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RIPARAZIONE DEL DNA

Possono avvenire cambiamenti spontanei che porterebbero a mutazioni se non ci fossero i

meccanismi di riparazione. La struttura a doppio filamento permette di mantenere sempre

una copia corretta dell'informazione, anche se uno dei due filamenti fosse danneggiato. Ci

sono diverse vie per riparare il DNA ma il procedimento è sempre simile: il danno viene

escisso, il filamento non danneggiato viene usato da una DNA polimerasi per ripristinare la

sequenza originale e la rottura viene saldata da una DNA ligasi.

Riparazione per escissione delle basi (BER): sono coinvolti enzimi DNA glicosilasi che

• riconoscono una base alterata (sondano le facce della base grazie al giramento

dell'elica) e catalizzano la rimozione, lasciando libero da una base uno zucchero;

interviene poi l'AP endonucleasi che taglia l'ossatura fosfodiestere e il danno viene poi

ricucito. Per la depurinazione.

Riparazione per escissione di nucleotidi (NER): un complesso multienzimatico cerca

• l'errore nella doppia elica, l'ossatura fosfodiestere viene tagliata su entrambi i lati e

l'errore eliminato da una DNA elicasi. La DNA polimerasi e la DNA ligasi riparano il taglio.

Per errori voluminosi, come un dimero di timina.

Riparazione accoppiata alla trascrizione: mentre le RNA polimerasi vanno avanti si

• accorgono di un errore nel filamento di DNA, in quel momento interviene il macchinario

di riparazione, che è stato portato sul sito lesionato dalla RNA polimerasi che ha usato

proteine accoppiatrici.

Riparazione tramite DNA polimerasi di back-up: le polimerasi di back-up sono meno

• accurate, infatti possono aggiungere uno o pochi più nucleotidi per ripristinare l'errore, in

quanto non hanno la funzione esonucleasica e hanno un basso potere discriminante. Il

vantaggio è che possono intervenire appena una polimerasi replicativa si accorge dello

sbaglio.

Unione non omologa delle estremità: può succedere che ci sia una rottura su entrambi i

• filamenti, in questo caso si devono riunire le estremità e legarle assieme, ma questo

comporta una perdita di alcuni nucleotidi (cicatrice).

Ricombinazione omologa: fra una coppia di sequenze omologhe di DNA avviene lo

• scambio genetico; è utilizzata per riparare il DNA, anche quando vi è un taglio su

entrambi i filamenti; si aspetta che il DNA si sia duplicato e poi si usa un cromatide

fratello come stampo per aggiustare l'altro (usata durante la replicazione del DNA,

durante la fase S e G2).

Ricombinazione trasposizionale: gli elementi mobili sono chiamati trasposoni e gli enzimi

• specifici trasposasi, questi li portano su un nuovo sito bersaglio del DNA che può trovarsi

in molti posti sul genoma. Ci sono tre tipi di trasposoni: 1) trasposoni a solo DNA; 2)

retrotrasposoni similretrovirali e 3) retrotrasposoni non retrovirali.

1) possono trasporsi solo in cellule che già li portano e spostarsi da una all'altra grazie al

trasferimento genetico orizzontale

RICOMBINAZIONE OMOLOGA

Ha tre funzioni importanti: riparare errori nel doppio filamento che possono derivare da

radiazioni ma anche da forcelle di replicazione bloccate o rotte; scambiare pezzi di

informazione genetica tra due cromosomi per creare nuove combinazioni di sequenze di

DNA; durante la meiosi, assicurare la segregazione accurata dei cromosomi. Nel primo

caso ci possono essere molti fattori, ad esempio un nick davanti ad una forcella di

replicazione che porta alla formazione di un cromosoma figlio rotto e uno intatto.

La caratteristica fondamentale è che avviene solo tra DNA che hanno sequenze simili

cosicchè l'appaiamento delle basi possa controllare i due filamenti. Un problema è la

perdita di eterozigosità quando si usa l'altro omologo cromosomico per riparare la

sequenza di DNA; un altro è quando si ha un'alterazione in una proteina accessoria che

può portare ad una riparazione inefficiente e quindi ad un accumulo di danni e ad una

frequenza più alta di mutazioni. Nei batteri aumenta la sintesi di enzimi di riparazione del

DNA utili per la risposta SOS, incline però all'errore e che può portare ad una mutazione

favorevole per la popolazione, non per la singola cellula.

Quando si usa la ricombinazione omologa per creare molecole di DNA con una nuova

sequenza, si passa attraverso uno stadio intermedio, noto come giunzione di Holliday, in

cui due dei quattro filamenti di DNA condivisi da due eliche cambiano partner. Usando

l'energia di idrolisi di ATP i quattro filamenti possono cambiare la posizione del punto di

incrocio; alla fine, per avere due nuove

eliche, si ha un processo chiamato risoluzione,

in cui le due eliche vengono tagliate.

Si ha ricombinazione omologa anche

durante la meiosi, con il crossing over e la

conversione genica. Una proteina specializzata

taglia entrambi i filamenti di uno dei cromosomi,

rimanendo attaccata al DNA spezzato finchè

una nucleasi non la fa staccare e non

modifica le estremità, lasciando sporgere la

3'. Invasioni del filamento e migrazioni del punto

di incrocio producono una giunzione doppia di

Holliday che si può risolvere in due modi.

