Genetica e genomica molecolare

Tecniche che permettono il riconoscimento del DNA

Metodi che sfruttano la capacità di due frammenti di annilarsi in base all'omologia di sequenza. Il metodo di riconoscimento per eccellenza è quello di sequenziamento. Il sequenziamento più utilizzato è il metodo di Sanger. Prima si usava invece il metodo di Max e Gilbert che si basava su tagli specifici. Alla base del metodo di Sanger c'è la possibilità di utilizzare dei nucleotidi durante la sintesi di DNA, che siano di desossinucleotidi e che in posizione 3' non abbiano l'OH che serve per l'estensione ulteriore della molecola. Se io ho un frammento di DNA che voglio sequenziare, mi preparo un oligonucleotide che si annili all'inizio di questo frammento e a partire dal 3' io sintetizzo una copia utilizzando il mio frammento concentrato. Nel momento in cui io introduco dei nucleotidi che siano dideossinucleotidi, la reazione avviene quando la DNA polimerasi si attacca al 3' OH per

raggiungere l'oligonucleotide. Io prendo il mio DNA sequenziato ed isegno un primer e faccio in modo che il mio primer si annili per complementarietà al mio strand. A questo punto preparo 4 frammenti diversi. Nel primo frammento metto la DNA polimerasi, tutti i nucleotidi normali e in ciascuna delle provette metterò una certa quantità del singolo dideossinucleotide: in una provetta il dideossi A, in un'altra dideossi P ecc. Questi si mischieranno ai 6 nucleotidi normali e faranno da substrato alla polimerasi. Quello che succede è che a partire da questo primer alcune molecole inseriranno immediatamente il primo prossimo? Alcune altre molecole inseriranno prima delle A normali. Noi originiamo dei frammenti di lunghezza diversa e guardiamo l'ultima base dei frammenti, se è una A, C, T, G. Poniamo questi frammenti su gel di acrilammide che è in grado di separare anche frammenti di singole paia di basi e ottengo un gel che mi permette di leggere la frequenza, perché io

Partirò da questo frammento più basso (in questo caso di 5 nucleotidi), quello successivo da 6 il primo ha una A, quello successivo una T e l'altro una G. Partendo dal fondo del gel leggo tutta la sequenza. A partire dal primer io leggerò le singole basi.

In una fase successiva si è utilizzato un metodo automatizzato. La metodologia è identica, la differenza è che i singoli di deossinucleotidi sono marcati con dei gruppi fluorescenti e possono essere letti durante la corsa e posso mettere tutto in un'unica provetta. In questo caso non è necessaria una separazione perché ho le singole basi. Vengo da una corsa fatta con metodi capillari capacità risolutiva molto alta. Ottengo un ferogramma di questo tipo che è la traduzione del laser che legge le varie basi col principio precedentemente spiegato. Questo è il metodo con cui è stato eseguito il progetto genoma umano.

Un altro metodo di riconoscimento del DNA è il riconoscimento in situ del DNA in cromosomi ed...

È quello conosciuto come Fish. Io marco una sonda fluorescente sempre facendo incorporare deinucleotidi fluorescenti e poi questa sonda viene ibridata direttamente su una cellula in metafase per vedere le diverse regioni dei cromosomi. È utile in citogenetica per individuare grosse delezioni e dissociazioni: non così grosse da essere viste con un cariotipo classico a bandeggio ma abbastanza da poter essere viste in questo modo.

Nell'immagine si possono vedere delle sonde verdi, ci sono cromosomi metafase. Vedo due segnali a causa della presenza di due cromatidi. Il segnale rosso invece è singolo e questo ci mostra che tale regione è presente in maniera deleta o modificata. Ci sono dilazioni che sono necessarie per identificare tutto un cromosoma: la sonda riconosce tutte le sequenze ripetute specifiche.

Esistono anche fish a RNA. La sonda può essere marcata in maniera radioattiva utilizzando soprattutto fosforo 32-35, e possono essere usate per delimitazioni su colonia. Es.

nel caso delle library di frammenti, poi magari ho necessità di tutte le colonie originate dai clonaggi, quindi posso capire grazie a una sonda specifica dove era presente il DNA di interesse. Oppure si può fare in maniera più drastica col southern blotting: faccio correre il DNA su gel, lo trasferisco su una membrana, che viene poi incubata e ibridata dalla mia sonda. Quando io digerisco il mio DNA non ottengo delle bande ma delle smirate. Quindi con l'ibridazione posso identificare i miei frammenti, EcoR1 e altri enzimi con la sonda marcata in maniera radioattiva o con un sistema di detection radioattivo. Si può fare anche con RNA. Un altro sistema è l'ibridazione in situ a RNA. Anche qui posso utilizzare sonde radioattive o sonde non radioattive (più usate) e il nucleotide ha attaccato un gruppo che è la digossigenina. Queste sono delle sezioni sagittali di cervello di embrione di topo. L'ibridazione in situ fa vedere che l'RNA messaggero che io sto

andando a testare è espressa in tutta la zona ventricolare. Ultimamente si usano più dei metodi non radioattivi quindi la sonda viene marcata con nucleotidicol gruppo digossigenina e poi si utilizzano anticorpi antidigossigenina che sono coniugati a unprodotto facilmente rilevabile. Questo è un cervelletto a qualche giorno di sviluppo e questo è il gene Math 1 che è molto specificoed è espresso solo nelle cellule che sono presenti nel tratto esterno. Otx2 è un altro gene importanteper lo sviluppo. Questo metodo quindi è utile per rilevare geni presenti nello sviluppo, conun’espressione molto specifica che col southern blot non avremmo mai identificato così attentamente. L’ibridazione in situ può essere fatta non solo su fetta ma anche su embrione interoo su cervello, questo può essere fatto sino ad un certo periodo dello sviluppo, perché poi l’organo diventa troppo grande.

