Genetica molecolare - 237 pagine

CARIOTIPO E BANDEGGIO CROMOSOMICO

• Tecniche di bandeggio:

o denaturazione e/o digestione enzimatica, incorporazione di coloranti specifici per il DNA.

o Colorazione dei cromosomi come una serie di bande chiare e scure.

• Consentono di identificare ciascun cromosoma e di definire il breakpoint delle traslocazioni, delezioni…

• Risoluzione in funzione del numero di bande: 350 bande (bassa), 550 (intermedia) fino a 850 (alta) (cromosomi

prometafase).

• I cromosomi sono visualizzati come cariogramma

(i cromosomi omologhi sono accoppiati, oggi con software!).

Bande: regioni di 1-10Mb.

Il limite di risoluzione è circa 5-10 Mb (in genere almeno 10 Mb).

TIPI DI BANDEGGIO

• Bandeggio G (Giemsa).

• Bandeggio Q (Quinacrina).

• Bandeggio R (riscaldamento preventivo).

• Bandeggio C (eterocromatina).

• Bandeggio ad alta risoluzione (in prometafase).

Bande G 400 bande:

ISCN:

braccio corto = p (petit).

braccio lungo = q (queue).

Ogni cromosoma è diviso in regioni (p1, p2, p3 e q1, q2, q3…) dal centromero, le regioni sono divise in bande (p11, p12,

p13…) e sottobande (p11.1, p11.2…) e sotto-sotto-bande (p11.21, p11.22).

BANDEGGIO AD ALTA RISOLUZIONE (bandeggio in prometafase):

FISH (fluorescence in situ hibridization)

Tecnica citogenetica che consiste nell’ibridizzazione di una sonda di DNA marcata al DNA cromosomico denaturato (su

vetrini per microscopio) di cromosomi metafasici.

La sonda di DNA è marcata:

• Direttamente (incorporazione di precursore nt fluorescente).

• Indirettamente (incorporazione di nt contenente un reporter, come biotina o digossigenina, che dopo legame al

DNA, è legato da una molecola fluorescente con alta affinità, es streptavidina o anticorpo).

Sono preferibili sonde di grandi dimensioni (>40 kb) per aumentare l’intensità di segnale (cosmidi → 40 kb, BAC → 200 kb,

YAC → 500 kb, prodotti PCR ).

Si ottengono risultati rapidi, visualizzabili in microscopia a fluorescenza.

Utile per identificare riarrangiamenti genomici (microdelezioni, duplicazioni, traslocazioni, ecc) di varie Mb (dimensione

minima sonda 40 kb), ma la ricerca è specifica per una data regione!

FISH metafasica

I segnali + si vedono come doppi spot (sonda ibridizzata ad entrambi i cromatidi fratelli, in fase M il DNA si è replicato!).

N.B. Si utilizzano sempre sonde di controllo!

MASSIMA RISOLUZIONE = molte Mb a causa del folding cromatinico (con cromosomi prometafasici risoluzione fino a 1-2

Mb).

Multi-color FISH (Multiplex FISH M-FISH)

Utilizzo di molecole legate a reporter con diversi fluorofori e di sofisticati sistemi per processare le immagini.

Consente di mappare diverse regioni cromosomiche contemporaneamente.

CHROMOSOME PAINTING

• Marcatura multipla.

• Complessa analisi d’immagine.

• Ogni cromosoma ha uno “pseudocolore” in base alla composizione in fluorofori.

• Traslocazione tra cromosoma 2 e 15.

Particolare applicazione della FISH che utilizza sonde derivanti da numerosi frammenti di DNA dai diversi tipi di cromosomi

umani (librerie di DNA…) in grado di ibridare con diversi loci in interi cromosomi → l’intero cromosoma fluoresce!

In genere eseguito su cromosomi metafasici.

Utile per definire riarrangiamenti e cromosomi marcatori in citogenetica classica ed oncologica.

