Genetica e basi di genomica

Genetica

Capitolo 7

Un'espansione della tripletta CGG causa la sindrome dell'X fragile: i pazienti affetti da tale malattia presentano una testa insolitamente grande, orecchie grandi, negli uomini, testicoli di grandi dimensioni e ritardo mentale. Tale espansione porta a un restringimento nel locus del gene FMR1, che è sottoposto a innumerevoli metilazioni silenziandolo, che rendono il cromosoma maggiormente esposto alla rottura. FMRP è una proteina che lega l'RNA e regola la traduzione di un gruppo di mRNA dei dendriti ed è necessaria per il normale procedere della maturazione sinaptica glutamatergica durante lo sviluppo.

Alcuni approcci terapeutici prevedono inibitori delle metil transferasi che mutano l'allele in questione. Presenta, inoltre, sorprendenti caratteristiche di trasmissione: il rischio di ereditare la malattia varia in base al numero di ripetizione della permutazione (alleli per permutazione).

Le mutazioni che portano all'alterazione della regolazione del ciclo cellulare inducono il cancro. Il test di Ames viene utilizzato per analizzare gli agenti chimici che inducono mutazione nelle cellule batteriche e che possono indurre il cancro: es. viene presa una potenziale sostanza mutagena e viene mescolata con una sospensione di batteri mutanti his- su una piastra Petri senza istidina; se nella soluzione risultante sono presenti revertanti his+ allora la sostanza in questione si definisce mutagena e potenzialmente carcinogena. Per testare tali effetti sui mammiferi solitamente si somministra la sostanza a una soluzione di enzimi di fegato di ratto, oppure a una cavia in vivo.

La complementazione avviene quando un individuo eredita una mutazione in geni diversi, mentre quando lo stesso gene presenta i due alleli recessivi (ereditati da entrambi i genitori) il soggetto non riesce a compensare la mutazione e risulta mutante per quel gene. Una collezione di mutanti che non complementano l'uno con l'altro si dice gruppo di complementazione (mutanti per lo stesso gene).

Il genetista Benzer attraverso un esperimento dove impiegò dei batteriofagi T4 su una coltura di batteri E.Coli B e K scoprì che due mutazioni differenti (m1 e m2) per lo stesso gene (rII, il cui effetto fenotipico era dato dalla formazione di placche più grandi e definite e una mancata predisposizione alla lisi dei Coli K) alteravano due regioni differenti dello stesso gene (rIIA1 e rIIA2, la cui ricombinazione reciproca portava al ripristino del gene selvatico). Lo stesso Benzer mappò il gene rII con l'impiego di delezioni in varie zone; se una mutazione puntiforme presente sul cromosoma è compresa o nel tratto interessato della delezione dell'omologo oppure i due omologhi presentano delezioni sovrapponibili, dall'incrocio non si originerà per ricombinazione progenie selvatica; se, invece, è al di fuori dei limiti della delezione o le delezioni non si sovrappongono si potrà ottenere progenie selvatica.

Un gene è una sequenza lineare di coppie di nucleotidi, posta all'interno di una regione distinta di un cromosoma, che denota un'unità funzionale. Durante la mappatura del gene, egli si avvide della presenza di punti caldi (hot spots) che mutano spontaneamente più spesso degli altri (sono facili bersagli di eventi ricombinativi), ma tali siti, spesso, non sono soggetti all'azione di mutageni a causa della loro specificità per particolari sequenze nucleotidiche.

Un microrganismo mutante che può crescere su terreno minimo con il supplemento di un fattore di crescita deficiente, o un composto intermedio che facilita la via metabolica per la produzione di quest'ultimo, è detto auxotrofo; se il supplemento non è richiesto allora si parla di prototrofo per quel fattore.

Alcuni esperimenti eseguiti dagli scienziati George Beadle e Edward Tatum confermarono la loro ipotesi che le mutazioni apportate alla Neurospora Crassa sono dovute al blocco di una via metabolica per la produzione della proteina codificata dal gene mutato (ad esempio l'arginina). Per testare la loro ipotesi saggiarono alcuni mutanti Neurospora non in grado di sintetizzare arginina, quindi auxotrofi per tale amminoacido, e incapaci di crescere su terreno minimo. Le mutazioni auxotrofe, in seguito a un'analisi di ricombinazione, erano state riscontrate in quattro regioni distinte, associate a un gruppo di complementazione differente, definite ARG-E, ARG-F, ARG-G, ARG-H.

