Genetica e basi di genomica

Anafase

In questo stadio cellulare i microtubuli si accorciano in direzione dei poli, portando con se’ ciascun

cromatidio e, quindi, l’informazione genetica che migra in un polo e’ esattamente identica a quella

che si muove verso il polo opposto. I cromosomi metacentrici assumono una configurazione

caratterstica a forma di V.

Telofase

Le fibre del fuso si disperdono progressivamente, a ciascun polo si riforma la membrana nucleare,

la cromatina si riaddensa e ricompaiono i nucleoli. Si assiste, in seguito, alla citochinesi o

citodieresi in cui le cellule figlie si separano dalla madre attraverso il restringimento di un anello

contrattile di actina che si forma al centro dividendo le due cellule.

Meiosi

Meiosi I

Profase I

Leptotene

Si osserva un ispessimento dei cromosomi omologhi, i cui cromatidi fratelli sono uniti formando

un’unica entita’.

Zigotene

In questa sottofase ciascun cromosoma si appaia con i suo omologo, creando delle sinapsi, grazie

a una struttura proteica definita complesso sinaptinemale che rende precisa la modalita’

d’appaiamento (in realtà la ricombinazione è stata osservata anche durante se non prima del

leptotene, prima della formazione dei noduli di ricombinazione e, addirittura, anche se viene meno

il complesso sinaptinemale).

Pachitene

I cromosomi omologhi si presentano uniti per tutta la loro lunghezza formando il bivalente o la

tetrade, in cui si ha da un lato il cromosoma di origine materna e dall’altro quello di origine paterna.

Tra i cromosomi X e Y la sinapsi risultera’ incomplata a causa di una zona d’appaiamento limitata.

Lungo il complesso sinaptinemale si originano strutture dette noduli di ricombinazione in cui

avviene lo scambio tra cromatidi non fratelli; questo scambio di materiale genetico tra madre e

padre e’ detto crossing-over.

Diplotene

Si ha il dissolvimento graduale del complesso sinaptinemale e una leggera separazione tra gli

omologhi anche se rimangono legati in alcune regioni dette chiasmi.

Diacinesi

Essa e’ accompagnata da una condensazione dei cromatidi non piu’ ricoperti dalla membrana

nucleare che permettera’ l’appaiamento delle fibre del fuso, che stanno comparendo in questi

stadio.

Metafase I

I cinetocori nei cromatidi fratelli si fondono costituendo un’unica entità che si appaia con i

microtubuli e i cromosomi paterni e materni si dispongono sulla piastra metafasica ai poli opposti.

Anafase I

I chiasmi si dissolvono e i cromosomi possono muoversi sui binari microtubulari verso i poli (i

bivalenti non si disgregano).

Telofase I

Le membrane nucleari ai poli si riformano e, una volta avvenuta la citodieresi, le cellule figlie

posseggono un assetto dimezzato rispetto a quello parentale (divisione riduzionale).

Meiosi II

Simile alla mitosi e, dato la riduzione del corredo, dalla divisione si produrranno quattro cellule

figlie

Esperimenti utili per l’esame di Cencimmerda

- Eredita’ crociata legata al cromosoma X di Morgan

- Esperimento di Stern sulla ricombinazione

- Esperimento di Griffith

- Esperimento di Avery

- Esperimento di Hersey e Chase

- Esperimento di Meselson e Stahl su replicazione semiconservativa

- Test di fluttuazione di Luria-Delbruck

- Esperimento di Muller con i raggi X

- Esperimento di Benzer sulla definizione di gene

- Test di Ames per il cancro

- Esperimento di Beadle e Tatum di un gene un enzima

- Esperimenti di Yanofsky sull’entita’ di codone

- Esperimento di Crick e Brenner su un codone codifica per tre nucleotidi

- Scoperta delle sequenze amminoacidiche da parte di Nirenberg e Matthaei (e poi Kohrana

e Nirenberg-Leder)

- Ipotesi del vacillamento di Crick

- Esperimento su S. subtilis su cotrasformazione

- Esperimento di Lederberg e Tatum

- Esperimento PaJaMo sull’esistenza del repressore nell’operone batterico

Capitolo 15

Anche i mitocondri contengono un DNA circolare proprio che non e’ sottoposto al meccanismo di

eredita’ mendeliana. Questi organelli, contenenti da 5 a 10, fino a 20 molecole di DNA di forma

variabile, a meta’ di ogni generazione cellulare, in generale, si raddoppiano e poi si dividono.

Nell’uomo il mtDNA e’ costituito di 16,5 kb con 37 geni, tra cui 13 codificanti polipeptidi, 22 per

tRNA, 2 per rRNA mitocondriali, compattati l’un l’altro senza interruzioni (introni) e possono anche

sovrapporsi; il filamento pesante (H), ricco di residui guaninici, e filamento leggero (L), ricco in

residui citosinici, contengono due promotori (anse D) che danno inizio alla trascrizione di due

lunghi RNA policistronici. Vi sono notevoli differenze tra il mtDNA e il DNA cellulare in quanto

presenta un apparato traduzionale simile ai batteri e alcune sequenze nucleotidiche non codificano

per gli stessi aminoacidi, ad esempio la tripletta UGA codifica per triptofano e non per un codone di

stop, AGG e AGA codificano per codoni di stop e non per arginina e AUA codifica per metionina e

non per isoleucina. Vi sono differenze anche nella replicazione: il processamento avviene in

seguito all’attivita’ della DNAP gamma che inizia la replicazione a livello dell’ansa D del filamento

H; in un secondo momento un’ulteriore polimerasi inizia il meccanismo analogo partendo dalla

seconda Ori del filamento L (si parla infatti di replicazione asincrona). Molto probabilmente il codice

genetico mitocondriale ha subito divergenza da quello universale per una serie di mutazioni,

avvenute successivamente al momento in cui gli organelli si sono stabiliti per endosimbiosi come

componenti delle cellule eucariotiche. Infatti e’ stato dimostrato che tali informazioni ereditarie sono

10 volte piu’ mutabili di quelle cellulari a causa degli svariati errori verificatisi durante la

replicazione per un meccanismo di riparazione meno efficiente.

