genetica molecolare

Genetica molecolare

Concetti da ripassare

• Replicazione DNA
• Trascrizione
• Traduzione

Esame scritto

Domande aperte 22 cromosomi + X o Y. Un assetto cromosomico normale viene detto euploide, e la ploidia è caratteristica per ogni organismo.

Esempio: uomo diploide. Nelle piante si tende ad aumentare il grado di ploidia con scopo di aumentare la dimensione dei frutti. Esempio: banana triploide, diploide non sarebbe mangiabile. Quindi il grado di ploidia è una caratteristica di ogni organismo.

Alterazioni del numero cromosomico

Definito il grado di ploidia di un organismo ci possono essere alterazioni del numero di cromosomi:

• Poliploidia → l'alterazione riguarda l'intero assetto.
• Aneuploidia → l'alterazione riguarda uno o pochi cromosomi. Esempio: sindrome di Down causata da trisomia 21 (un cromosoma 21 in più).

Aberrazioni cromosomiche

Le aberrazioni cromosomiche riguardano la struttura del cromosoma. Alcuni esempi includono:

• Delezione terminale: si può avere perdita di materiale genetico all'estremità.
• Circolarizzazione del DNA: perdita di materiale ad entrambe le estremità. Nota Bene: la perdita di materiale avviene in seguito alla rottura di entrambe le eliche del DNA.
• Delezione interstiziale
• Traslocazione reciproca: taglio al cromosoma 1 e al cromosoma 10, questi tagli possono essere riparati dalla cellula correttamente o ci può essere un errore tale per cui avviene una traslocazione reciproca.
• Traslocazione robertsoniana
• Inversione: ci sono 2 tagli e la cellula ricongiunge le estremità in maniera errata con il frammento centrale invertito.
• Delezioni e duplicazioni: presuppongono un appaiamento e un crossing-over non corretto.

La maggior parte delle aberrazioni cromosomiche (NON SONO MUTAZIONI PUNTIFORMI GENICHE) partono tutte da una rottura della doppia elica, che è una delle lesioni più pericolose per la cellula. La rottura della doppia elica può avvenire:

• Accidentalmente
• Indotta (tramite agenti)

Cromosoma lineare e telomeri

Un cromosoma lineare per mantenersi tale deve possedere i telomeri (complessi nucleoproteici: DNA + proteine). Il DNA ha una sequenza particolare ricca di timine e guanine. Questa sequenza è dettata dalla telomerasi alla quale si legano proteine che proteggono l'estremità telomerica; se non ci fossero, la cellula non potrebbe mantenere un DNA lineare ma circolarizzerebbe.

Nota Bene: l'unico organismo che non ha la telomerasi è la Drosophila. Durante il processo di invecchiamento avviene l'accorciamento dei telomeri, questo perché nella maggior parte delle cellule somatiche la telomerasi non è espressa. Nelle cellule tumorali queste sono immortalizzate e in continua replicazione quindi non possono avere un telomero corto perché altrimenti si instaurerebbe senescenza: se la cellula va in senescenza smette di dividersi (la cellula tumorale è l'opposto di quella senescente). Accade che le cellule tumorali riattivano la telomerasi: si è pensato di sintetizzare inibitori della telomerasi ma non ha funzionato perché le cellule tumorali bypassano l'inibitore allungando comunque i telomeri con un meccanismo alternativo di ricombinazione (ALT: Alternative Lengthening of Telomeres).

Tipi di mutazioni

Mutazione genica: mutazione missenso, frame-shift, stop-codon (mutazioni puntiformi dove cambia una coppia di basi e quindi un codone).

Mutazioni cromosomiche: aberrazione di struttura dei cromosomi.

Mutazioni genomiche: dove varia il numero di cromosomi. Possono interessare l'intero assetto oppure solo 1 o 2 cromosomi.

Instabilità del genoma

Nota Bene: il cariotipo di una cellula tumorale è completamente riarrangiato rispetto a WT. Quello che si pensava 10 anni fa era che la cellula era diventata tumorale e il suo genoma cambiava come conseguenza dell'essere tumorale. Il cambiamento del genoma avviene prima e queste causano la tumorigenesi. L'instabilità del genoma quindi non è la conseguenza dell'essere tumorale, ma è la causa. Nota Bene: il processo di cancerogenesi è un processo multi-step e parte sempre da 1 sola cellula.