Potevano però crescere su un terreno supplementato da arginina o da un composto intermedio mancante a causa della mutazione; dopo aver riconosciuto alcuni tra questi intermedi, o enzimi, schematizzarono la via biosintetica dell'arginina nella Neurospora, potendo affermare che l'alterazione di un gene inerente a una data via metabolica influisce sulla sintesi di un enzima richiesto nell'iter lineare. I processi biochimici però possono risultare anche non lineari e non così semplici da interpretare: infatti un intermedio può essere processato dall'espressione di due geni differenti per convertirlo in due prodotti diversi. Se la cellula per vivere ha bisogno di entrambi questi prodotti, si aggiunge al terreno minimo entrambi gli intermedi; in altri casi questi due intermedi corrispondono a due vie parallele che portano alla sintesi di un unico prodotto. A quel punto la mutazione in un gene non influisce sul fenotipo e per riscontrare aberrazioni entrambi i geni devono essere alterati.

Capitolo 8

Yanofsky scoprì che un codone è costituito da più di un nucleotide grazie all'incrocio di E.Coli, uno mutante per il gene trpA della Trp sintasi e l'altro selvatico: nella progenie ottenuta risultava una complementazione per tale gene data dalla ricombinazione del gene in questione, la quale induceva una sostituzione di un singolo amminoacido o codone. L'intuizione del codice a triplette la ebbero gli scienziati Crick e Brenner che utilizzarono un agente intercalante, la proflavina, che apportava mutazioni nel gene rIIB+ del batterio E.Coli.

Questi due scienziati inconsapevolmente pensavano che la proflavina apportasse sostituzioni nucleotidiche come gli altri mutanti in modo da riscontrare revertanti nella popolazione in questione all'esposizione con altri mutageni. Sorprendentemente le loro congetture furono confutate dalla completa assenza di revertanti sulla piastra che li indusse a ipotizzare che tale mutageno era causa di inserzioni e delezioni. Dallo studio di mutazioni rIIB-, in cui esposero un batterio Coli alla proflavina, si evinsero le seguenti conclusioni: la prima esposizione induceva una mutazione FC0 che, dopo una successiva azione dell'agente, veniva soppressa da una seconda mutazione FC7 conducendo alla conseguente reversione del gene rIIB.

Studi successivi di trasduzione di un revertante con un fago T4 di tipo selvatico portarono alla luce entrambe le singole mutazioni rIIB- causate dal crossing-over tra le due zone alterate del gene. La delezione e l'aggiunta di una coppia di basi, trattata precedentemente, porta alla cosiddetta soppressione intragenica. Essa avviene con mutazioni di segno opposto oppure di segno concorde a multipli di 3 in quanto non viene alterato il modulo di lettura della sequenza nucleotidica. Se la mutazione corrisponde a un'inserzione o a una delezione di una singola base allora si avrà un cambiamento del modulo di lettura che indurrà una mutazione frameshift.

Le mutazioni che portano alla sostituzione di un amminoacido con un altro dalle stesse caratteristiche chimiche sono dette mutazioni di senso conservative; possono anche causare, inoltre, la sostituzione con un amminoacido con proprietà diverse (mutazioni non conservative). Mutazioni non senso comportano la sintesi di proteine tronche poiché sostituiscono un amminoacido con un codone di stop. Grazie alla degenerazione del codice genetico, però, alcune mutazioni comportano la sintesi dello stesso amminoacido non mutato (mutazioni silenti).

Le prime tre mutazioni, a eccezione delle conservative, portano alla perdita di funzione per una data proteina. Individui eterozigoti per un gene possono essere aploinsufficienti perché non producono una quantità sufficiente di quel prodotto genico (come il locus T dei topi che non permette il normale sviluppo della coda in tutta la sua lunghezza); si parla in questo caso di una mutazione data da un allele dominante. Si riscontrano anche alleli dominanti negativi che inibiscono l'attività di un multimero alterando la forma di una o più subunità (allele kinky nei topi la cui proteina mutata si esprime fenotipicamente come un nodo alla coda del topo).

Esistono, inoltre, mutazioni in grado di aggiungere un effetto fenotipico ulteriore all'organismo: si dice ipermorfa se l'allele dominante intensifica la sintesi proteica del gene oppure promuove la sintesi di una forma più efficiente della proteina; mutazioni neomorfe se si genera un fenotipo nuovo apportando un'espressione ectopica della proteina (come il gene Antennapedia la cui mutazione porta all'anormale sviluppo delle zampe posteriori al posto delle antenne nella Drosophila).