Il primo prevede che le coppie originali siano

tagliate entrambe all'altezza delle due

giunzioni causando la separazione delle due

eliche originali in una forma alterata, a parte

la regione tra le due giunzioni, in cui

ciascuna elica contiene una regione

eteroduplex adiacente ad una omoduplex. Il

secondo prevede il crossing over, cioè le

regioni a monte e a valle delle due giunzioni sono scambiate. Un controllo del crossing

over impedisce che ve ne siano nelle zone circostanti ad uno già presente.

La ricombinazione omologa porta a conversione genica, cioè una divergenza nella

distribuzione attesa degli alleli durante la meiosi.

Se c'è un numero significativo di basi male appaiate, il sistema si correzione di basi male

appaiate se ne accorge e impedisce che avvenga il crossing over.

DAL DNA ALLE PROTEINE

Una porzione di DNA viene copiata in RNA, tramite un processo che si chiama

trascrizione; le copie sono usate come stampi per dirigere la sintesi di proteine in un

processo chiamato traduzione (dogma centrale). Per alcuni geni il prodotto finale è RNA.

TRASCRIZIONE

Da un gene si possono ottenere più copie di RNA e da una sequenza di RNA si possono

sintetizzare più proteine. Copiare una porzione della sequenza nucleotidica di DNA, un

gene, in una sequenza nucleotidica di RNA si definisce trascrizione perchè la forma

chimica è diversa, ma il linguaggio è sempre lo stesso. La trascrizione ha inizio srotolando

una piccola porzione di doppia elica per esporre le basi di un filamento che agirà da

stampo; in questo modo la sequenza nucleotidica è determinata dalla complementarietà

con la sequenza di DNA. Quando si forma il trascritto, queso non rimane attaccato tramite

legami idrogeno al filamento di DNA, ma si slega, cosicchè si possa riformare la doppia

elica; per questo l'RNA è a singolo filamento ed è più breve e inoltre un gene può produrre

molte copie di RNA. Gli enzimi si chiamano RNA polimerasi e catalizzano la formazione di

legami fosfodiestere tra nucleotidi, non hanno bisogno di un primer (la trascrizione non

deve essere accurata come la replicazione); la catena si allunga in direzione 5'-3'. Se c'è

un errore la polimerasi torna indietro e il sito attivo esegue una reazione di escissione in

cui si usa acqua al posto di un pirofosfato.

Inizio della trascrizione: nei batteri si ha una sola RNA polimerasi oloenzima, in cui ci sono

un fattore sigma e il nucleo dell'enzima, che si lega con forza quando trova un promotore

sul DNA. Senza dispendio di energia apre un poco la doppia elica e inizia ad allungare la

catena di RNA finchè non incontra un terminatore, dove sono

rilasciati entrambi i filamenti. Le sequenze di termine sono ricche

di A-T e di strutture che trascritte in RNA si ripiegano a forcina; i

legami U-A non sono abbastanza forti, così il DNA si stacca dalla

polimerasi. Nei nuclei eucariotici sono presenti tre RNA

polimerasi, RNA polimerasi I, RNA polimerasi II e RNA polimerasi

III. La prima e la terza trascrivono geni codificanti tRNA, rRNA e

piccoli RNA, ma è la seconda quella che codifica per più geni. Ha

bisogno di fattori generali di trascrizione che la posizionano sul

promotore, separano i due filamenti di DNA e la rilasciano

quando la trascrizione è iniziata. Il promotore è ricco di T e A e

per questo viene chiamato TATA box, si trova 25 nucleotidi piû in

su rispetto al sito di inizio. A questo sito si legano più fattori, il

primo è il TFIID tramite la subunità TBP, alla quale si lega anche

TFIIB, poi c'è il TFIIH che usa ATP per aprire la doppia elica ed

esporre lo stampo nella bolla di trascrizione; dopo questi tre si

lega la RNA polimerasi II e si forma un complesso di inizio della

trascrizione; infine la TFIIE e la TFIIH che fa in modo che la

polimerasi si possa staccare dal promotore per dare il via alla

trascrizione. La polimerasi II rimane nel promotore a sintetizzare

RNA finchè non subisce cambiamenti conformazionali che le

permettono di entrare nella fase di allungamento. Attivatori

trascrizionali si legano a sequenze specifiche di DNA e aiutano

ad attrarre la RNA polimerasi II; questi comunicano con la

polimerasi II e con i fattori trascrizionali grazie ad un Mediatore.

La trascrizione inizia sul filamento da 30nm di cromatina, quindi

servono enzimi che la modifichino.

Fase di allungamento: non procede regolarmente; ci sono fattori di allungamento, proteine

che fanno in modo che la polimerasi non si stacchi prima di aver finito e che la aiutano a

muoversi. La polimerasi che va avanti sul DNA provoca un superavvolgimento positivo

davanti a sè e uno negativo dietro di sè, ogni 10 coppie di nucleotidi aperte. Il

superavvolgimento rende più difficile aprire l'elica, ma facilita lo svolgimento del DNA nei

nucleosomi.