Sindrome di Down

La sindrome di Down è una malattia genetica causata da variazione nel numero di cromosomi (3 copie del 21). C'è una correlazione diretta tra età della madre e tasso di bambini Down: la probabilità aumenta all'aumentare dell'età della madre, questo perché la trisomia 21 la si ha quando si ha errore nella divisione meiotica che porta ad un'errata segregazione dei cromosomi, dove quindi il 21 ha segregato male nella prima o nella seconda divisione meiotica. Influisce l'età della madre perché è sempre legato al processo di invecchiamento, legato alle cellule: oogenesi e spermatogenesi sono processi diversi, dove le donne hanno tutte le cellule uovo bloccate in prima fase meiotica dove i cromosomi omologhi sono appaiati e ci sono dei punti crociati che li tengono congiunti. Negli uomini invece le cellule partono sempre dall'inizio e non sono bloccati in prima divisione meiotica. Quindi quando le donne invecchiano accade che i punti crociati si rompono e i cromosomi segregano male alla prima divisione meiotica → aumenta la probabilità di avere un feto con un numero di cromosomi diverso dall'atteso.

Parlando di trisomia 21 ci riferiamo alla sindrome di Down, ma altre patologie che vedono aberrazioni nel numero di cromosomi oltre a quella del 21 sono incompatibili con la vita (aborto precoce). Lo 0,6% dei bambini nati vivi presentano anomalie cromosomiche. Oltre alla trisomia 21, altre due trisomie compatibili con la vita sono la trisomia 13 (sindrome di Patau) e la trisomia 18 (sindrome di Edwards).

Cromosoma eucariotico

Ha diversi gradi di compattamento:

• Doppia elica
• Lega proteine istoniche
• Cromatina
• Cromosoma mitotico condensato

Quando il DNA si danneggia in realtà è complessato ad una serie di proteine sia istoniche che vari regolatori della cromatina. Il DNA umano è sotto forma di cromosomi.

Gli elementi fondamentali di un cromosoma eucariotico sono:

• Regioni telomeriche: formate da DNA e proteine specifiche (processo di Sheltering)
• Centromero: con cui il cromosoma prende contatto con le fibre del fuso mitotico
• Origini di replicazione

Il DNA si replica e viene sdoppiato nei cromatidi fratelli, tenuti insieme da una proteina (coesina) e fa sì modo che il cromosoma si replichi e generi un cromatide fratello ma devono essere tenuti insieme per permettere la corretta segregazione corretta nelle cellule figlie. Assicura che l'appaiamento sia 1:1 e 2:2 e non 1:2 o 2:1 durante la mitosi. Segregano da parti opposte quando si rompe l'anello proteico, possono quindi essere tirati dalle fibre del fuso mitotico.

Cromosoma omologo e cromatidi fratelli

Cromosoma omologo: abbiamo 2 copie di ciascun cromosoma dato che siamo diploidi, non necessariamente identici e provenienti uno dal padre e uno dalla madre.

Cromatidi fratelli: originati in seguito alla replicazione del DNA e sono identici.

Ciclo cellulare

La replicazione non funziona allo stesso modo in tutto il ciclo cellulare. Distinguiamo diverse fasi:

• G1: crescita cellulare
• S: avviene la replicazione del DNA
• G2: ulteriore accrescimento
• M: mitosi

Da 1 cellula diploide originano 2 cellule figlie diploidi con stesso contenuto genetico.

Mitosi e meiosi

In mitosi la cellula è diploide e si ha:

1. Duplicazione del DNA
2. Ciascun omologo sdoppiato nel cromatide fratello
3. Disposizione su piastra metafasica
4. Separazione dei cromatidi fratelli a generare cellule figlie identiche alla cellula madre

In meiosi a partire da una cellula diploide:

1. Duplicazione del DNA
2. Nella I divisione meiotica I non si ha la separazione dei cromatidi fratelli ma l'appaiamento dei cromosomi omologhi
3. Segregazione di cromosomi omologhi in prima divisione meiotica
4. In II divisione meiotica si ha segregazione dei cromatidi fratelli

Si originano gameti aploidi, hanno quindi dimezzato l'informazione genetica rispetto alla madre.

Aberrazioni cromosomiche

Le aberrazioni cromosomiche come trisomia 21, cromosomi in più o meno, triploidia ecc. derivano di errori in mitosi o meiosi (in prima e talvolta anche in seconda divisione meiotica). Esempio: immaginando 13 cromosomi, come faccio a generare un triploide? Abbiamo un genitore dove in un gamete non è avvenuta la separazione degli omologhi. Esempio: si può ottenere un tetraploide se in entrambi i genitori non è avvenuta la separazione degli omologhi (2 gameti dove non è avvenuta separazione). La condizione di triploidia e tetraploidia non è compatibile con la vita nell'uomo, ma è tollerato per le piante. Tutti questi errori avvengono durante la meiosi.