MICROARRAYS

Sono stati sviluppati all’inizio più come strumenti

dell'analisi dell'espressione genica per cui sono stati utilizzati dei vetrini, delle slide spottate in maniera uscente/random o nucleotidi o cDNA corrispondenti a un numero X di RNAm. I vetrini più recenti hanno cinquantamila geni/cDNA spottati. Le sonde sono sul vetrino e sono circa 50 mila per un unico vetrino. Io marco tutto il cDNA proveniente da una cell o da tessuto. In questo modo io vado a vedere sui singoli spot qual è il gene che viene acceso o spento nel mio tipo cellulare. All'inizio si faceva per fare confronti differenziali: le mie cellule prima e dopo il trattamento con un fattore particolare. Estraggo il DNA dal tipo cell prima e dopo il trattamento, marco il cDNA che produco con 2 promotori diversi, butto tutto sullo stesso vetrino e avrò rosso se il gene è espresso più in una cell ma non nell'altra, verde viceversa e giallino se sarà espresso in maniera equivalente. Attualmente i vetrini sono standardizzati. I microarray vengono utilizzati.per contenere migliaia di oligonucleotidi, ognuno progettato per riconoscere una specifica regione del genoma. Questi microarray vengono ibridati con il DNA del paziente e poi analizzati per determinare la presenza o l'assenza di specifici polimorfismi. Inoltre, l'espressione genica può essere studiata utilizzando microarray a RNA. Questi microarray contengono sonde di RNA che corrispondono a specifici geni. Quando il campione di RNA del paziente viene ibridato con il microarray, è possibile determinare quali geni sono attivi o soppressi in quel particolare campione. In conclusione, i microarray sono strumenti potenti e versatili utilizzati per studiare l'espressione genica, la comparazione genomica e il gene typing. Sono ampiamente utilizzati nella pratica diagnostica e nella ricerca scientifica per comprendere meglio la complessità del genoma umano.

da diverse parti in cui posso mettere diversi campioni, ognuna di queste parti contiene tantissimi vitz? con i pezzi di DNA che stiamo testando. Questa vitz? non è presente una sola volta, ma dalle 30 alle 50 volte, è distribuito in maniera random in modo che il laser vada a vedere che il riconoscimento non è casuale.

PROGETTO GENOMA UMANO

Il GENOMA consiste nell'insieme di tutto il materiale genetico di un organismo, includendo il DNA nucleare e il DNA dei singoli organelli citoplasmatici (es. mitocondri). Il genoma non va confuso con "tutti i geni", il concetto stesso di gene è cambiato nel tempo. Infatti il concetto classico prevede che il gene sia quella porzione di DNA che viene trascritto in mRNA e tradotto in proteina. Il concetto stesso di gene ora è cambiato perché esistono geni che funzionano senza essere tradotti in proteine; i ncRNA sono geni che hanno una specifica funzione spesso legata alla loro struttura, ma non vengono tradotti in proteine.

Il genoma

è organizzato, al fine di comprendere le basi genetiche delle caratteristiche degli organismi e dei processi biologici. La genomica utilizza una serie di tecniche e strumenti per analizzare il DNA e l'RNA, compreso il sequenziamento del genoma, che permette di determinare l'ordine dei nucleotidi nel DNA. Questo processo ha reso possibile la mappatura completa del genoma umano e di molti altri organismi. Oltre alla sequenza del DNA, la genomica studia anche la struttura dei genomi, compresi i geni e le sequenze non codificanti. I geni codificano per proteine, che svolgono una varietà di funzioni all'interno delle cellule. Tuttavia, solo una piccola parte del genoma umano è costituita da geni codificanti per proteine. La maggior parte del DNA è costituita da sequenze non codificanti, di cui ancora non si conosce completamente la funzione. La genomica ha importanti implicazioni per la medicina, consentendo di identificare le basi genetiche delle malattie e di sviluppare nuove terapie mirate. Inoltre, la genomica ha anche applicazioni in altri settori, come l'agricoltura e la conservazione della biodiversità. In conclusione, la genomica è una disciplina che studia la struttura e la funzione dei genomi, utilizzando una serie di tecniche e strumenti. Questo campo di ricerca è fondamentale per comprendere le basi genetiche della vita e ha importanti implicazioni per la medicina e altre discipline scientifiche.è organizzato tutto il materiale genetico al suo interno, comprese le regioni prima considerate junk (spazzatura). Prima del PROGETTO GENOMA UMANO erano stati sequenziati solo i genomi di 2 fagi (ca 4000 bp) e del virus Epstein-Barr (170kb). Il primo batterio è stato sequenziato nel 1995 (Haemophilus influenzae - 2Mb). Agli inizi degli anni '90, negli Stati Uniti, è stato messo a punto il progetto genoma umano. L'idea parte da un dipartimento dell'energia americano il quale era interessato alla ricerca nel campo degli effetti che le radiazioni potevano avere sul DNA degli individui. Ovviamente però la maggior parte dei fondi è stata investita dall'NIH. Le linee guida di questo piano, da raggiungere in 5 anni, prevedevano (in realtà si volevano porre le basi per riuscire poi a raggiungere tali obiettivi): - PRODUZIONE DI MAPPE FISICHE DI TUTTI I CROMOSOMI -> In quegli anni infatti si conosceva poco del genoma umano, si sapeva dove erano

collocati alcuni geni ma non come erano collegati tra loro. Addirittura per alcuni geni non si conosceva su quale cromosoma fossero localizzati. Non si possedeva