Maturazione dell'mRNA: Le estremità dell'RNA sono modificate (al 5' viene aggiunto un

cappuccio di un nucleotide guaninico modificato e al 3' avviene poliadenilazione) e gli

introni sono rimossi tramite lo splicing. Il processo di fosforilazione della coda della RNA

polimerasi permette di staccarla da proteine presenti nel punto di inizio della trascrizione e

di legarla a proteine utili per l'allungamento. Capping: L'aggiunta del cappuccio

all'estremità 5' avviene tramite tre enzimi: un RNAfosfatasi rimuove uno dei tre fosfati

dall'RNA nascente, lasciandone due; una guanil trasferasi aggiunge un GMP in legame

inverso, cioè 5'-5'; l'azoto in posizione 7' della guanosina viene metilato dalla metil

trasferasi. Il cappuccio serve per distinguere un mRNA da tutti gli altri tipi e perchè

avvenga il riconoscimento e l'aggancio da parte del ribosoma. Poliadenilazione: Quando la

polimerasi II finisce la trascrizione, provvede perchè venga modificata anche l'estremità 3'.

Una sequenza AAUAAA indica che deve avvenire in quel punto il taglio nucleotidico da

parte di CSTF. Vengono poi aggiunti circa 10 A, cioè una coda che serve da guida per

l'aggiunta di successivi A da parte di PAP che è aiutato da CPSF. Il processo è aiutato da

fattori che stimolano la poliadenilazione e ha come scopo quello di favorire l'esportazione

dal nucleo. Lo Splicing serve per rimuovere le sequenze introniche dopo la trascrizione in

RNA (gli introni sono le parti non codificanti, che intervallano le regioni di esoni). Solo dopo

questo meccanismo il pre-mRNA diventa mRNA. Ogni evento elimina un introne ed unisce

i due esoni adiacenti utilizzando ATP, attraverso due successive reazione di

transesterificazione. Il sito di splicing 5' viene riconosciuto dalla U1, le due subunità di

U2AF si legano, una al segmento pirimidinico, l'altra al sito 3'. La BBP si lega al sito di

ramificazione. La U2 sposta la BBP, andando a legarsi al sito di ramificazione e formando

un complesso A, che viene spinto fuori dalla doppia elica di RNA lasciando un nucleotide

libero disponibile per la reazione con il sito 5'. La seconda fase prevede il riarrangiamento

del complesso A per riavvicinare i tre siti di splicing, attraverso molti passaggi. La U4, U5 e

U6 si legano al complesso, la U5 in modo più blando, formando il complesso B che viene

rilasciato dalla U1 e rimpiazzato al sito 5' dalla U6. È così completato l'assemblaggio. U4

viene rilasciato dal complesso così che U6 possa interagire con U2 e formare il complesso

C che da forma al sito attivo (che si forma solo nei casi di splicing corretto). L'interazione

U2-U6 forza il distacco dell'adenina. Può avvenire la prima reazione di transesterificazione

perchè il sito attivo è vicino al sito 5'. Si forma il cappio perchè l'adenina presente sul sito

attivo si lega al 5'. La seconda reazione avviene grazie a U5 che avvicina i due esoni dei

siti 5' e 3'. Infine l'mRNA e le snRNP vengono rilasciate. Lo spliceosoma è un complesso

di molecole di RNA e proteine, il cui nucleo è formato da un piccolo ribonucleoproteina

nucleare (snRNP), a sua volta formato da sette subunità proteiche e piccoli RNA nucleari

(snRNA; U1, U2, U4, U5, U6). Il riconoscimento dei tre siti avviene grazie all'interazione tra

l'unità del nucleo dello spliceosoma e sequenze consenso di RNA sul pre-mRNA. Lo

spliceosoma subisce spostamenti in cui le interazioni tra coppie di basi vengono rotte e

sostituite; il riarraggiamento di RNA-RNA richiede idrolisi di ATP e serve per formare il sito

catalitico attivo dello spliceosoma, fatto principalmente da RNA (dopo che i componenti

dello splicing si sono già assemblati sul pre-mRNA). Il prodotto dello splicing viene

rilasciato e il disassemblaggio delle snRNP dal cappio prevede altri riarrangiamenti RNA-

RNA. Quando lo splicing è terminato lo spliceosoma dirige delle proteine a legarsi

all'mRNA vicino alla posizione occupata prima dall'introne, questo complesso della

giunzione degli esoni indica uno splicing riuscito e interviene nell'indicare il destino

dell'mRNA. Lo spliceosoma si lega al pre-mRNA mentre questo è ancora sintetizzato dalla

RNA polimerasi, quindi può controllare gli esoni e gli introni. La definizione dell'esone

serve per scegliere il sito appropriato; si usano le dimensioni uniformi degli esoni per

marcare a partire dal 5' dell'RNA il sito di splicing. Entrambi questi meccanismi avvengono

mentre la polimerasi sta allungando l'estremità 3'. mRNA processing (maturazione

dell'RNA) prevede tre possibili

modificazioni: aggiunta del cappuccio al

5' dell'mRNA; nucleotidi contenenti

adenina aggiunti al 3' e splicing,

normale e alternativo. 1) è

fondamentale perchè il ribosoma lo

riconosca e per proteggere le estremità

dell'mRNA. 2) vengono aggiunti fino a

100 nucleotidi A, poliA, grazie

all'enzima poliA-polimerasi che

riconosce il tratto giusto e li aggiunge;

anche questo ha una funzione

protettiva. Editing dell'RNA (modifica

del messaggero maturo per dare nuovi

messaggi,fa parte della maturazione

dell'mRNA) altera le sequenze nucleotidiche di trascritti di RNA una volta trascritti e quindi

ne cambia il messaggio. Gli RNA guida contengono l'informazione su come deve essere

modificato l'RNA iniziale; hanno un'estremità 5' complementare con la zona in cui deve

