Genetica e genomica molecolare

Genetica e genomica molecolare

Lezione del 4 ottobre 2019

Recombinant DNA techniques

Una delle tappe principali è stata il 1953 con la scoperta della struttura del DNA da parte di Watson e Crick. Tuttavia, questa prima fase ancora non coincide con gli studi sul DNA ricombinante. Questa fase è invece iniziata una ventina di anni dopo con la scoperta del possibile utilizzo di enzimi di restrizione. Dai primi anni '70, si sono succeduti una serie di sviluppi tecnologici, attraverso lo sfruttamento dei meccanismi che alcuni organismi inferiori (fagi, virus di cellule eucariotiche, batteri, lieviti) sfruttano nella loro vita.

Sono state sviluppate le tecniche del sequenziamento del DNA fino ad arrivare ai primi anni '80, in cui Kary Mullis ha sviluppato la PCR. Questa fase di ingegneria genetica e DNA ricombinante si chiude negli anni '90, mentre nel '95 si ha il primo genoma di batterio sequenziato.

Tecniche del DNA ricombinante

Con tecniche del DNA ricombinante si intendono quelle tecniche che hanno a che fare con l'utilizzo e lo sfruttamento delle molecole di acidi nucleici per amplificarli (frammenti o regioni di interesse) o per l'aspetto che riguarda il riconoscimento. Uno dei primi passaggi fondamentali è stato quello di sviluppare la possibilità di clonare dei frammenti di DNA, quindi avere dei frammenti di DNA definiti che potessero essere amplificati e espansi fino ad averne la quantità desiderata.

Per fare questo, si sono dovuti sviluppare un vettore molecolare che potesse ospitare il frammento di interesse. Il frammento stesso necessita di forbici molecolari che gli permettono di tagliuzzare il DNA, un enzima DNA ligasi per riassemblare il vettore più l'inserto e sfruttare il setting di replicazione dell'organismo ospite per poter amplificare il nostro vettore. Attualmente l'enzima di replicazione è usato molto meno.

Enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione sono delle endonucleasi che tagliano il DNA su entrambi gli strand in corrispondenza di sequenze specifiche di DNA, che possono essere di 4-6-8 basi, spesso palindromiche ma non necessariamente. Questo è un primo esempio di sfruttamento dei batteri: gli enzimi di restrizione sono degli enzimi che diverse specie batteriche usano come sistemi immunitari perché vengono utilizzati per digerire e restringere il DNA estraneo che dovesse entrare nella cellula del batterio.

Il batterio Escherichia coli produce l'enzima Eco R1 nel momento in cui entra un DNA esogeno pericoloso, dovrebbe esserne presente uno ogni 2 kilobasi e quindi il DNA che entra viene riconosciuto in tutti i siti di Eco R1, GA, TPC e viene spezzettato e diventa innocuo. Rimangono a singolo filamento sia da una parte che dall'altra, queste sono estremità appiccicose e questa è un'altra parte di alcuni siti di restrizione, queste estremità appiccicose possono favorire che se io metto in contatto con un altro frammento che è stato digerito allo stesso modo, queste estremità si possono avvicinare e quindi essere sigillate.

Clonaggio e plasmidi

Ci sono molti enzimi di restrizione, ogni enzima ha un differente tipo di riconoscimento, in alcuni casi palindromici o meno, e ognuno ha una condizione ottimale (crescita, nicchia ambientale) in cui poter operare; es. nei batteri termoresistenti l'enzima lavorerà a temperature più alte. Si possono scegliere gli enzimi di restrizione che ci fanno più comodo. Una volta che hanno digerito il nostro plasmide, questi enzimi di restrizione si potrebbero separare sopra gel di agarosio. Di fatto quei passaggi che vengono fatti nel clonaggio utilizzano un plasmide a doppio strand, quindi sono dei DNA circolari che vengono replicati e mantenuti all'interno di batteri e lieviti, quindi essendo mantenuti normalmente nella cellula batterica possiedono anche l'origine di replicazione, che gli consente di essere continuamente replicati e non persi.

Quindi sono dei vettori ideali per poterci clonare dentro il frammento di nostro interesse. Quello che si fa nel clonaggio è utilizzare questi plasmidi, aprire il DNA circolare doppio strand su ogni filamento con enzimi di restrizione, metterlo in contatto con un frammento con delle estremità che siano compatibili con quelle del vettore, e fare in modo che questo venga sigillato dall'enzima DNA ligasi. A questo punto, questo vettore con l'inserto può essere trasformato in cellule batteriche e quindi essere propagato.

