicativa.

    Es. LINES, SINES, elementi simil-retrovirus.

L’eterocromatina contiene DNA satellite (altamente ripetitivo, non conservato, trascrizionalmente inattivo), classificato secondo dimensioni:

Satellite

• Blocchi grandi (100 kb, numerosi Mb).
• Le unità ripetitive possono essere semplici o moderatamente complesse.
• Maggior parte dell’eterocromatina. (es. pericentromerico).
• Composizione delle basi può essere diversa dalla totalità del DNA ed è possibile distinguere tre tipi di DNA satellite, secondo gradiente di densità: I, II, III.
• Satellite alpha: unità ripetuta di 171 pb (htc centromerico).
• Importante ruolo nelle funzioni centromeriche (proteina CENP-B).

Organizzazione DNA satellite al centromero

• Mini satellite:
  • Blocchi medi (0,1-20 kb), di unità ripetute di 9-64 pb.
  • Normalmente non trascritto.
  • Vicini ai telomeri (3-20 kb di ripetizioni di 6 nt TTAGGG, aggiunte dalla telomerasi).
  • Minisatelliti ipervariabili: altamente polimorfici, organizzati in >1000 blocchi, spesso vicini ai telomeri, funzione non chiara.
  • Molto utili, per caratterizzazione di singoli loci, usati come marcatori genetici.
  • Es. impronta DNA: una singola sonda di DNA, con la sequenza centrale comune (GGGCAGGAXG) può essere ibridata (Southern blot) simultaneamente a loci di DNA minisatellite multipli su tutti i cromosomi → pattern individuale specifico (es. pratica forense).
• Micro satellite:
  • Sequenze ripetute semplici (SSR).
  • Blocchi piccoli (<100 pb), di ripetizioni di <10 pb semplici, in tandem.
  • Interspersi nel genoma (2% del genoma).
  • I più comuni di 2 nt:
    • CA/TG molto comuni e altamente polimorfi.
    • AG/CT e AT/TA molto comuni.
    • CG/GC molto rari.

    Ma anche di singolo nucleotide o di 3 o di 4. Funzione poco chiara. Normalmente dentro gli introni o nel DNA inter-genico, raramente nella regione codificante (hotspot mutazionali per scivolamento della polimerasi nella replicazione (ne aggiunge uno o ne rimuove uno), malattie correlate).

    Molto utili nella creazione di profili di DNA (identificazione univoca di un individuo o stabilire relazioni: combinazione genotipo di 10-15 loci altamente polimorfici, non correlati, sono sufficienti per una identificazione univoca. Es. test paternità, genetica forense, zigosità gemellare (?).

Es. sequenza Alu.

Famiglia Alu

• Appartiene ai SINE (corti elementi nucleari interspersi), i quali possono raggiungere un elevato numero di copie.
• Tipica dei primati.
• Non codificano proteine.
• Rappresentano la sequenza più abbondante nel genoma umano (densità > 1/3 kb).
• La lunghezza totale delle ripetizioni Alu è di 280 pb (2 ripetizioni in tandem di 120 pb, seguite da una breve sequenza ricca in A).
• Principalmente nelle regioni eucromatiche del genoma (quando associate ai geni, si trovano negli introni).

Pseudogeni e frammenti genici

Copie non funzionali di geni codificanti polipeptidi e di geni ad RNA.

• Pseudogeni: copie difettive di tutta la sequenza del gene o della sua regione codificante.
• Copie tronche: mancanza dell’estremità 5’ o 3’.
• Frammenti interni: anche un singolo esone.

Pseudogeni non processati:

• Sono stati copiati a livello del DNA genomica (duplicazione genica in tandem).
• Possono contenere promotore, esoni, introni, ma normalmente contengono codoni di stop inusuali (es. cluster di emoglobina α e β).

Pseudogeni processati:

• Contengono sequenze corrispondenti agli esoni (ma non agli introni) e includono ad una estremità una sequenza oligo dA/dT.
• Copiati a livello del cDNA, tramite retrotrasposizione e integrazione (sistema trasposizione LINE-1).
• Normalmente non espressi, ma esistono geni processati espressi (retrogeni) nel caso l’integrazione avvenga vicina ad un promotore.

Geni troncati o frammenti genici interni:

• Cluster di geni possono contenere pseudogeni non processati, copie geniche tronche e frammenti di geni (duplicazione genica in tandem, crossing over diseguale, scambio tra cromatidi fratelli diseguale).

Es. famiglia genica HLA. Gli pseudogeni possono influenzare le analisi molecolari. Gli pseudogeni accumulano mutazioni.

La regione ψASL2 comprende 561 nucleotidi ed è localizzata sul cromosoma 7, a circa 3Mb a monte del gene ASL, molto vicina al centromero. Contrariamente alla regione ψASL1, che appare essere attivamente trascritta, non c’è evidenza di trascrizione di EST a partire dal locus ψASL2.

Omologo = termine generale utilizzato per indicare geni o proteine (o altre strutture) che sono significativamente correlate evolutivamente.