avvenire l'editing. L'RNA viene tagliato, vengono aggiunti nucleotidi U all'estremità 3'

spezzata e poi l'RNA viene legato. Nei mammiferi ci sono due meccanismi che mediano

l'editing: deaminazione enzimatica di adenina per produrre inosina e deaminazione di

citosina per produrre uracile. Nella prima agisce un enzima chiamato ADAR ch riconosce

una regione a doppio filamento di RNA dove si trova una sequenza complementare che

dice dove deve avvenire l'editing; provocando un cambiamento di un amminoacido nella

sequenza della proteina codificata dall'mRNA, questa altera la permeabilità dei canali

ionici per gli ioni calcio. Nella seconda c'è l'esempio della apolipoproteina B del fegato che

può avere due forme diverse e quindi funzioni differenti a seconda se si trova nel fegato, e

quindi è completa, o nell'intestino, dove è tronca a causa dell'amminazione che modifica

un codone che codificava per la glutammina in un codone di stop. Se i cambiamenti

avvengono in regioni codificanti si può produrre una proteina tronca o può cambiare la

sequenza degli amminoacidi perchè cambiano tutte le proprietà di appaiamento delle basi.

Cambiamenti negli schemi di splicing dovuti a mutazioni casuali sono molto importanti per

l'evoluzione di geni e organismi.

Solo l'mRNA maturo è utile alla cellula e lo si può riconoscere dalle proteine presenti e

mancanti; poi si può trasportare dal nucleo al citosol per essere tradotto in proteina. Quello

modificato in modo inappropriato rimane nel nucleo, dove è eliminato da esonucleasi 3'-5'.

Gli mRNA modificati con successo diffondono direttamente o tramite recettori di trasporto

nucleare, attraverso i complessi dei pori nucleari.

Gli RNA più abbondanti nelle cellule sono gli rRNA e sono sintetizzati da RNA polimerasi I;

servono per sintetizzare ribosomi e sono il prodotto prodotto finale del gene per l'rRNA. Il

nucleolo è il sito di assemblaggio di ribosomi e di modificazione di rRNA.

TRADUZIONE

Molecola di mRNA viene tradotta in proteina; ma i nucleotidi sono quattro e gli

amminoacidi venti e quindi si seguono le regole del codice genetico. La sequenza di

nucleotidi nella molecola di mRNA è letta in gruppi di tre; il codice è ridondante e alcuni

amminoacidi sono specificati da più di una tripletta. Un gruppo di tre amminoacidi nell'RNA

si chiama codone e specifica un amminoacido o un segnale di stop. I tRNA fanno da

adattatori ad amminoacido e codone, legandoli entrambi su due siti sulla loro superficie. I

tRNA ha una struttura a trifoglio che mostra molto bene gli accoppiamenti complementari

tra basi e questi creano la doppia elica. Quando il tRNA ha una struttura ad L ci sono due

regioni di nucleotidi non appaite alle estremità: l'anticodone è una serie di tre nucleotidi

che si lega con il codone complementare sull'mRNA; l'altra è una sequenza al 3' a cui si

lega l'amminoacido tramite amminoacil-tRNA sintetasi (ne esistono 20, una per ogni

amminoacido) che utilizza l'energia liberata dall'idrolisi di ATP; è il primo adattatore che si

incontra nella traduzione, il secondo è il tRNA stesso. Molti meccanismi controllano che si

uniscano correttamente, come il fatto che l'amminoacido corretto ha più affinità e quelli più

grandi non possano legarsi; un secondo controllo è quello idrolitico: il tRNA forza

l'amminoacido in una tasca della sintetasi che rigetta quello giusto ma fa passare quelli

correlati, che vengono idrolizzati da AMP e rilasciati. Prima che i tRNA possano andare nel

nucleo devono essere accorciati e passare per lo splicing, ma questi possono avvenire

solo se è ripiegato correttamente a trifoglio.

Una proteina viene sintetizzata dall'estremità N-terminale all'estremità C-terminale, che

rimane attiva grazie all'attacco a tRNA (si spezza ogni volta che viene aggiunto un

amminoacido ma si ricompone subito con quello nuovo). Così ogni amminoacido ha

energia per aggiungerne uno nuovo. La sintesi delle

proteine avviene nei ribosomi, formati da subunità

che si formano nel nucleolo da proteine ribosomali

e rRNA e che poi si assemblano nel citoplasma

(subunità minore: dove tRNA e mRNA si adattano;

subunità maggiore: dove si formano i legami

peptidici. Sulla subunità maggiore ci sono tre siti: P

(dove si associa il tRNA), A (dove si legano gli

amminoacidi al tRNA) ed E (dove il tRNA viene

rilasciato). Si inseriscono dei tRNA. Il sito A attende

l'arrivo di nuove triplette da codificare; il sito P tiene

salda la sequenza amminica rilasciandola solo quando A ha

sintetizzato un nuovo amminoacido). RNA polimerasi I produce 18s, 5,8s e 28s che

derivano da 45s; subunità maggiore sono 5,8s, 5s e 28s formano la 60s; 18s forma la 40s

che è la subunità maggiore. Si arriva a 80s che è il ribosoma. rRNA formano il nucleo del

ribosoma e il nucleolo è il sito di modificazione e aggregazione del ribosoma. Le due

subunità si uniscono solo quando deve essere sintetizzata una proteina; quando si

incontra un sito attivo l'mRNA viene tirato e si aggiungono amminoacidi, usando i tRNA

come adattatori, finchè non si incontra un codone di stop. Ci sono quattro passaggi: si lega

un tRNA; si forma un legame peptidico; si sposta la subunità maggiore e poi la subunità

minore, spostando così l'mRNA di tre nucleotidi e resettando il tutto. I fattori di

allungamento EF1 ed EF2 idrolizzano GTP e rendono la sintesi proteica molto più veloce,

oltre a controllare l'esattezza degli appaiamenti. La correttezza delle corrispondenze

codone-anticodone è applicata dal ribosoma tramite un meccanismo basato sull'RNA:

rRNA della subunità minore forma legami H con codone-anticodone e quando si ripiega,

solo se è corretto, scatena idrolisi di GTP.