Le mutazioni a carico di proteine o RNA coinvolti nell'espressione genica possono compromettere l'efficienza del macchinario di trascrizione di tutti i geni e portano a conseguenze letali per l'organismo in omozigosi. Se più geni codificano per la stessa molecola coinvolta nell'espressione, una mutazione in uno di questi geni non risulterà letale ma potrebbe essere utile. E.Coli trp- esposti a mutageni possono revertire a trp+ grazie alla mutazione di un tRNA della triptofano sintetasi che altera il suo anticodone riconoscendo un codone di stop; risulta, quindi, un tRNA soppressore. Una cellula con tale mutazione può sopravvivere a due condizioni: la concentrazione dei tRNA mutati deve risultare compatibile con la vita e tale molecola deve presentare una bassa affinità con tale codone.

Marshall Nirenberg e Heinrich Matthaei, una volta estratti complessi molecolari che guidavano l'espressione, aggiunsero in provetta degli mRNA sintetici poli-U che scoprirono codificare per fenilalanina (UUU); stessa cosa fecero con la prolina (CCC), lisina (AAA) e glicina (GGG). Poi il chimico Har Gobind Khorana sintetizzò mRNA poli-UC, poli-UUC e poli-UAUC che codificavano per serina e leucina ma non capì subito quali codoni corrispondevano a un dato amminoacido. A questo punto Nirenberg e Philip Leder costruirono mRNA sintetici da 3 nucleotidi a un sistema di traduzione contenente 1 amminoacido radioattivo e 19 non marcati attaccati a tRNA che li versarono attraverso un filtro. Un tRNA che porta un amminoacido corrispondente alla tripletta residente sul mRNA rimane intrappolato nel filtro e manifesta la sua radioattività sul ribosoma: avendo una tripletta CUC e un aminoacido Ser radioattivo, i due capirono che tale tripletta corrispondeva a Leu grazie a un successivo esperimento con Leu radioattivo.

Capitolo 13

La delezione presente in omozigosi (Del/Del) o emizigosi (Del/Y) non è compatibile con la vita a eccezione che la regione interessata è priva di geni essenziali per la sopravvivenza. La delezione in eterozigosi, allo stesso modo, è molto spesso letale poiché conduce a un dosaggio inadeguato dei geni e quindi uno sbilanciamento genico; una mutazione sull'unico allele non deleto porta all'alterazione della proteina e se è coinvolta nel ciclo cellulare può indurre il tumore (a esempio il retinoblastoma, che colpisce il gene RB). Tali rari eventi modificano le distanze di mappa dei geni e durante l'appaiamento di omologhi +\Del il cromosoma normale ricurva la regione deleta sull'altro cromosoma (ansa da delezione). Se sul cromosoma normale è presente l'allele recessivo allora si manifesterà il fenotipo recessivo dando luogo a un fenomeno chiamato pseudodominanza: il manifestarsi di un fenotipo mutante recessivo dimostra una non complementazione perché il cromosoma deleto non può ripristinare la funzione del gene wild-type.

Le duplicazioni (in tandem o non), dovute a errori nel macchinario di replicazione o riparazione, a rotture cromosomiche o a crossing-over ineguali, aumentano le copie di determinate regioni cromosomiche. In organismi Dp/+ le bande ripetute formano anse di duplicazione poiché il cromosoma normale non trova una regione simile con cui appaiarsi con l'omologo e si possono trovare in varie forme con più involuzioni. I crossing-over ineguali provocano la delezione in un cromosoma e la duplicazione nell'altro e può influire negativamente sul fenotipo poiché crea uno squilibrio nei prodotti proteici; questi rari eventi sono stati il fulcro dell'evoluzione di molti geni odierni (e.g. la famiglia genica dell'emoglobina).

Le inversioni (pericentriche, se includono il centromero, o paracentriche) sono date da rotture del DNA riparato in seguito a una rotazione a 180° del filamento o da rari casi di crossing-over in cui i cromosomi omologhi si trovano in posizione invertita. Solitamente non vengono riconosciute in quanto non apportano mutanti fenotipici, in quanto non cambiano l'identità o il numero dei geni, ma se la regione coinvolta è essenziale per la funzione del gene, risulterà una mutazione letale recessiva. Possono inoltre portare il gene in un nuovo ambiente dove solitamente non viene espresso (gene Antennapedia) e possono indurre un effetto di posizione (spostamento del gene da ambiente eucromatico a eterocromatico o viceversa). Possono crearsi anse da inversione per adattamento dell'omologo al gene invertito sul cromosoma; un siffatto crossing-over genera cromatidi ricombinanti non vitali.