Ligasi e clonaggio

Come ligasi si usa in genere una DNA ligasi T4 che è capace, avendo due estremità compatibili, di ricostituire lo scheletro del zucchero fosfato del DNA che è stato interrotto. Le interazioni tra specie di frammenti possono essere più semplici se partiamo da vettore e inserto che hanno le estremità compatibili, o perché sono state ristrette dallo stesso enzima di restrizione o perché i due enzimi di restrizione possono riconoscere siti diversi ma lasciare estremità che protrudono compatibili. Questo può favorire il legame.

Possiamo anche ligare estremità piatte: il problema in tal caso sarà la stabilità dei due frammenti, perché se hanno una parte che si annila rimangono un po' più stabili per permettere alla ligasi di agire, mentre le estremità piatte devono essere messe in condizioni di far agire la ligasi: si abbassa la temperatura per far in modo che si muovano meno le estremità. In alcuni casi potremmo avere la necessità di ligare estremità che non sono compatibili: possiamo rendere piatta l'estremità intervenendo con delle taglio-nucleasi tra le basi che protrudono oppure estendere il filamento.

Vettori e clonaggio

I vettori devono avere un'origine di replicazione, altrimenti una volta che io ho richiuso il mio plasmide con l'inserto e lo inserisco in una cellula batterica, questo rimarrebbe in singola copia e darebbe una cellula silente? Tutti i vettori utilizzati per i clonaggi sono stati ingegnerizzati a partire da quelli naturali, sono state emesse delle porzioni/cassette utili per i vari clonaggi e quindi per semplificarli molti vettori hanno dei siti di clonaggio multipli, quindi ho tanti elementi di replicazione più comuni e posso utilizzare queste regioni, come QR1 per il mio inserto, o se il mio inserto ha un'estremità H1 userò H1 e via.

Altra caratteristica è che io devo convincere il batterio in cui metto il vettore a tenerselo. Seleziono i batteri che portano il mio vettore e faccio in modo che venga propagato all'interno della cellula batterica. A questo punto io ho effettuato il mio clonaggio: alcune specie di batteri sono naturalmente competenti a prendere del DNA esogeno, mentre i batteri non competenti come l'Escherichia Coli devono essere in qualche modo trattati per accettarlo. Le cellule trasformate vengono messe nel terreno in presenza di un antibiotico per la selezione di cellule batteriche che hanno acquisito il vettore.

Preparazione di librerie di frammenti

Posso anche non mettere il singolo inserto del mio vettore ma preparare una libreria di frammenti e questo è stato uno step fondamentale per il sequenziamento del DNA: spezzetto un frammento lungo di DNA in tante porzioni e in maniera random tutti i frammenti li potrò clonare nel mio vettore; a questo punto avrò una serie di plasmidi diversi che hanno incorporato frammenti diversi, quindi io ho generato una library di frammenti che potrò andare a riconoscere nel batterio. I frammenti sia singoli che multipli possono andare a legarsi tra di loro: ciò che è discriminante è che se io lego vari inserti tra di loro anche in forma circolare, una volta entrati nella cellula batterica questi vanno a perdersi.

PCR e amplificazione del DNA

L'altro modo per arricchire il DNA che ci interessa è il meccanismo della PCR che ha fatto fare un salto di qualità a tutte le tecniche del DNA ricombinante: si basa sul fatto che posso utilizzare dei primer che riconoscano lo strand con una DNA polimerasi che usa come stampo i due filamenti che sono stati preparati, a partire dal primer viene sintetizzato, da 5' a 3' un frammento complementare. Questo avviene nel primo ciclo, nei cicli successivi io riseparo questi due filamenti di ciascuna delle due molecole prodotte e siccome i primer sono in eccesso per il mix che io utilizzo, avrò altri primer che andranno a nidare allo stesso modo su entrambi i miei strand e fornire e ricomporre il frammento complementare.

Utilizzo della PCR

I primer devono essere in eccesso perché ogni volta rimangono attaccati al frammento che si è sintetizzato. Altra cosa importante per la PCR è che Mullis aveva utilizzato all'inizio una RNA polimerasi normale, ma chiaramente ad ogni ciclo noi dobbiamo separare i due strand e il modo più semplice per farlo è alzare la temperatura. La DNA polimerasi inizialmente usata da Mullis in questo passaggio andava a perdere la sua attività. Poi da alcuni batteri sono stati estratti enzimi che resistono ad alte temperature, quindi ad ogni ciclo l'enzima mantiene la sua attività e quindi si possono ripetere questi cicli: essendo esponenziale la produzione di DNA, io arrivo dopo tot cicli ad avere una quantità di molecole identiche in questo frammento.