Inizio della traduzione: il passaggio di inizio è l'ultimo punto in cui la cellula può decidere

se l'mRNA deve essere tradotto e la proteina sintetizzata. Il codone di inizio è AUG e serve

un tRNA iniziatore che porta metionina che associa all'estremità N-terminale (la prima

sintetizzata). Il complesso tRNA-metionina è caricato sulla subunità minore assieme ad

altre proteine che ne permettono l'assemblaggio; queste poi si staccano per lasciare posto

alla subunità maggiore. Si attacca un altro tRNA. È la subunità minore, legata ai fattori di

inizio, che cerca il codone AUG, ma non sempre si attacca al primo, secondo un

meccanismo chiamato leaky scanning che permette di produrre due o più proteine, che

differiscono per l'N-terminale, dalla stessa molecola di mRNA. Sequenza Coszach negli

eucarioti contiene AUG, funge da sequenza segnale. Nei procarioti c'è la Shine-Dalgarno

ed è l'analoga di Coszach. Servono per far riconoscere quale AUG utilizzare.

Fine della traduzione: segnalata dalla presenza di uno dei tre codoni di stop (UAA,

UAG,UGA) al ribosoma. I fattori di rilascio si legano al ribosoma e catalizzano l'aggiunta di

una molecola d'acqua, viene così liberata la catena polipeptidica e la proteina completa è

rilasciata nel citoplasma. Il ribosoma rilascia le due unità che sono pronte per una nuova

sintesi. I fattori di rilascio sono simili al tRNA e possono così entrare nel sito A per far

terminare la traduzione.

mRNA eucariotico: monocistronico

mRNA procariotico: policistronico

La catena polipeptidica passa da un ribosoma ad un altro, quando il primo ha tradotto

abbastanza mRNA, e si trovano sotto forma di poliribosomi. Questo permette di formare

molte più proteine in meno tempo. Perchè la sintesi proteica sia accurata è necessario un

dispendio di energia, ma anche quando è aggiunto un amminoacido errato o un tRNA

sbagliato si lega al ribosoma vi è dispendio extra di energia.

È necessario che mRNA errati non possano essere sintetizzati, per questo devono agire

meccanismi di controllo; il più efficace è la degradazione dell'mRNA mediata da nonsenso

ed entra in azione quando la cellula si rende conto che una molecola di mRNA ha un

codone nonsenso, cioè di stop, nel posto sbagliato. Man mano che la traduzione procede,

i complessi della giunzione degli esoni sono spostati dal ribosoma; quando si arriva

all'ultimo esone, se è presente un codone di stop e non ci sono più EJC, l'mRNA passa

l'ispezione e viene rilasciato nel citosol. Se invece sono presenti degli EJC quando

incontra il codone di stop, l'mRNA viene degradato. Alcune proteine si ripiegano appena

escono dal ribosoma, formando subito una struttura secondaria; da qui avvengono molti

aggiustamenti delle catene laterali e si può arrivare alla struttura terziaria non appena il

ribosoma rilascia il C-terminale. Le proteina hanno però bisogno di chaperoni molecolari

che le aiutino nel ripiegamento, cosicchè evitino di diventare vicoli ciechi mal ripiegati.

Molti sono chiamata proteine dello shock da calore, Hsp, e le più conosciute sono le

Hsp60 e le Hsp70. Sono simili perchè hanno affinità per le zone idrofobiche di proteine

non completamente ripiegate (sono le zone che creano più danni se esposte, perchè

possono formare grossi aggregati) e idrolizzano ATP, ma sono diverse sotto altri aspetti: le

Hsp70 si legano precocemente; le Hsp60 formano una botte in cui le proteine possono

entrare per ripiegarsi correttamente. Se i tentativi di ripiegare la proteina non vanno a buon

fine interviene la via proteolitica. Il proteasoma è una proteasi dipendente da ATP che

distrugge anche le proteine aberranti del reticolo endoplasmatico; il nucleo è un cilindro

cavo formato da quattro anelli eptamerici impilati, e ciascuna estremità è collegata ad un

complesso proteico che fa entrare le proteine da degradare nel nucleo e le svolge

idrolizzando ATP. Le proteine da degradare sono riconosciute dal proteasoma perchè sono

legate covalentemente ad una proteina chiamata ubiquitina. L'ubiquitina si lega alla

proteina bersaglio tramite un enzima attivatore dell'ubiquitina e enzimi che coniugano

l'ubiquitina; si forma così una catena di poliubiquitina legata ad una lisina della proteina

substrato. A volte alcune proteine devono essere degradate perchè si deve ristabilire un

equilibrio in base alle richieste della cellula (distruzione regolata).

