Genetica - Appunti

La cellula

La cellula è il veicolo che contiene le informazioni per l'ereditarietà che definiscono la specie; è in grado di formare una nuova cellula con le stesse informazioni. Ha bisogno di energia libera dall'ambiente, nel momento in cui non se ne procura più, decade verso l'equilibrio chimico. Assume energia dall'ATP.

Cellula procariotica

La cellula procariotica non ha un nucleo definito e circondato da un involucro nucleare, ma ha il DNA, di forma circolare e molto piccolo, libero nel citoplasma e localizzato in una regione che si chiama nucleoide.

Batteriofagi, plasmidi e virus

• Acido nucleico (nel capside) + proteine. Si riproducono infettando procarioti tramite lo stelo.
• Una molecola di DNA circolare o lineare senza membrana. Replicazione autonoma, vivono nelle cellule batteriche.
• Infettano cellule eucariotiche, in modo simile ai fagi.

DNA

Struttura scoperta da Watson e Crick. Le informazioni sono contenute nel DNA, molecola a doppio filamento, senza ramificazioni, composta da quattro monomeri: A, T, C, G. Queste sono le basi (adenina, timina, citosina e guanina) che formano i nucleotidi andando ad unirsi a uno zucchero (deossiribosio). I filamenti sono antiparalleli (5', con una sporgenza, e 3', con un buco, legati tra loro da un legame fosfo-diestere). Si crea una catena polimerica tra zucchero e fosfato e le basi che sporgono di lato; le basi tra loro sono complementari: A si lega a T e C a G, questo definisce la struttura e permette la formazione della struttura a doppio filamento, avvolto in modo destrorso intorno ad un'asse centrale. I legami tra basi (legami idrogeno, 2 tra A e T e 3 tra C e G) sono più deboli di quelli tra zucchero e fosfato, in questo modo i due filamenti possono staccarsi senza spezzarsi e fungere così da stampo per la sintesi di un nuovo filamento.

Scoperta del DNA

Esperimenti

• Esperimento di Griffith: per capire dove risiede la varietà, se nelle proteine o nel materiale genetico, sono stati presi due ceppi batterici (S virulento, R avirulento) e fatti sviluppare separatamente; il ceppo S viene denaturato con il calore, cioè si uccidono i batteri. Somministrato al topo non è mortale. Il ceppo R viene aggiunto a quello S denaturato e somministrato al topo che muore.
• Esperimento di Avery: viene scomposto il ceppo S e aggiunte prima le proteine poi il materiale genetico a due ceppi R. Il topo a cui viene somministrato il ceppo con le proteine non succede nulla, l'altro muore. Conclusione: l'acido nucleotidico è responsabile delle informazioni.
• Esperimento di Hershey e Chase: per capire chi porta l'infezione nei fagi. Usano l'Escherichia coli, fatta da DNA e un involucro proteico. Vengono marcate due colture differenti di fagi, una con P³² e una con S³⁵; i due isotopi si troveranno nelle molecole dei fagi, in particolare il fosforo negli acidi nucleici e lo zolfo nella parte proteica. Con questi fagi marcati infettano due colture batteriche, si formano nuovi fagi marcati. Vengono separati i fagi nuovi e utilizzati per infettare nuove colture; queste vengono poi inserite in una centrifuga per separare la parte proteica dalla parte nucleotidica, che si va a posizionare sul fondo essendo più pesante, si misura la radioattività per vedere dove si trovi la concentrazione più alta. Nel caso del DNA marcato la radioattività era maggiore sul fondo della provetta. Conclusione: la parte che trasmette l'informazione è il DNA.

Esprimere l'informazione

Esprime l'informazione usandola per guidare la sintesi di nuove molecole, ciò avviene attraverso la formazione di nuovi polimeri come l'RNA e le proteine. Il DNA è racchiuso in un nucleo delimitato da un involucro nucleare formato da due doppi strati lipidici, perforati da grandi pori nucleari, ed è direttamente collegato alle membrane del reticolo endoplasmatico; è supportato da una lamina nucleare.

Geni

Segmenti di DNA codificano specifiche proteine o varianti di esse, sono i geni. Ad intervallarli ci sono tratti di DNA regolatore, cioè non codificante che però serve per regolare l'espressione di geni adiacenti e controllarne l'azione. Geni che codificano per proteine o molecole di RNA importanti (sequenze regolatrici) sono conservati nel tempo, cioè è difficile che subiscano cambiamenti. I geni sono fatti da esoni, introni e sequenze regolatrici di DNA (esprimono un gene solo in sequenze, tempi e cellule appropriate). Grazie a studi sulla Drosophila si è arrivati a capire che i geni risiedono sui cromosomi, strutture filamentose che diventano visibili quando la cellula inizia a dividersi; sono fatti di DNA e proteine.