FISH interfasica

FISH da nuclei interfasici, fornisce alta risoluzione. Risoluzione di 50-500 kb, ma l’accuratezza è ridotta perché il grado di

estensione della cromatina varia.

Fiber FISH

Condotta su preparazioni di fibre cromatiniche estese. E’ un metodo a > risoluzione ottenuto estendendo artificialmente le

fibre cromatiniche su un vetrino prima dell’ibridizzazione del DNA (risoluzione 500-700 kb).

CGH array (Comparative Genomic Hibridization)

• Simultanea marcatura del DNA del soggetto in esame e di un DNA di controllo (rappresentativo dell’intero genoma

di un pool di individui) con fluorofori diversi.

• I 2 DNA sono mescolati in rapporto 1:1, si esegue l’ibridazione su piccole sequenze di DNA disposte su un vetrino

(array) da un’apposita macchina.

o Se DNA in esame e DNA di controllo sono equimolari, i 2 DNA si “annullano” a vicenda e non si apprezzano

differenze di ibridazione in eccesso o in difetto.

o In presenza di una delezione, il segnale di ibridazione sarà a favore del DNA di controllo.

o In presenza di una duplicazione, il segnale di ibridazione sarà a favore del DNA testato.

Chips with up to 250.000 specific oligonucleotyde (60-mers) probes distributed throughout the genome, especially on gene-

rich regions.

Resolution depends on the number of probes.

RISOLUZIONE fino a 20 kb dipende da:

• Tipo e numero di sonde utilizzate.

• Distanza in cui sono intervallate lungo il genoma.

N.B. Risoluzione molto più alta delle tecniche di citogenetica classiche (cariotipo standard 10 Mb).

Array-CGH identifica perdita o acquisizione di materiale genetico.

NON individua riarrangiamenti genomici bilanciati!

• Fast.

• Sensitive.

• Operator-independent.

• Identifies precisely genes involved in the rearrangements.

Does not detect balanced rearrangements

• CNVs

• Duplications

SNP = single nucleotide polymorphism

Represents the 90% of human genome variations

• Nucleotide substitution (or simple indel polymorphism)

• Typically only 2 alleles

• Some cause changes in restriction sites (RSP, create or abolish site)

• Most SNPs are found in noncoding DNA (introns, intergenic sequences)

• Not uniform distribution along the genome

• Useful genetic marker (study of the susceptibility to common disease)

• Very high density! Allow ultra-high throughput genotyping

• Public databases available (dbSNP through the NCBI website)

• Methods for scoring SNPs on a extremely large scale (SNP-array)

Total number of SNPs: about 10 millions (1/290bp)

Genome-wide coverage

Copy-Number Variations

SNP Array

9/11

IMPRINTING

DISORDINI GENETICI ATIPICI: contraddicono le leggi dell’ereditarietà classica:

• EFFETTI IMPRINTING

• MALATTIA ESPANSIONE TRIPLETTE.

• MITOCONDRIALI.

Imprinting= meccanismo regolazione espressione genetica, epigenetico (non dipende dalla sequenza di DNA).

Va oltre al livello trascrizionale (RNA polimerasi, promotore, TF) e post-trascrizionale (processamento RNA, trasporto,

stabilità, traduzione), dipende dalle modifiche al DNA (epigenetica), soprattutto metilazione (metil-transferasi),

solitamente a livello di isole CpG.

Epigenetica= modifiche ereditabili, che non dipendono dalla sequenza del DNA.

La metilazione:

• Mantiene la repressione della trascrizione.

• È coinvolta nell’espressione mono-allelica.

• (metiltransferasi → pattern di metilazione CpG).

ESPRESSIONE MONO ALLELICA

i geni X-linked nelle femmine e tutti i geni autosomici sono biallelici (entrambi i genitori normalmente contribuiscono

ciascuno dei due alleli).