Teoria del vacillamento: il codone, sull'mRNA, e l'anticodone, sul tRNA, per appaiarsi

devono essere complementari, ma è possibile che l'ultima delle tre basi, cioè quella al 5'

che si lega con il 3', non sia perfettamente giusta, e quindi il terzo legame vacilla, ovvero

non è forte e stabile come i due precedenti. Questo però non porta all'interruzione della

trascrizione e della traduzione e significa che sono necessari meno tRNA di quanti mRNA

ci sono (61), proprio perchè uno stesso tRNA può appaiarsi a più codoni.

Breve sintesi

Nel nucleo: inizio della trascrizione; cappuccio al 5', allungamento, splicing; taglio,

poliadenilazione, terminazione; esportazione

Nel citosol: degradazione dell'mRNA; traduzione; completamento della sintesi proteica,

ripiegamento della proteina; possibile degradazione della proteina

RNA

Lo zucchero è il ribonucleico e si lega con quattro basi: Uracile, Adenina, Citosina,

Guanina complementari tra loro. È una struttura a filamento singolo e lineare, flessibile,

cosicchè si possa ripiegare su se stessa se ci sono sequenze complementari. I trascritti di

RNA sono prodotti in massa e monouso, a differenza del DNA che è fisso.

RNA messaggeri (mRNA) sono molecole di RNA copiate dai geni del DNA che dirigono

• la sintesi di proteine

RNA ribosomali (rRNA) sono molecole di RNA che formano il nucleo dei ribosomi e

• catalizzano la sintesi proteica, maggior parte dell'RNA di una cellula

RNA transfer (tRNA) sono molecole di RNA che fungono da adattatori tra mRNA e

• amminoacidi durante la sintesi proteica

RASSEGNA DEL CONTROLLO DEI GENI

Differenziamento cellulare dipende da cambiamenti nell'espressione genica, non da

cambiamenti nella sequenza nucleotidica del genoma.

L'espressione genica può essere regolata in vari modi: controllo trascrizionale, controllo

delle modificazioni dell'RNA, controllo del trasporto e della localizzazione dell'RNA,

controllo traduzionale, controllo della degradazione dell'mRNA u e controllo dell'attività

delle proteine. Solo il primo assicura che non si sintetizzino intermedi superflui, tutti gli altri

sono post-trascrizionali.

MOTIVI CHE LEGANO IL DNA NELLE PROTEINE CHE REGOLANO I GENI

Regolazione genica nei procarioti: c'è una regione di controllo chiamata promotore, che

contiene un operatore, sequenza di DNA, che funge da interruttore per far si che la RNA

polimerasi si leghi o no al promotore. Inoltre il gene regolatore codifica per la proteina

repressore, che può ostacolare l'attività dell'operatore legandosi al promotore. L'inizio

della trascrizione è regolata da attivatori e repressori, come avviene nel Lac operon, ma

può essere inibito anche un repressore, cosicchè la trascrizione possa iniziare.

Lac operon (nei batteri) è sotto controllo positivo e negativo da parte del repressore Lac e

CAP (permette ai batteri di usare fonti di carbonio alternative, come lattosio se non c'è

glucosio). CAP induce l'espressione del Lac operon solo in presenza di lattosio e il

repressore Lac mantiene spento il tutto in sua assenza. Il Lac operon quindi è espresso

solo in presenza di lattosio e in assenza di glucosio. LacZ, il primo gene del Lac operon,

codifica l'enzima beta-galattosidasi, che demolisce il lattosio in galattosio e glucosio. Il

gene i produce il repressore, che quando silega al gene operatore, impedisce la

trascrizione dell'operone. L'aggiunta di lattosio fa aumentare l'allolattosio, che si lega al

repressore e impedendone l'attacco all'operatore, cosicchè la trascrizione possa

procedere. Se il glucosio scarseggia viene prodotto AMP ciclico, che segnala la mancanza

di fonte di energia, si lega a CAP e fa aumentare la trascrizione. L'aggiunta di glucosio fa

diminuire la produzione di AMP ciclico che non legandosi più a CAP spegne l'operon,

perchè si stacca dalla proteina (+ lattosio, operon acceso; + glucosio, operon spento). Il

Lac si può legare a più operatori contemporaneamente, cosicchè la repressione sia più

alta; questo è possibile grazie al fatto che si formano della anse di DNA, che permettono

anche interazioni tra proteine che si trovano lontane tra loro mentre sono disposte lungola

doppia elica di DNA.

+ glucosio - lattosio: repressore attivo, CAP inattiva e trascrizione inibita

+ glucosio + lattosio: repressore e CAP inattivi, quindi trascrizione ridotta

- glucosio + lattosio: repressore inattivo e CAP attiva, trascrizione al massimo

- glucosio - lattosio: repressore e CAP attivi, non c'è trascrizione

Regolazione genica negli eucarioti: un singolo promotore può ricevere più segnali da zone

diverse e poi convergerle tutte per formare tratti di mRNA. È molto più complessa in

quanto le cellule eucariotiche hanno proteine regolatrici di geni che possono agire a grandi

distanze, ciascun gene deve essere regolato individualmente, ci sono più operatori, ma

non sono presenti gli operoni. Regione di controllo di un gene: intero complesso di DNA

coinvolto nella regolazione della trascrizione di un gene, comprendente promotore (dove si

assemblano fattori di trascrizione e polimerasi) e sequenze regolatrici che leggono

specifiche sequenze di DNA. Molto DNA funge da spaziatore, cioè è utile per formare anse

quando i fattori di trascrizione si trovano lontano dalla regione di inizio. Gli enzimi

necessari per la maturazione dell'mRNA si trovano sulla coda dell'RNA polimerasi.