• Ortologhi: in specie diverse. Ortho = esatto. Omologia risultato della speciazione, così la storia del gene riflette la storia della specie (stesso esatto gene in organismi differenti).
• Paraloghi: nella stessa specie. Para = in parallelo. Omologia risultato della duplicazione genica, così la storia dei geni non riflette la storia delle specie (proteine simili, potenzialmente all’interno dello stesso organismo).

Geni e strutture geniche

• Dimensione media di un cromosoma è di 140 Mb (circa 1400 geni per cromosoma).
• Numero di geni attualmente stimato 26,000 (basso, ma complessità trascrizionale e aumento della frequenza dello splicing alternativo nei genomi complessi).
• Dimensione media di un gene 27 kb, densità genica 1/100 kb.
• Il gene più grande: distrofina 2,4 Mb (0,6 % codificante, 16 h richieste per la trascrizione).
• Il gene più corto: tRNA tyr (100% codificante).

Indagine molecolare basata sui marcatori genetici

Devono avere caratteristiche ben precise:

• Polimorfici: almeno 2 alleli, con frequenza, di quello più raro, di almeno 1%.
• Facili da identificare e stabili nelle generazioni: scivolamento polimerasi non porta mutazioni tra una generazione all’altra.
• Segregazione mendeliana.

Una volta era molto utilizzato il marcatore gruppo sanguigno (antigeni di membrana del plasma (AB0) o le varianti enzimatiche o quelle cromosomiche (lqh+).

Oggi si utilizzano i marcatori di DNA:

• RFLP (polimorfismi di lunghezza dei fattori di restrizione): sfruttano il fatto che variazioni di sequenza causano variazioni dei vari siti di diversi enzimi di restrizione.
• SSLP.
• SNP.

SNP (polimorfismi a singolo nucleotide)

Rappresentano il 90% delle variazioni del genoma umano. Numero totale circa 10 milioni (1/290 pb). Copertura a livello genomico.

• Sostituzione nucleotidica (o polimorfismo simple indel).
• Tipicamente solo 2 alleli: marcatori biallelici (es. possono avere una T o una A).
• Possono causare variazioni anche in siti di restrizione, creazione o abolizione → RSP.
• Molti si trovano in DNA non codificante (introni, sequenze intergeniche).
• Non hanno distribuzione uniforme lungo il genoma.
• Molto utilizzati come marcatori per lo studio di suscettibilità, predisposizione a malattie comuni.
• Hanno elevatissima densità: utilizzo tecniche automatizzabili di genotipizzazione (= analizzare genotipo).
• Grazie al sequenziamento è stato possibile costruire database di tutti gli SNP (dbSNP).
• Metodi per il loro studio su larga scala (SNP array)= studio di SNP presenti su tutto il genoma (circa 10 milioni, 1 ogni 300 basi).

Microsatelliti

Varia il numero di ripetizioni. Vantaggio di essere multiallelici.

Analisi molecolare indiretta = Gene tracking

Una volta non erano conosciuti i geni malattia (enormi) → sviluppo metodiche indirette. Possibilità di prevedere genotipi all’interno di alberi genetici, senza conoscere la modificazione responsabile della malattia (monogenica mendeliana). Utilizzando marcatori concatenati al gene di interesse (o intergenici), per seguire un segmento cromosomico (identico frammento cromosomico e lo marco), permettono di identificare il genotipo e di seguire la segregazione nella famiglia.

Necessario conoscere il loco o la regione del gene, ma non il gene stesso.

Pre-requisiti:

• Malattia adeguatamente mappata e Omogeneità del locus (La malattia deve essere dovuta da solo quel gene).
• Albero genealogico ben fatto, disponibilità dei campioni dei familiari, determinazione della fase (associazione tra alleli al locus marcatore e al locus malattia).
• Diagnosi clinica inequivocabile (certezza della malattia), nessuna incertezza sulla posizione del gene della malattia sul cromosoma.

Applicabile a malattie con qualsiasi modalità di ereditarietà: un genitore che avrebbe potuto passare (o non) l'allele malattia al consulente.

3 step logici:

• Distinzione tra i 2 cromosomi nei genitori.
• Determinazione della fase (quale cromosoma porta l’allele malattia).
• Determinazione del cromosoma trasmesso al consulente.

Esempio albero:

• Autosomica dominante
• Esordio tardivo (non sempre la malattia genetica compare nei bambini).
• Test diretto non possibile.

III-2: test pre-sintomatico. Distinzione tra i 2 cromosomi della madre. Determinazione della fase (quale cromosoma porta l’allele malattia). Determinazione del cromosoma trasmesso al consulente, dalla madre.

Cerco marcatori concatenati al gene malattia della mamma (esterni o intragenici), affetta: marcatori 2-1. Della nonna, non affetta: 2-4 → ha trasmesso il 2 (non affetto) ma non il 4, l’1 l’ha preso dal nonno (affetto). Del papà, non affetto: 1-3. Genotipi possibili della signora: 2-1 e 2-3 (sani) o 1-1 e 1-3 (affetti). Si utilizzano più marcatori per ottenere informatività.