• Strutture filamentose che diventano visibili quando la cellula inizia a dividersi; sono fatti di DNA e proteine. Ogni cromosoma presenta una sequenza che agisce da origine della replicazione (ce ne sono molti sui cromosomi eucariotici); una seconda sequenza, il centromero, che permette a ciascun cromosoma duplicato e condensato di andare in una cellula figlia; una terza sequenza che forma i telomeri che permettono la replicazione delle estremità del cromosoma. I cromosomi materno e paterno di una coppia sono detti omologhi (46 cromosomi: 22 coppie e 2 cromosomi sessuali).
• Nucleosoma: complesso DNA-proteine, lo si può vedere srotolando la cromatina, che ha una struttura a filo di perle e in cui le perle sono le particelle centrali del nucleosoma (DNA avvolto intorno ad un nucleo proteico fatto di istoni relativamente piccoli e basici cosicché si possano legare al DNA). Enzimi isolano i nucleosomi dalla cromatina, il DNA linker viene degradato e si può vederne la struttura (8 proteine istoniche a coppie uguali H2A, H2B, H3, H4). Uno dei primi compattamenti del DNA è quello sotto forma di fibra da 30nm permesso dall'istone H1; il livello finale è il cromosoma mitotico (due cromatidi fratelli uniti all'altezza del centromero).
• Genoma: totale dell'informazione genetica di una cellula contenuta nel DNA per sintetizzare proteine e RNA; viene interamente duplicato quando la cellula si divide in due figlie. Il genoma non contiene solo l'informazione, ma ha anche un'azione di controllo sull'utilizzo di questa informazione. Ridondanza genetica: geni correlati possono essere funzionalmente intercambiabili; in questo modo ci sono molti geni di ricambio che possono mutare per servire a nuovi scopi.

Cromatina

Il complesso di DNA e proteine si chiama cromatina e si divide in due tipi: eterocromatina ed eucromatina. La prima è più condensata e si trova maggiormente nei telomeri e nei centromeri, non è attiva trascrizionalmente ma può essere ereditata epigeneticamente. È importante la posizione di un gene, perché determina se questo è silenziato o meno. La cromatina ha una struttura a filo di perle. I cromosomi sono compattati in anse di cromatina, a sua volta condensata. I cromosomi hanno una struttura altamente condensata nella fase mitotica; i cromatidi fratelli sono uniti a livello del centromero. La condensazione dei cromosomi mitotici è il livello finale del compattamento della cromatina (filo di perle; fibra di cromatina di 30nm; cromosomi estesi; cromosomi condensati; cromosomi mitotici). La condensazione è molto importante perché così è più semplice la divisione durante la mitosi e le molecole di DNA sono protette. La condensazione avviene grazie alla condensina, un complesso proteico che usa l'energia idrolizzata da ATP per avvolgere le molecole di DNA di ciascun cromosoma interfasico per produrre i due cromatidi di un cromosoma.

Il materiale genetico può essere trasferito orizzontalmente nei procarioti, ad esempio attraverso i virus che fungono da vettori per i geni (DNA virale può coesistere nell'ospite come plasmide). Le regioni nucleolari sono fatte di RNA e proteine che circondano i geni in trascrizione dell'RNA ribosomale; nel nucleolo avviene la maturazione e l'assemblaggio dei ribosomi. Ci sono sequenze altamente ripetute, mediamente ripetute e uniche. Le prime possono essere anche zone molto piccole, 4-7 nucleotidi, ripetute in tandem, solitamente nelle regioni del centromero e dei telomeri; sono chiamate anche sequenze satellite. Inoltre ci sono anche sequenze molto più piccole, chiamate SSR, che si dividono in minisatelliti e microsatelliti. Questi ultimi si possono trovare sia sugli esoni che sugli introni. Le sequenze altamente ripetute costituiscono la maggior parte dell'eterocromatina e formano i deserto genici, regioni a cui non è ancora stata attribuita una funzione. Le sequenze mediamente ripetute sono parti mobili di corta o lunga dimensione e possono spostarsi o produrre se stesse e per queste ragioni sono molto diffuse nel genoma eucariote, circa il 5%. Sono identificabili in pseudogeni o trasposoni. Le sequenze uniche sono sequenze che si riscontrano una volta sola nel genoma e sono i geni che codificano la maggior parte delle proteine eucariote.