Ha fatto fare un salto di qualità quando io voglio clonare un pezzo di DNA genomico. Se io prendo un pezzo di DNA umano e lo digerisco con ecoR1 non avrò dei singoli frammenti purificabili, avrò una smirrata, perché se io ho 3 miliardi di paia di basi, avrò una distribuzione di frammenti enorme e che nel gel migreranno tra la parte più alta e quella più bassa e io non potrò isolare i frammenti che mi interessano: farò fatica a riconoscerli. Se voglio un frammento specifico e conosco le estremità, posso usare la PCR. Ovviamente se io ho un frammento di questo tipo e per convenzione uso lo strand 5'-3', per amplificare questo pezzo dovrò semplicemente disegnare, anche se non conosco tutta la frequenza ma conosco le due estremità, un primer identico a questo primo pezzo perché il primer andrà a legarsi sul frammento di mio interesse.

Amplificazione di RNA

Io posso, in teoria, amplificare anche RNA, non direttamente come RNA: lo trasformo prima in cDNA attraverso delle proprietà diverse, provenienti da virus che sanno fare la reazione inversa e produrre del DNA su uno stampo di RNA. In questo modo posso usare un tessuto a mio piacimento per estrarre l'RNA e come gli oligonucleotidi sono in grado di annilare con i poli A del RNA messaggero oppure anche con dei primer che hanno delle basi che possono riconoscere statisticamente le sequenze, e fare in modo con la trascrittasi inversa riproduca uno strand a DNA che viene ricopiato in un secondo strand e a questo punto io avrò un pezzo di DNA che corrisponde esattamente al mRNA e agirò con una PCR normale.

Applicazioni della PCR

A questo punto però la PCR mi rappresenta un RNA: può essere utile nel caso io voglia sapere se un certo mRNA è espresso o meno in un tessuto, se voglio avere la completa sequenza del mRNA e non posso farlo in altro modo perché quel gene sul genoma è diviso e occupa molte basi. In teoria con la PCR io potrei anche in parallelo dallo stesso organo amplificare sia DNA che RNA.

Un'evoluzione della PCR classica è l'end point: mettiamo la nostra reazione, facciamo andare per 40 cicli e poi la reazione viene caricata su gel e noi vediamo una bella banda e questo è l'end point, poi non succede più nulla.

PCR quantitativa o real-time

Più recentemente si sono sviluppati dei metodi di quella che è denominata PCR quantitativa o real-time PCR in cui io posso vedere a ogni ciclo cosa sta succedendo nel frammento che io sto studiando. Questo viene fatto perché la PCR viene fatta sostanzialmente nello stesso modo già descritto, ma durante la sintesi del DNA vengono incorporati dei nucleotidi fluorescenti o delle sonde, che vengono letti dalla macchina e in qualche modo si contano i numeri di molecole presenti in quel frammento.

Quindi nei primi cicli, come si osserva dall'immagine, non vediamo nulla perché siamo al di sotto della soglia, poi le varie curve rappresentano campioni diversi e vediamo chi esprime di più l'mRNA rispetto ad un altro. Quindi in questo caso vediamo che il primo campione violetto esce, nel senso che io comincio a rilevarlo, al quarto ciclo, quindi io ho un'espressione relativa di 4 cicli. Il ciclo in cui io comincio a vedere la mia amplificazione si chiama ciclo soglia. Il campione viola ha un ciclo soglia di 4. Il campione successivo ha un ciclo soglia di 6. Quindi io posso stabilire facendo il rapporto tra i cicli soglia che questo esprime più RNA iniziale rispetto a quello verde. Se io andassi a vedere solo l'end point non capirei la differenza perché poi arrivo a saturazione della reazione. Questo metodo invece è molto utile perché in tutta la fase logaritmica io continuo a vedere la differenza.

Clonaggio avanzato e vettori plasmidici

Tutto ciò che viene amplificato può essere anche clonato. Abbiamo detto che i vettori plasmidici hanno delle capacità di inserto relativamente limitate. A volte c'è la necessità di avere regioni molto più grandi clonate all'interno di un vettore, quindi si sono sviluppati una serie di vettori che a differenza di quelli standard sono sviluppati in un numero di coppie basso, volutamente basso perché si devono portare dietro degli inserti enormi e quindi bisogna dare tempo alla cellula di replicare tutti questi inserti enormi, altrimenti potrebbe portare a riarrangiamenti e mutazioni dei pezzi.