Lo stato di condensazione della cromatina può regolare l'inizio della trascrizione, in quanto

l'eterocromatina non può essere trascritta. I nucleosomi devono essere disassemblati dal

promotore in modo che la trascrizione possa avere inizio dal momento che c'è spazio

perchè si possa assemblare un complesso di trascrizione. Il DNA in un nucleosoma è

dinamico perchè può avvolgersi o srotolarsi parecchie volte per essere disponibile per

altre proteine. I complessi di rimodellamento della cromatina dipendenti da ATP si legano

al nucleo proteico del nucleosoma e al DNA avvolto e utilizzano idrolisi di ATP per spostare

quest'ultimo e permettere un cambio conformazionale del nucleosoma, in modo che il DNA

sia legato in modo meno stretto. È così catalizzato lo scorrimento dei nucleosomi che

porta il DNA all'attacco con nuove proteine. Alcuni complessi sono in grado di sostituire

degli istoni con altri modificati o sostituire un intero nucleo ottamerico.

Ci sono due modi per compattare i nucleosomi: la modificazione degli istoni e il

rimodellamento della cromatina. 1) gli istoni del nucleosoma contengono code di lisina che

sporgono e, dato che sono cariche positivamente, interagiscono con il DNA e compattano i

nucleosomi. Ma l'acetilazione delle lisine toglie le cariche positive, riducendo l'interazione

con il DNA e impedendo il compattamento dei nucleosomi. Possono intervenire i

repressori che fanno arrivare gli enzimi per la deacetilazione. 2) possono essere

riorganizzati gli istoni in modo da favorire o sfavorire l'assemblaggio del complesso di

trascrizione.

Perchè i geni possano essere attivati per la trascrizione è necessario che gli isotni

vengano acetilati, il DNA venga metilato, la cromatina decondensata, i cromosomi srotolati

e rimosso l'H1. Infine devono essere aggiunte o rimosse specifiche proteine di

regolazione.

Controllo trascrizionale

Regola la scelta di sequenze geniche da specificarsi e quale messaggero debba formarsi

a partire da un gene. È più conveniente bloccare la trascrizione se un gene non deve

essere espresso, piuttosto che inattivare la proteina che lo codifica. Si possono individuare

geni costitutivi (sempre espressi), geni specializzati (presenti solo in alcune cellule) e geni

ad espressione condizionata (che vengono espressi solo in certi casi, ad esempio gli

anticorpi che vengono espressi in presenza di un antigene). Una delle prime forme di

controllo è attuata dai fattori generali di trascrizione che devono legarsi al promotore, dove

è contenuta la TATA box, per poter attirare la RNA polimerasi. I fattori possono agire anche

a grandi distanze grazie al ripiegamento della doppia elica.

Alcune proteine si posizionano sul DNA, anche molto lontano dal promotore, e ne

inibiscono o ne inducono la trascrizione; questa dipende da elementi cis ed elementi trans.

I primi si possono trovare al 5', al 3' o in sequenze introniche, cioè direttamente sul DNA, e

possono essere riconosciute da elementi trans, che sono capaci di legare il DNA (fattori

trascrizionali). Gli elementi cis possono essere promoter minimi, promoter prossimali o

enhancer. 1) sequenze nucleotidiche a monte del gene che contengono la TATA box; 2)

sono distanti circa 200 paia di basi dal sito di inizio della trascrizione; è necessario che si

ripieghi perchè possa iniziare la trascrizione; 3) collocati anche a 1000 paia di basi dal sito

di inizio. Tutti e tre migliorano la trascrizione e attivano più velocemente i promotori e a

questi si legano degli attivatori di geni eucariotici.

I fattori trans (attivatori) sono proteine regolatrici con due domini, uno che riconosce la

sequenza specifica di DNA e permette di legarsi fortemente e di farne cambiare la

struttura, e l'altro che velocizza l'inizio della trascrizione. Ci sono domini proteici sui fattori

di trascrizione che leggono e legano una sequenza di DNA, come elica-giro-elica (due

alfa-eliche tenute insieme da una corta catena di nucleotidi, di cui una si inserisce nel

solco maggiore della doppia elica), omeodominio (tre alfa-eliche, di cui due formano un

motivo a elica-giro-elica, di cui la terza si inserisce nel solco maggiore), a dita di zinco (usa

una alfa-elica per riconoscere il DNA e ha un atomo di zinco come elemento strutturale

che tiene unite eliche e beta-foglietto), a cerniera di leucine (due alfa-eliche che

onteragiscono attraverso residui di leucine) e a elica-ansa-elica (due corte alfa-eliche

legate da una regione ad ansa). La loro funzione principale è quella di legare tutti i fattori, il

Mediatore e la polimerasi assieme in modo più veloce. Perchè possano assemblarsi sul

DNA deve essere presente un elemento cis. Inoltre modificano la struttura della cromatina

per favorire l'inizio della trascrizione tramite modificazione covalente degli istoni,

rimodellamento dei nucleosomi, rimozione e sostituzione dei nucleosomi. Le modificazioni

della cromatina possono subito essere inattivate, ripristinando le condizioni iniziali, in geni

che è necessario accendere e spegnere velocemente, oppure possono persistere più a

lungo. Le proteine attivatrici si può dire lavorino sinergicamente in quanto possono far

aumentare di valori molti alti la velocità della reazione, se lavorano assieme. Ci sono

anche proteine che inibiscono i geni e queste funzionano una per ogni gene e non

competono con la RNA polimerasi per raggiungere il DNA. Singole proteine regolatrici

possono fare da inibitori o da attivatori in base al complesso in cui operano. Sono presenti

degli isolatori che impediscono alle proteine regolatrici di influenzare altri geni che non

siano quelli su cui si trovano; se uno di questi si trova tra un promotore e un enhancer,

impedisce che il secondo agisca sul primo. Inoltre le sequenze barriera impediscono alla

cromatina di diffondere nei geni che devono essere espressi.