Mantenimento di sequenze di DNA

Impedire che avvengano cambiamenti nel DNA permette la sopravvivenza a breve termine; permettere che avvengano modificazioni permette la sopravvivenza a lungo termine. Una mutazione può cambiare permanentemente il DNA (un batterio mostra una mutazione di un cambiamento nucleotidico ogni 10⁹ nucleotidi per divisione cellulare).

Replicazione del DNA

Duplicazione di vaste quantità di informazione genetica, sotto forma di DNA. Questo processo deve avvenire prima che una cellula si divida in due cellule figlie. Avviene durante la fase S del ciclo cellulare. I due filamenti devono essere separati per far sì che ognuno possa fungere da stampo per altri filamenti che si legano grazie alla complementarietà delle basi (replicazione semiconservativa). La DNA polimerasi è un enzima che lega un nucleotide ad un altro complementare tramite un legame fosfo-diestere e può sintetizzare solo in direzione 5'-3'; inoltre può allungare un filamento di DNA o di RNA, ma può farlo solo a partire dal 3' verso il 5' e aggiungendo nucleotidi, mai creando filamenti nuovi dal nulla.

Il punto in cui avviene la replicazione si chiama forcella di replicazione ed ha una struttura asimmetrica; all'altezza di questa si trovano i frammenti di Okazaki, pezzi di DNA lunghi 1000-2000 nucleotidi che vengono polimerizzati solo in direzione 3'-5' e servono durante la sintesi del filamento ritardato (la polimerizzazione avviene in direzione opposta a quella generale). Le forcelle di replicazione possono operare indipendentemente su ciascun cromosoma ma formare due eliche figlie di DNA. Quelle che si attivano prima, facendo iniziare prima la replicazione, sono quelle in cui la cromatina non è altamente condensata in eterocromatina. Una sequenza di DNA che può fungere da origine di replicazione deve contenere un ORC, sito di legame per una proteina iniziatrice multisubunità, un tratto ricco di A e T e siti di legame per proteine che aiutano ad attrarre ORC. Alcune elicasi si assemblano sul complesso ORC-DNA per formare un complesso prereplicativo in fase G1; all'inizio della fase S le Cdk si attivano, inibendo il complesso prereplicativo, che si potrà formare solo nella successiva fase G1, e dando inizio alla replicazione. Dietro la forcella di replicazione devono essere sintetizzati nuovi nucleosomi da proteine istoniche, durante la fase S; nuovi e vecchi nucleosomi si uniscono. Perché inizi la replicazione nel filamento leader deve esserci un primer all'inizio; perché inizi sul filamento ritardato è necessario che vi sia un primer all'inizio di ogni frammento di Okazaki. Quando la DNA polimerasi incontra un nuovo primer fatto di RNA (è più semplice eliminare frammenti di RNA che potrebbero non essere perfetti, che lasciare frammenti di DNA non corretti) termina la sintesi del frammento precedente. L'RNA primer è formato dalla DNA primasi, un sistema di riparazione del DNA elimina il primer e l'enzima DNA ligasi unisce l'estremità 3' al 5' per creare un filamento uniforme (dopo la cosiddetta cucitura all'indietro). Perché la replicazione avvenga i filamenti devono essere divisi nel punto che si chiama origine della replicazione (più probabile che si trovi in zone ricche di A-T), questo lavoro è fatto dalla DNA elicasi, una proteina che idrolizza ATP per potersi spingere in avanti e dividere così i filamenti; si può muovere in entrambe le direzioni. Questi enzimi sono aiutati dalle SSB (proteine che legano il DNA a singolo filamento) che fanno in modo che i due filamenti non si richiudano né il singolo filamento si pieghi su se stesso. È presente un'altra proteina accessoria fatta ad anello, la pinza scorrevole, che si lega alla DNA polimerasi e la tiene attaccata al DNA finché si muove, poi quando incontra una doppia elica la rilascia. Questo è possibile grazie al caricatore della pinza, che idrolizza ATP mentre carica la pinza su una giunzione primer-stampo (sul filamento leader rimangono attaccate a lungo, sul filamento ritardato si stacca ogni volta che incontra un'estremità 5' su un frammento di Okazaki e si riattacca ad un RNA primer sul frammento successivo). Le proteine lavorano tutte insieme e a stretto contatto a livello della forcella di replicazione. Il sistema di riparazione delle basi male appaiate dirette da filamento permette di eliminare eventuali errori, eliminando la parte di frammento nuovo errata e risintetizzandone uno nuovo. Nelle cellule eucariotiche il punto in cui lavorare è identificato da delle interruzioni, nick, nel filamento. Le DNA topoisomerasi sono proteine che creano un perno nell'elica del DNA, servono per far rilasciare il superavvolgimento. Topoisomerasi I: produce una rottura a singolo filamento che permette alle due sezioni dell'elica di ruotare libere attorno al legame fosfodiestere, che fa da perno; questo si può poi richiudere velocemente e senza ulteriore dispendio di energia perché è conservata dal legame covalente che tiene unita la topoisomerasi ad un fosfato del DNA. Topoisomerasi II: produce una rottura a doppio filamento perché si lega covalentemente con entrambi i filamenti, si lega al sito di incrocio e idrolizza ATP per poter creare un varco nel DNA, farci passare un'elica e risaldare la rottura. Risolve anche i problemi di aggrovigliamento.