Se l'inversione è pericentrica avviene un solo scambio in seno all'ansa e ogni cromatidio, da un solo centromero, avranno rispettivamente una regione deleta e una duplicata creando un dosaggio genico irregolare; se l'inversione è paracentrica i cromatidi ricombinanti formati risulteranno l'uno acentrico e l'altro dicentrico. Le inversioni sono, pertanto, soppressori del crossing-over. Si definiscono cromosomi bilanciatori se contengono inversioni, pericentriche e paracentriche, multiple sovrapposte; una progenie di un Bil/+ non può ereditare un ricombinante tra i due alleli parentali.

Le traslocazioni sono scambi di pezzi di cromosomi con cromosomi non omologhi (traslocazioni reciproche) oppure l'aggiunta di un pezzo di cromosoma su un altro e sono causate da rotture del DNA. Le traslocazioni robertsoniane si distinguono poiché le rotture avvengono al livello del centromero di due cromosomi acrocentrici il cui risultato darà luogo alla formazione di un lungo cromosoma metacentrico e uno piccolissimo con un numero nullo, o quasi, di geni. Le prime, come le inversioni, a meno che non avvengano all'interno di un gene, non provocano cambiamenti fenotipici.

Traslocazioni a livello delle cellule somatiche possono portare all'insorgere del cancro dislocando i protoncogeni. In individui Tr/+, la segregazione cromosomica può produrre dei gameti sbilanciati: durante la profase della meiosi I i cromosomi traslocati e i loro omologhi naturali assumono la forma di una croce formata da quattro cromosomi appaiati. Progenie vitale si ha solamente in caso di segregazione alternata, ovvero quando i traslocati migrano a un polo e i normali all'altro in modo da non causare uno sbilanciamento genico e costituiscono un numero minore del 50% dei gameti totali; si parla, quindi, di semisterilità degli eterozigoti Tr/+. I geni vicini ai punti di rottura sui cromosomi non omologhi mostrano uno pseudo-linkage e si comportano come se fossero associati.

Un ulteriore modo per riarrangiare sequenze nucleotidiche è dato dalla trasposizione: lo spostamento di piccoli tratti di DNA, trasposoni, o attraverso un intermedio ad RNA, retrotrasposoni. In Drosophila vengono utilizzati per mantenere la lunghezza dei cromosomi. Nei mammiferi esistono 2 tipi di elementi trasponibili: SINE, la cui sequenza principale è Alu, e LINE, con sequenza principale L1. I retrotrasposoni si presentano nel genoma con una coda di poli-A al 3' (simile a quella presente sul mRNA processato) o con sequenze LTR al 5' e al 3' ripetute (che ricordano gli RNA dei virus tumorali) con un gene codificante una trasposasi.

La specie di Drosophila isolata da popolazioni naturali appartiene al ceppo P poiché in essi è evidente un elemento trasponibile P non presente nei moscerini di laboratorio, di ceppo M. L'incrocio tra i due ceppi porta a un fenomeno chiamato disgenesi degli ibridi che causa sterilità della prole, mutazioni, rotture cromosomiche e anche la trasposizione degli elementi P in nuove zone del genoma. Gli elementi trasponibili, pertanto, danno luogo a riarrangiamenti cromosomici spontanei: possono indurre la delezione o duplicazione ai lati del trasposone per errori meccanici oppure due copie del trasposone negli omologhi possono appaiarsi in siti simili e creare delezione e duplicazione.

Le aneuploidie si hanno quando dei cromosomi non presentano l'assetto normale diploide. Se si manifesta negli autosomi si può prevedere uno sbilanciamento di elevate dimensioni letale; nell'uomo sono registrati casi vitali di monosomia e trisomia su cromosomi il cui assetto genico è relativamente ridotto (trisomia 18 sindrome di Edwards, trisomia 13 sindrome di Patau, trisomia 21 sindrome di Down). Le aneuploidie del cromosoma X vengono tollerate per la formazione del corpo di Barr anche se producono individui sterili in quanto negli individui XXY l'inattivazione non è effettiva al 100% poiché diversi geni vicini al centromero e al telomero del braccio corto dell'X sfuggono al silenziamento; negli X0, invece, la riattivazione dell'X non avviene in quanto è presente solo un cromosoma e tali individui dispongono di metà dosi funzionali dei geni. Le alterazioni dell'assetto diploide sono date da eventi di non disgiunzione.