Appaiamento di omologhi e segregazione

L'appaiamento di omologhi e segregazione è fondamentale: le cellule tumorali hanno sia aberrazioni cromosomiche che genomiche. Il corretto appaiamento dei cromatidi fratelli è garantito dalla coesina: anello proteico che li tiene vicini e si può rompere. In meiosi, nella prima divisione, si devono appaiare i cromosomi omologhi: non c'è la coesina quindi non c'è una proteina che fa da anello, quindi cosa assicura la corretta segregazione? Il crossing-over, quindi la ricombinazione, questo è un ponte crociato di DNA, consente quindi il corretto appaiamento e la corretta segregazione dei cromosomi omologhi in meiosi I. → giunzioni di Holiday. Sono punti fisici dove il DNA ricombina mantenendo l'associazione tra gli omologhi. Quando gli omologhi si appaiano si instaura un fenomeno di ricombinazione dove si formano dei punti crociati di DNA e i cromosomi sono appaiati, questa struttura assicura che i cromosomi vadano da parti opposte. Se i ponti crociati si rompono la segregazione di cromosomi omologhi è aberrante e si hanno gameti che hanno in più o in meno dei cromosomi singoli. Generalmente se il ponte crociato si rompe sarà la segregazione di un cromosoma alterata, per avere la segregazione errata di tutti i cromosomi non sarà dato dalla rottura del ponte crociato, ma non dovrebbe funzionare correttamente il fuso meiotico.

Esempio: colchicina causa la modificazione del fuso meiotico.

Danno al DNA

Nell'uomo il problema è lo sbilanciamento dell'informazione genetica. Il DNA è una molecola molto stabile, però è soggetto ad essere danneggiato. Le sorgenti di danno al DNA sono:

• Errori di DNA polimerasi
• Reazioni di ossidazione depurinazione che avvengono all'interno della cellula: sono reazioni del metabolismo cellulare che avvengono spontaneamente
• Danni esogeni come radiazioni o danni chimici
• Meccanismo di riparazione della cellula

Lesione al DNA

La lesione al DNA è una modificazione della struttura molecolare del DNA:

• Dimero di pirimidina
• Mismatch
• Rottura della doppia elica

Le mutazioni invece seguono il danno, si manifestano quando il danno al DNA non viene riparato. Il danno al DNA non è una condizione stabile perché la cellula ha meccanismi per riparare il danno, ma può diventare mutazione e questa è irreparabile. Nota Bene: i meccanismi di riparazione riparano i danni al DNA, non le mutazioni. Il DNA pur essendo una molecola molto stabile può essere danneggiato tramite sia agenti endogeni che esogeni. Considerando il genoma umano la maggior parte dei DNA non è codificante per proteine. Se sequenze correlate ai geni sono solo 48 megabasi. La maggior parte delle malattie genetiche sono causate da mutazioni puntiformi (missenso) che toccano e i geni.

Lesioni al DNA

Le lesioni al DNA comprendono:

• Errori da parte della DNA polimerasi: la fase del ciclo cellulare in cui il DNA è più suscettibile è la fase S dove la doppia elica si apre e viene replicata dalla Dna polimerasi. Le cellule eucariote hanno le DNA polimerasi canoniche:
  • Alfa e primasi: responsabili della sintesi di frammenti di Okazaki sulla leggind strand
  • Delta e epsilon: sintetizzano il leading strand

Hanno una percentuale di errore molto bassa perché hanno attività esonucleasica 5’→3’ che permette di togliere i nucleotidi errati. Può però fare errori nell'inserimento di nucleotidi.

• Danni endogeni
  • Metabolismo ossidativo
  • Depurinazione (perdita di purine)
• Danno esogeno
  • Radiazioni
  • Agenti chimici (agenti mutageni)
• Meccanismo di riparo error-prone

Tutto ciò che danneggia il DNA si definisce mutageno. → Il danno o lesione al DNA è un’alterazione del materiale genetico. → La mutazione è un cambiamento ereditabile della sequenza del DNA. Il danno al DNA è riparabile (meccanismi di riparo) mentre la mutazione è irreparabile. Il danno al DNA è una situazione transitoria e non stabile, riparabile dalla cellula. La riparazione del DNA rappresenta tutti i pathway cellulari deputati alla riparazione del danno, non delle mutazioni. La mutazione è sul DNA, non su RNA. La mutazione che insorge sulla molecola di RNA (errore da parte della RNA polimerasi) capita solo su quella molecola di RNA e non viene tramandata alla progenie. L’organismo che porta la mutazione in un determinato gene si chiama mutante.