È il pattern di segregazione, non il genotipo, ad essere importante. Malattia congenita = presente alla nascita.

Gene NF1 (neurofibromatosi tipo 1)

Era importante fare analisi di tipo indiretto. Dimensioni medio grandi, con una 60ina esoni. Scelta di 6 marcatori, di cui 2 esterni e 4 interni, tra cui uno SNP e alu, distinguibili in base alla loro dimensione.

Sequenza del marcatore Alu: Questi si chiamano “microsatelliti” e sono dovuti alla ripetizione di una certa sequenza per un numero variabile di volte → la grandezza del frammento di PCR sarà diversa in base al numero di ripetizioni della sequenza, si vedrà in gel così: Ora si utilizza la genotipizzazione automatica (gen-scan). Veloce e precisa: singolo nucleotide, 1 giorno per tutti i marcatori. Utilizza il sequenziatore automatico: elettroforesi su capillari, marcatori fluorescenti (blu) e controlli (rossi). 2 alleli → si distingue quello che da malattia.

Diagnosi prenatale

Malattia dominante de novo: genitori sani → alcuni marcatori intragenici mancano, implica che probabilmente ci sono state delezioni a causa di LOH (= perdita di eterozigosità) → emizigoti.

Insidie del test indiretto

Il DNA marcatore usato non è la sequenza che causa la malattia. Si opera una predizione errata se la ricombinazione separa la sequenza dal marcatore. → espressione efficienza del test in percentuale. Frequenza di ricombinazione (e tasso di errore) da studi di famiglia mediante analisi di concatenazione standard. Buona scelta di marcatori con < 1% di ricombinazione con il locus malattia (uso ideale di marcatori intragenici, es. all’interno di un introne). La ricombinazione non può essere evitata, ma il tasso di errore è ridotto utilizzando marcatori fiancheggianti (2 marcatori a siti opposti).

Es. distrofia Duchenne:

• 2/3 dovuta a delezioni e 1/3 dovuto a mutazioni puntiformi.
• Gene molto grande, alta frequenza ricombinazione → elevato tasso errore (marcatori intragenici 5% ricombinazione).

Altre complicazioni:

• Mutazioni sporadiche: per condizioni XLR letali, 1/3 delle mutazioni sono sporadiche: la madre di un figlio non affetto ha 2/3 delle probabilità di essere portatore (non in AD sporadico o disordini XL).
• Possibilità mosaico frequente: mutazione interessa solo determinati tessuti.

Come e perché le mutazioni alterano la funzione genica

Le mutazioni sono implicate in molte patologie, enorme distinzione tra:

• Malattie monogeniche, mendeliane: una mutazione colpisce un singolo gene e produce fenotipo malattia.
• Malattie multigeniche, complesse.

Malattie monogeniche

Tipici pattern di ereditarietà. L’impatto è grossomodo lo stesso. Il rischio di sviluppare malattia è quasi lo stesso. Estremamente rare, alcune più frequenti come fibrosi cistica. Si parla di tratti semplici: il gene che se mutato da patologia, ma non è così semplice, perché le malattie possono essere influenzate anche da:

• Varianti geniche in altri geni.
• Fattori ambientali.

Es. distrofia Duchenne non influenzata dai 2 parametri. Es. Malattia deficit glucosio 6-P deidrogenasi (favismo), monogenica, dovuta a difetto su enzima, X-linked, determinato da un fattore ambientale come l’ingestione di determinati alimenti → stress ossidativo, altrimenti il bambino starebbe bene. Es. Emocromatosi, alcune forme sono monogeniche, conta molto l’ambiente. Es. Anemia falciforme. Es. Fibrosi cistica, dipende da varianti geniche in altri geni, es. cellule sistema immunitario.

Le alterazioni del DNA alla base, sono di tantissimi tipi ed esistono modi diversi per classificarle:

• Dimensione:
  • Mutazioni puntiformi: variazione di un singolo nucleotide.
  • Piccole inserzioni/delezioni o inversioni.
  • Riarrangiamenti su larga scala.
  • Anomalie numeriche dei cromosomi: 1 o intero set di cromosomi.
  • Altre.
• Tipo di cellule affette:
  • Mutazioni costituzionali o germinali o omogenee in tutte le cellule dell’organismo, perché ereditata o perché è avvenuta de novo in uno dei 2 gameti.
  • Mutazioni somatiche: colpiscono il soma.
    • Acquisite: possono interessare una singola linea cellulare. Es. tumori.
    • Se la mutazione si sviluppa durante lo sviluppo embrionale, l’individuo sarà mosaico.
• Effetto della mutazione:
  • Letale: es. displasia tanatofora, dello scheletro, dovuta a mutazione puntiforme, dominante, letale (il feto muore).
  • Subletale: frequenti.
  • Neutrale.
  • Vantaggiosa: più raro, es. resistenza HIV, β-talassemia (portatori sani hanno solo microcitosi, resistenti al malaria).