La modalita’ di trasmissione del genoma mitocondriale e’ uniparentale, nell’uomo derivante dalla

madre; possono verificarsi anche rari casi di trasmissione paterna dovuti alle dimensioni piu’ ridotte

del mtDNA paterno (solitamente malattie dovute a mutazioni mitocondriali, come la sindrome da

epilessia mioclonica o la neuropatia ereditaria dell’occhio di Leber, sono trasmesse dai geni

materni). Una cellula e’ definta eteroplasmica quando contiene una mescolanza di genomi

organellari; omoplasmica quando contiene lo stesso tipo di genoma. Eccetto per rari casi di

mutazioni, una cellula omoplasmica porta una progenie con un singolo tipo di DNA; una cellula

eteroplasmica da’ vita, in seguito alla mitosi, a una progenie geneticamente variabile che spazia da

una progenie omoplasmica selvatica a una progenie mutante eteroplasmica od omoplasmica per

segregazione indipendente. Affinche’ la mutazione diventi patogenetica la percentuale di molecole

di mtDNA mutate deve essere maggiore del 50% e, inoltre, deve superare un determinato effetto

soglia variabile in base al tipo di tessuto interessato e possono essere affetti da queste patologie

sia gli individui di sesso maschile che quelli di sesso femminile. L’effetto soglia e’ dovuto alle varie

esigenze ossidative del tessuto d’interesse e una volta superato, l’intensita’ sintomatica dipendera’

dalla quantita’ di genomi mutati; tali patologie sono riscontrabili soprattutto a livello nervoso e

muscolare. Si possono diagnosticare anche tessuti con percentuali diversi di mtDNA mutati anche

per segregazione casuale durante le mitosi post-zigotiche. Queste mutazioni possono interessare

geni per la fosforilazione ossidativa (come l’ATP sintasi nella sindrome di NARP), o mutazioni

inerenti ai geni per tRNA (sindrome di MERRF). Il mtDNA puo’ essere utilizzato anche in genetica

forense quando il DNA nucleare e’ particolarmente degradato, soprattutto per la presenza di zone

ipervariabili (regioni HV1 HV2 nel D-loop) che posseggono una frequenza di mutazione di una

volta su 50 generazioni utile per ricondurre un individuo ai suoi legami di parentela materni.

Illumina sequencing system

E’ un metodo innovativo di sequenziamento che sostituisce la PCR e permette di leggere il

filamento scelto su ampia scala in modo molto accurato. I templati da sequenziare sono distribuiti e

immobilizzati su una superficie di celle progettate in modo da consentire l’accesso di enzimi

implicati nella replicazione e di nucleotidi legati a un fluorocromo. Durante ogni ciclo sequenziativo,

ogni singolo dNTP marcato e’ aggiunto alla catena e riconosciuto da un software. Ogni sequenza

attaccata al supporto e’ munita alle sue estremita’ di DNA-linker che sono complementari a

sequenze poste vicino a al templato sulla piattaforma in modo da avere per ogni templato 2 tipi di

sequenze linker. Il DNA singolo filamento presente sulla piastra si ripiega in modo da garantire

l’appaiamento della sequenza linker con l’oligonucleotide omologo nelle vicinanze sulla piastra

costituendo cosi’ il 3’OH per la polimerasi e dare inizio alla replicazione. Una volta sintetizzato il

filamento complementare, si denatura la doppia elica per staccare i due filamenti ottenuti e ripetere

il ciclo piu’ volte portando alla formazione di cluster replicativi. Il primo ciclo, quindi, comincia grazie

all’aggiunta di uno dei quattro terminatori nucleotidici reversibili marcati, dei primers e della DNA

polimerasi in ciascun cluster. In seguito all’esposizione ai raggi laser, la fluorescenza emessa da

ogni cluster formato viene catturata identificando cosi’ la prima base. I cicli marcati vengono ripetuti

per determinare la sequenza di basi in un frammento, una alla volta; i dati vengono poi allineati da

un software e comparati e vengono cosi’ identificate le differenze nucleotidiche tra le sequenze.

Integrazione al capitolo 7

Prima di analizzare la progenie ricombinante, Benzer fece dei test per determinare il locus della

mutazione e il carattere della mutazione: non sapendo se le due mutazioni facessero parte

entrambe di un’unica regione (rIIA) genica o di due regioni diverse (rIIA e rIIB), infetto’ dei Coli K

con 2 tipi di fagi per una delle due mutazioni. Dal test emerse una complementazione delle due

mutazioni (m1 e m2), osservata dalla lisi batterica, che porto’ lo sperimentatore a dedurre la loro

origine da due zone diverse, rIIA e rIIB (configurazione in trans, ovvero su cromosomi diversi). Ma

questa mutazione assumeva un carattere dominante o recessivo? Allo stesso modo Benzer

effettuo’ un controllo della complementazione infettando un’ulteriore colonia di Coli K stavolta con

due fagi, uno mutante per entrambe le aberrazioni e un altro selvatico. I risultati del test rivelarono

una configurazione in cis delle due mutazioni, appartenenti quindi allo stesso cromosoma, e un

carattere recessivo delle mutazioni in quanto venivano mascherate dagli alleli selvatici delle loro

controparti fagiche. Il test, quindi, portava ad affermare una mancata inte