È molto importante che non avvengano errori ed esistono parecchi meccanismi di correzione. La DNA polimerasi attua un doppio controllo dell'esatta geometria di appaiamento delle basi, in quanto l'appaiamento corretto è favorevole energeticamente e quindi tende ad avvenire più spesso e, dato che l'enzima deve subire un cambiamento conformazionale attorno al sito attivo, è più probabile che avvenga se non ci sono errori. Inoltre ha un'azione esonucleasica di correzione delle bozze 3'-5', cioè elimina i residui non appaiati finché non arriva ad un'estremità 3'-OH, quella necessaria perché possa iniziare la replicazione in quanto fa da primer (funziona da enzima autocorreggente). Quando la forcella raggiunge un'estremità di un cromosoma lineare non c'è posto per creare un RNA primer per iniziare l'ultimo frammento di Okazaki sulla punta, ma gli eucarioti hanno sequenze nucleotidiche speciali (GGGTTA) alla fine dei cromosomi, incorporate nei telomeri; queste sequenze vengono riconosciute dalla telomerasi che allunga questa sequenza in direzione 5'-3' usando uno stampo di RNA, a questo punto si può completare la replicazione grazie alla DNA polimerasi che utilizza l'estensione come stampo. L'estremità 3' del DNA è sempre più lunga dell'estremità 5' grazie all'azione di una nucleasi e la sporgenza forma un'ansa t, in modo che si possa riconoscere che è la parte terminale di una molecola di DNA e non un frammento spezzato. La lunghezza dei telomeri funge da strumento di misura per il numero di divisioni cellulari e quindi controlla la durata della vita; quando una cellula raggiunge il numero massimo di divisioni arriva poi alla senescenza replicativa cellulare.

Riparazione del DNA

Possono avvenire cambiamenti spontanei che porterebbero a mutazioni se non ci fossero i meccanismi di riparazione. La struttura a doppio filamento permette di mantenere sempre una copia corretta dell'informazione, anche se uno dei due filamenti fosse danneggiato. Ci sono diverse vie per riparare il DNA ma il procedimento è sempre simile: il danno viene escisso, il filamento non danneggiato viene usato da una DNA polimerasi per ripristinare la sequenza originale e la rottura viene saldata da una DNA ligasi.

• Riparazione per escissione delle basi (BER): sono coinvolti enzimi DNA glicosilasi che riconoscono una base alterata (sondano le facce della base grazie al giramento dell'elica) e catalizzano la rimozione, lasciando libero da una base uno zucchero; interviene poi l'AP endonucleasi che taglia l'ossatura fosfodiestere e il danno viene poi ricucito. Per la depurinazione.
• Riparazione per escissione di nucleotidi (NER): un complesso multienzimatico cerca l'errore nella doppia elica, l'ossatura fosfodiestere viene tagliata su entrambi i lati e l'errore eliminato da una DNA elicasi. La DNA polimerasi e la DNA ligasi riparano il taglio. Per errori voluminosi, come un dimero di timina.
• Riparazione accoppiata alla trascrizione: mentre le RNA polimerasi vanno avanti si accorgono di un errore nel filamento di DNA, in quel momento interviene il macchinario di riparazione, che è stato portato sul sito lesionato dalla RNA polimerasi che ha usato proteine accoppiatrici.
• Riparazione tramite DNA polimerasi di back-up: le polimerasi di back-up sono meno accurate, infatti possono aggiungere uno o pochi più nucleotidi per ripristinare l'errore, in quanto non hanno la funzione esonucleasica e hanno un basso potere discriminante.