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Risposte della cellula alla rottura del DNA a doppio filamento (DSBs)

La rottura del DNA a doppio filamento (DSBs) è la rottura di entrambi i filamenti: la molecola di DNA si rompe. Il pezzo rotto che non porta il centromero viene perso durante la mitosi, quindi è molto pericoloso. La rottura della doppia elica avviene per agenti esterni o spontaneamente, però può anche essere un danno conseguente ad un danno primario. Ad esempio, c'è una lesione sul DNA e non avviene sintesi del DNA translesione, può esserci un gap → single strand. Se il single strand si rompe posso avere la rottura della doppia elica, causata dalla mancata riparazione della lesione primaria. Queste sono le lesioni più pericolose.

Inoltre, se si rompe il DNA prima della replicazione, la forca replicativa arriva alla fine del cromosoma e si ha il collasso della forca: non si ha replicazione del pezzo danneggiato e viene anche perso.

La cellula ha un network di proteine per rispondere alle rotture della doppia elica del DNA. C'è una

Modificazione istonica per cui la proteina istonica H2A viene fosforilata a gamma-H2A su un particolare residuo (cambia da organismo a organismo) in prossimità del DNA che interessa la lesione. Questa modificazione istonica viene utilizzata come marker: se H2A è fosforilata si ipotizza che ci sia danno al DNA.

Quando c'è una rottura al DNA ci sono 2 meccanismi per ripararlo:

  1. Ricombinazione omologa (HR)
  2. Non homologous end joining (NHEJ)

La ricombinazione omologa necessita che ci sia un cromosoma omologo o un cromatide fratello intatto. NHEJ non necessita di nulla.

Esperimento di immunofluorescenza: utilizzo di un anticorpo correlato ad una molecola che emette fluorescenza, che riconosce un anticorpo che riconosce una proteina coinvolta nel riparo del DNA. I punti di segnale rossi sono indicativi dell'accumulo della proteina Rad51 (proteina coinvolta nel riparo del DNA). Questi punti prendono il nome di foci di riparazione.

In lievito: Colorazione con DAPI

sono danneggiate o contorte. Tuttavia, se le estremità sono frammentate o danneggiate in modo più complesso, potrebbe essere necessaria l'azione di altre proteine per facilitare il processo di ricongiungimento. ➢ HDR: è un sistema di riparazione che sfrutta una sequenza di DNA omologa come modello per riparare la rottura. Questo meccanismo è più preciso rispetto a NHEJ, ma richiede una sequenza di DNA omologa disponibile per la riparazione. ➢ SSA: è un sistema di riparazione che sfrutta sequenze ripetute nel DNA per riparare la rottura. Questo meccanismo è simile a HDR, ma non richiede una sequenza di DNA omologa. In conclusione, la riparazione del DNA è un processo complesso che coinvolge diversi meccanismi e proteine. La scelta del meccanismo di riparazione dipende dalla natura della rottura e dalla disponibilità di sequenze di DNA omologhe.

Sono leggermente protruding. Se i protruding sono di pochi nucleotidi è in grado di rilegare, ma se i protruding sono di molti nucleotidi lig4 non è in grado di rilegare quindi si deve innescare la ricombinazione omologa.

Il problema di questo sistema è che è cieco: rileva la presenza di rotture e rilega, quindi potrebbe diventare mutageno. Può avvenire:

  • Rilegazione imprecisa
  • Rilegazione di estremità che non vengono dalla stessa molecola di DNA (→ traslocazione)

NB: è un sistema molto efficiente ma la debolezza è che è cieco (non è in grado di riconoscere errori di appaiamento oppure che molecole di DNA non vengono dallo stesso cromosoma)

Ku è un dimero i 2 subunità che forma una struttura circolare e riconosce le estremità di DNA in maniera specifica. Questo anello carica la lig4 che lega le estremità.

Il malfunzionamento di lig4 genera una sindrome: sindrome di lig4. Questa malattia porta

aimmunodeficienza e predisposizione ai tumori. Si pensa che sia dovuta ad un problema nel riarrangiamento del Dna che lega le regioni costanti e variabili. Questo meccanismo di riarrangiamento coinvolge il NHEJ e spiega perché pazienti con difetto nella lig4 hanno problemi a livello del sistema immunitario.

Il complesso MRX (MRN in uomo) è un complesso chiave nella risposta alla rottura della doppia elica. Costituito da 3 proteine:

  • Mer11
  • Rad50
  • Xrs2 (in uomo Nds11)

Le proteine più studiate sono Mer11 e Rad50 (le uniche presenti in batteri, manca Xrs2). Xrs2 lega Mre11 e Ra50 a formare un complesso ed è l'unica ad avere un segnale di traslocazione nucleare quindi permette di trasportare Mre11 e Rad50 nel nucleo (motivo per cui procarioti non ce l'hanno).

Mer11 ha attività catalitica ed è una nucleasi. È una esonucleasi 3'→5' ed è anche una endonucleasi (taglia all'interno).