In umani e altri mammiferi, alcuni geni bi allelici sono caratterizzati da esclusione allelica (l’espressione di uno dei due

alleli, in condizioni fisiologiche, è spenta → emizigosità funzionale).

• Indipendentemente dall’origine parentale: es. inattivazione cromosoma X, riarrangiamento programmato del

DNA, Ig/TCR nei linfociti.

• In maniera dipendente dall’origine parentale= imprinting genomico (un sistema marchia uno dei due alleli).

Malattie autosomiche dominanti, colpiscono entrambi i sessi e sono trasmesse da entrambi i sessi, ma possono

manifestarsi solo se vengono ereditate dal genitore di un determinato sesso.

Genoma materno e paterno non sono uguali (escludendo le ovvie differenze tra DNA del genoma di spermatozoi e

ovociti) → differenze epigenetiche.

Principali differenze epigenetiche tra cromosomi parentali:

• la quantità totale di metilazione del DNA (genoma di spermatozoi è più intensamente metilato).

• Il pattern di metilazione in specifiche classi/loci di sequenze di DNA: es. sequenze LINE1 (altamente metilate in

cellule spermatiche), gene H19 (allele paterno altamente metilato, materno non metilato).

→ differenze nell’espressione di alleli materni e paterni.

Imprinting genomico= non equivalenza nell’espressione di alleli in determinati loci, in maniera dipendente dall’origine

parentale.

Fenomeni epigenetici sono ereditabili → mantenimento pattern monoallelico dell’imprinting.

OSSERVAZIONE DEGLI EFFETTI DELL’ORIGINE PARENTALE

1. Esperimenti su topo:

Embrione con tutti i cromosomi di origine di un solo genitore (diploidia uniparentale indotta) → incompatibile con

la vita anche nel topo.

• Diploidia uniparentale androgenetica (eredità paterna):

o Ridotta crescita fetale.

o Favorita crescita extra-embrionica.

• Diploidia uniparentale partenogenetica:

o Favorita crescita fetale.

o Ridotta crescita extra-embrionica.

2. Diploidia uniparentale nella specie umana:

• Androgenetica:

o Mole idatiforme: placenta ipersviluppata, mancano tutti i tessuti embrionali.

• Partenogenetica:

o Si forma teratoma ovarico: insieme tessuti differenziati, ma disorganizzati.

→ servono entrambi i genomi per lo sviluppo completo dell’embrione.

3. Disomia uniparentale:

cariotipo normale, con 2 copie dello stesso cromosoma, ereditato da un unico genitore.

Non dà necessariamente patologia, ma può dare fenotipo patologico (differente a seconda del sesso del genitore

da cui è stato ereditato) se nel cromosoma ci sono regioni sottoposte ad imprinting.

4. Delezione di determinate regioni cromosomiche produce differente fenotipo quando stanno su cromosoma

materno o paterno.

5. Determinati caratteri umani AD manifestano quando ereditati da un genitore.

• La maggior parte dei nostri geni non è soggetto ad imprinting.

• Mappa dei geni imprintati in topo:

o per alcuni cromosomi UPD non ha conseguenze

o per altri cromosomi causano fenotipi abnormi (alcune volte complementari per differenti origini

parentali: sovra crescita in UPD materno, crescita ereditata in UPD paterno, alcune volte letali).

• È proprietà di un numero limitato di geni individuali o piccole regioni cromosomali (circa 100 geni sono conosciuti

come imprintati in topo, controllano crescita e tratti neuro-comportamentali).

I cluster sono regolati da centri IC.

Geni imprintati conosciuti nell’uomo sono presenti in:

− Chromosome 6 (6q24-q26).

− Chromosome 7 (7q21-7q22; 7q32).

− Chromosome 8 (8q24).

− Chromosome 11 (11p15.5).

− Chromosome 14 (14q32).

− Chromosome 15 (15q11-q13).

− Chromosome 19 (19q13).

− Chromosome