Quindi sono stati sviluppati una serie di plasmidi derivati da diversi organismi, che hanno la caratteristica di poter contenere dei frammenti enormi, anche di qualche megabase. Il perché uno voglia clonare un pezzo di DNA di un non vettore può essere il voler produrre la proteina ricombinante da questo frammento; es. trasformo il RNA in cDNA e quindi posso farlo esprimere in cellule batteriche e produrre una grossa quantità della proteina che mi interessa. E questo può essere utile in genomica funzionale per analizzare le caratteristica, la struttura di una proteina o in alcuni casi utilizzare la proteina modificata, ad esempio nel caso degli enzimi. Ci sono dei progetti che riproducono tutte le proteine codificate dai nostri genomi.

Tag e modifiche proteiche

In alcuni casi serve che queste proteine che noi produciamo in maniera ricombinante siano fuse a delle mini proteine che ci permettano di riconoscerle: questi tag sono piccole sequenze di proteine, a volte anche solo di dieci amminoacidi che vengono fuse. Nel cDNA abbiamo sequenze che producono il tag della proteina di nostro interesse-quella che abbiamo appena clonato. Quindi produciamo una proteina di fusione che ha questo tag che è riconoscibile, riconoscibile come un anticorpo, sono tag standard.

Esistono tag specifici che consentono, in sistemi adatti, la metilazione della proteina? In alcuni altri casi io voglio utilizzare l'inserto clonato di cDNA ma esprimerlo in cellule eucariotiche e non batteriche: alla valle dovrò avere dei siti di replicazione per far sì che questo gene che entrerà in una cellula di mammifero possa essere riconosciuto come trascrivibile, venga trascritto, adenilato, portato nel citoplasma e poi produrre la proteina.

Proteine eucariotiche

Questo è un esempio di proteina di mammifero. Le strisce verdi sono il cDNA che viene espresso in fusione con tag. Spesso anche le cellule di mammiferi sono espresse con tag al C o al N terminale in modo tale da poterle evidenziare per fluorescenza o con anticorpo specifico.

Mutagenesi sito specifica

Un altro passaggio è la possibilità di inserire delle mutazioni rispetto alla sequenza. Io ho cDNA di ras e sposto un amminoacido da una posizione all'altra: questo nuovo gene cellulare favorirà o meno la proliferazione cellulare? Io ho la necessità di produrre il mutante sulla base del mio vettore dove è contenuta la sequenza wild type. Posso utilizzare la tecnica che mi consente di fare mutagenesi sito specifica. Quindi io ho il mio plasmide con ras wild type e la posizione in cui io vorrei inserire la mia mutazione. Mi preparo due primer che siano complementari ad uno strand e all'altro strand e che portino in quella posizione di bersaglio invece dei nucleotidi che codificano per glicina, quelli che codificano per valina.

Faremo in modo di far annilare questi due primer ai frammenti di plasmide circolare e faccio semplicemente delle reazioni di PCR. Saranno delle reazioni più lunghe perché devo permettere alla polimerasi di completare tutto il percorso del plasmide inserto. Produco degli strand identici a quelli del plasmide originale ma in quella posizione avrò la mutazione. Questi strand mimetizzati vengono quindi sigillati da una ligasi. Però nonostante io abbia amplificato bene e le molecole con la mutazione siano abbondanti, avrò sempre presente il plasmide originale che non porta la mutazione. Per non avere un mix di plasmidi, quello che si fa è diluire tutta il mix con un enzima, solitamente VPN1, che digerisce solo il DNA metilato e non quello non metilato. La differenza tra un plasmide originale che è stato prodotto in un batterio e quello prodotto in vitro dalla PCR è che il secondo non sarà metilato. Quindi questo enzima digerisce solo il DNA metilato, quindi il DNA originale verrà completamente spezzettato da VPN1. Farò sopravvivere solo il DNA prodotto dalla PCR con la mutazione sito specifica.

Clonaggio alternativo

• Restriction enzymes
• Tailing
• Linkers/Adaptors
• Restriction free cloning
• Recombination

In questi metodi o all'estremità del mio frammento viene legata una piccola sequenza doppio strand, la quale può poi contenere un enzima di restrizione e quindi quando ho legato i miei adattatori io posso digerire e produrre le estremità che mi piacciono. Col tailing al mio frammento blando dalle estremità piatte posso aggiungere un enzima, la trasferasi terminale, che è capace di aggiungere qualche base ma senza utilizzare uno stampo. Lo fa solo per poche paia di basi. Io devo fornire un calco, come un singolo nucleotide.

Nello restriction free cloning non vengono utilizzati enzimi di restrizione, perché il problema di questi enzimi è che dovremo fare un taglio e una ricucitura in un punto specifico senza dover perdere alcune basi. Questo metodo si basa sullo stesso principio della mutagenesi sito specifica, quindi il mio inserto sarà sotto forma di un amplificato sotto PCR e amplificherò questo frammento verde con un...