Rad50 ha diversi domini:

Walker A- Alfa-elica- Regione zinc hook (Cys-X-X-Cys)- Alfa elica- Walker B

Walker A interagisce con Walker B formando un dominio globulare. il coil coli si forma tramite ripiegamento dell’alfa-elica

Il complesso MRX completo ha 2 proteine Xrs2, 2 proteine Rad50 e 2 proteine Mre11 che dimerizzano. Queste proteine da sole non funziono ma devono legare la corrispondente proteina formano un complesso esamerico:

  • Dominio globulare Rad50+Mre11
  • DNA (nero)
  • Coiled coil
  • Dominio Cys-X-X-Cys all’apice del coil coil +→zinco (Cys-X-X-Cys – zinco – Cys-X-X-Cys) struttura ad uncino (zink hook). Le 4 cisteine insieme coordinano l’atomo di zinco→legame intramolecolare all’interno dello stesso complesso MRX
  • 2 ATP: Rad50 è una ATPasi (idrolizza ATP). Rad50 ha 2 siti di binding per ATP: per generare i 2 siti di binding ATPasici completi e funzionanti servono le 2 proteine Rad50 perché un pezzo viene da una e un pezzo viene dall’altra (1 sola
rad50 non genera un sito ATPasico funzionante), servono quindi 2 proteine globulari. Si generano a questo punto 2 siti di binding per ATP. Quando il complesso idrolizza l'ATP, si apre e le Rad50 si separano (è sconosciuto quello che accade al coiled coil perché gli studi vengono fatti sui cristalli e questa struttura è assente tra i cristalli: le regioni mobili non si riescono a cristallizzare). Ora il DNA può toccare Mre11 (verde). È stato ipotizzato che l'idrolisi di ATP faccia aprire il complesso, facendo spostare le subunità Rad50 perché il DNA possa accedere a Mre11. → il DNA accede solo dopo che Rad50 ha idrolizzato ATP MRX/MRN ha molte funzioni. Innanzitutto, interviene come ponte intermolecolare. Quando c'è una rottura sul DNA se c'è una proteina che lega le estremità e le tiene vicine favorisce che il NHEJ rileghi quelle estremità e non estremità qualsiasi. Il ponte hookpuò essere intramolecolare o intermolecolare. Il complesso MRX consente di tenere vicine 2 estremità ed è proprio il coiled coil a fare da ponte. Rende così il NHEJ un sistema efficiente di riparazione e riduce la probabilità di errore. La funzione di tetering (tenere vicine le estremità di DNA). La funzione del MRX dipende proprio dalla sua struttura (correlazione struttura-funzione). Il fatto che le estremità siano mantenute vicine è stato dimostrato con un sistema detto end-tetering. La sequenza TetO lega TerR (repressore) dove TetR è stato fuso con la proteina GFP che emette fluorescenza in modo naturale. Di conseguenza quando TetR si condensa con TetO emetterà fluorescenza. Sono stati ingegnerizzati ceppi di lievito. HO: gene che codifica per una endonucleasi che il lievito esprime normalmente e serve per fare switching di mating type: un aploide A può diventare α e viceversa. Questo perché taglia in unparticolare locus sucromosoma 3 a livello del locus Mat (locus del Mating type).→evento di ricombinazione innescato da un taglio nella molecola di DNA (entrambe le eliche sono rotte,dalla nucleasi HO).Il primo modello di ricombinazione è lo switching di mating type catalizzato da HO.Il gene HO è stato ingenerata in modo tale da eliminare il suo promotore e inserire il promotore GAL: HO èinducibile da galattosio.- Se nel terreno c'è galattosio HO viene indotto e ho la proteina- Se c'è nel terreno glucosio o raffinosio HO non è indotto e la proteina non è espressaHanno quindi usato un ceppo di lievito con gene HO sotto il controllo di Gal.Il ceppo è stato ingegnerizzato inserendo le sequenze TetO a monte e a valle del gene HO (non sono moltovicine).Se HO è presente, questo codifica per la nucleasi che taglia la sequenza. A monte e aalle di HO ci sono lesequenze Teto che legano TetR ed emettonofluorescenza. Sono stati anche utilizzati dei controlli con solo 1 sequenza TetO o le 2 sequenze TetO sono su due cromosomi diversi.
  1. Guadando un ceppo WT vado a vedere nelle cellule eventuali segnali luminosi che corrisponde ad emissione di fluorescenza da GFP. Se le estremità si sperassero dovrei vedere 2 segnali luminosi: solo il 10% delle cellule hanno due segnali luminosi e il 90% hanno un unico segnale luminoso.
  2. ES: mutate sae2Δ (Δ: è stato eliminato il gene sae2). Al tempo 0 ho 90% di cellule con solo 1 segnale, dopo 3 e 6 ore aumentano le cellule che hanno 2 segnali.
  3. ES: eliminando mre11 per cui elimino una delle subunità del complesso MRX perdo funzionalità del complesso e vedo la presenza di un solo segnale luminoso.
Le estremità sono tenute vicine e questo dipende sia da sae2 che da mre11→geneticamente controllato A cosa servono i controlli? - Il controllo B ha solo 1 sequenza TetO→mi aspetto solamente un segnale visto che nonho il riconoscimento della seconda sequenza TetO. Dovrei vedere solo 1 segnale perché i cromatidi fratelli sono tenuti vicini dalla coesina, dopo la fase S ne potrei vedere 2. Il controllo C ha 2 sequenze TetO ma su 2 cromosomi diversi, serve per essere in grado di vedere i 2 segnali luminosi dato che la cellula è molto piccola. Non vedo 2 segnali perché la cellula è piccola o perché le due estremità non si separano? Vedo 2 segnali perché i cromatidi fratelli sono tenuti coesi dalla coesina. Vedrei 2 segnali dopo la fase S, in G1 ne vedo sempre 1. La percentuale di cellule con 2 o + segnali spotted da GFP aumenta nel controllo B su mre11 perché mre11 presenta in partenza una percentuale maggiore di cellule GFP rispetto al WT. Da cosa è dovuto il 20% di cellule che hanno 2 segnali luminosi? È dovuto alla coesione. Il complesso MRX serve anche a.
Dettagli
Publisher
sara.devettor
A.A. 2018-2019
121 pagine
SSD Scienze biologiche BIO/18 Genetica
I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher sara.devettor di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Genetica molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Università degli Studi di Milano - Bicocca o del prof Longhese Maria Pia.