Danni di tipo endogeno

Danni prodotti dalla cellula stessa:

• Mismatch: errore di appaiamento tra le basi, a carico della DNA polimerasi.
• Reazioni di deamminazione delle basi. Esempio: citosina subisce la perdita del gruppo ammidico, generando l'uracile. L'uracile è costituente del RNA non DNA (problema). Succede l'appaiamento U-G (non C-G), accade che:
  • Uracile viene rimosso
  • Se non viene rimosso la cellula replica il DNA: l'elica si apre e sulla U si appaia la A, alla successiva replicazione → del DNA sulla A si inserirà una T mutazione TA.

L'inserimento dell'uracile era un danno al DNA, se non viene riparato è la stessa replicazione del DNA che trasforma un danno in mutazione per sostituzione di coppia di basi. Nota Bene: da una lesione al DNA, se non riparata, si trasforma in mutazione.

• Depurinazione o depirimidinazione: perdita di purine o pirimidine. Idrolisi spontanea del legame glicosidico: lo scheletro resta intatto ma si perde la base a generare un GAP apurinico o apirimidinico. Non si rompe la doppia elica ma si ha solo la perdita della base. Può venire riparata.
• Danno ossidativo: i ROS prodotti dal metabolismo cellulare possono determinare l'ossidazione delle basi per cui la guanina stabilisce una reazione di ossidazione formando la 8-exodG (GO) che ha capacità di appaiamento diverse.
  • Da un GC si passa a TA: lesione al DNA che se non viene riparata la DNA polimerasi trasforma la lesione in mutazione (mutazione per sostituzione di coppie di basi, a seconda che tocchi o meno la regione codificante avrà effetti diversi).
• Incorporazione di analoghi delle basi: il 5-bromuracile è simile alla timina e quindi viene incorporato al posto della timina.

Danni di tipo esogeno

• Agenti chimici
  • Agenti alchilanti
  • Agenti intercalanti
  • Agenti idrossilanti
• Radiazioni
  • Radiazioni ionizzanti particelle alfa, beta, raggi gamma e X. Collidono con gli atomi determinando il rilascio di elettroni e la formazione di radicali liberi. Provocano per lo più rottura alla doppia elica: generano uno dei danni più pericolosi alla cellula (rottura di ENTRAMBI i filamenti).
  • Raggi UV → la radiazione UV può essere divisa in 3 fasce di lunghezza d'onda:
    • A: arrivano sulla terra dal sole
    • B
    • C: bloccati da uno strato di ozono

Sono raggi mutageni di diversa pericolosità. Gli A sono mutageni ma hanno poco effetto su proteine e DNA. Quelli più pericolosi sono i C (a bassa lunghezza d'onda). I raggi UV provocano la formazione di dimeri di pirimidina: portano alla formazione di un legame covalente tra due pirimidine adiacenti (A-A o T-T). Esempio: anello ciclobutanico. I raggi UV sono poco penetranti ma sono comunque agenti mutageni. I dimeri di pirimidina sono riparabili dalla cellula: i meccanismi di riparazione funzionano ma hanno → dei limiti relazione sole-tumori cutanei.

Raggi X.

Conseguenza dell'insorgenza delle lesioni a DNA: mutazioni

Passaggio da lesione a mutazione:

1. Doppia elica di DNA (appaiamento A-T)
2. Replicazione del Dna
3. Nella elica di neonisti si può inserire la T (corretto) o una base errata (G)

Può avvenire il riparo della lesione ma se non viene riparata alla successiva replicazione dove c'è una G la cellula inserisce una C: → appaiamento G-C mutazione. Se la cellula non ripara il danno la replicazione stessa trasforma la lesione in mutazione. Non c'è alcun tipo di meccanismo in grado di capire che al posto di GC ci doveva essere AT perché GC è un normale accoppiamento. → La cellula è però in grado di riscontrare l'appaiamento errato AG possibile riparare le lesioni ma NON le mutazioni. Più è grossolana la lesione al DNA e più il meccanismo di riparo è suscettibile a riparare il danno.

Esempio: Il dimero di pirimidina provoca una distorsione nella struttura del DNA e quindi è facilmente riconoscibile. Esempio: L’errato appaiamento delle basi non provoca una eccessiva distorsione nella struttura del DNA, motivo per cui l’errore di appaiamento di basi è la lesione più difficile da riparare. Gli agenti intercalanti: non si sa precisamente cosa accade alla DNA polimerasi se incontra un agente intercalante, può essere che si blocchi. Esempio: se la replicazione del DNA è bloccata perché incontra un agente intercalante, cosa accade a quella cellula? Può effettuare comunque la replicazione se è presente un’altra origine di replicazione. Possono esserci però più blocchi e questo sarà pericoloso per la cellula: se il cromosoma non viene correttamente replicato non si ha formazione di cromosomi omologhi.

Le mutazioni

Le mutazioni sono cambiamenti ereditabili nella sequenza del DNA.