Alcune regioni regolatrici scattano come interruttori al primo segnale, altre reagiscono a

vari segnali; sono tutte formate da brevi tratti di DNA a sequenza definita e da proteine

regolatrici dei geni (fattori di trascrizione). Questi ultimi accendono o spengono serie di

geni, legandosi a sequenze di DNA posizionate vicino ai geni che regolavano.

I fattori di trascrizione possono riconoscere informazioni sulla sequenza da fuori l'elica,

senza doverla aprire, come accettori e donatori di legami idrogeno e zone idrofobiche; si

legano principalmente alla scanalatura principale perchè qui gli schemi sono

sostanzialmente diversi. Brevi sequenze nucleotidiche fungono da siti di riconoscimento

per l'attacco di proteine specifiche, cioè fanno da componenti per gli interruttori genetici.

Le interazioni DNA-proteina sono molto specifiche e forti, grazie alla grande affinità tra la

superficie della proteina e alla superficie della doppia elica.

Gli attivatori trascrizionali, o proteine attivatrici di geni, funzionano secondo il controllo

positivo, cioè la forma attiva che lega il DNA attiva i geni. Legandosi possono agire

selettivamente, cioè controllando i geni che portano una sequenza riconosciuta dalla

proteina. I repressori e gli attivatori possono essere spenti o attivati grazie all'attacco o al

distacco di un ligando (regolazione positiva e negativa).

Controlli post-trascrizionali: partono dal controllo della maturazione dell'mRNA (splicing,

splicing alternativo, capping, poliadenilazione). Inoltre operano dopo che la RNA

polimerasi si sia legata al promoter e abbia iniziato la trascrizione. L'attenuazione della

trascrizione fa in modo che alcuni geni non vengano espressi, ma possono intervenire

proteine regolatrici che si legano all'RNA e inibiscono l'attenuazione. Opera anche

nell'HIV; quando ha finito di trascrivere e le condizioni di crescita virale sono ottimali, la

terminazione prematura è impedita da una proteina, che fa in modo che la polimerasi non

possa interrompersi prima del dovuto.

Lo splicing alternativo porta a proteine diverse codificate dallo stesso gene e può essere

regolato, cioè non avviene a caso. Ci può essere un controllo negativo (una proteina

repressore si lega all'RNA e impedisce che il macchinario dello splicing operi o che si leghi

ad una sequenza, dovendone trovare un'altra che altera lo schema) o postivo (al

macchinario di splicing serve una proteina attivatriche che lo aiuti a levare una sequenza

intronica). È un meccanismo tipico dei batteri.

Esempio: operone del triptofano. L'operone trp è reprimibile, cioè inibisce la sintesi di

enzimi di una via anabolica qualora i prodotti di questa siano disponibili. Si distinguono le

regioni dell'operatore, del promotore, dei cinque geni strutturali (trpA, trpB, trpC, trpD, trpE)

e della regione leader trpL contente un attenuatore att che precede i geni strutturali.

L'espressione dell'operone è controllata da due meccanismi: il triptofano funge da

corepressore perchè attiva il repressore che si lega all'operatore inibendo l'inizio della

trascrizione, quando è presente una gran quantità di prodotto; l'attenuazione avviene

quando c'è povertà di triptofano.

Attenuazione: la prima porzione ad essere trascritta è la regione leader, circa 162

nucleotidi, ed è quella che deve regolare il tutto, cioè dire se la trascrizione deve essere

attenuata o continuare così. La sequenza leader può essere divisa in quattro regioni 1 2 3

4. Le regioni 3 e 4 si appaiano formando una forcina ricca di CG e costituiscono la regione

dell'attenuatore, cioè il punto in cui vi è la fine della trascrizione. Anche le regioni 2 e 3 si

possono appaiare ma non fanno terminare la trascrizione. Per determinare quale

accoppiamento deve avvenire, interviene la regione 1, che appena trascritta viene tradotta

in un peptide leader di 14 aa di cui due triptofani mentre la RNA polimerasi continua a

trascrivere. Se il triptofano è presente in grandi quantità, la traduzione continua superando

i codoni del triptofano nella sequenza leader e termina prima che la regione 3 possa

essere tutta sintetizzata. In questo modo il ribosoma si ferma sulla regione 2 e ne

impedisce l'appaiamento con la regione 3, quindi quest'ultima si può appaiare con la

regione 4 e attenuare la trascrizione. Se il triptofano è presente in piccole quantità, il

ribosoma si ferma sulla regione 1 in corrispondenza dei codoni del trp, perchè mancando il

trp mancano anche i tRNA che legano questo amminoacido, e quindi la regione 2 si può

legare con la regione 3 e far andare avanti la trascrizione. Gene: sequenza di DNA

trascritta come singola unità che codifica una serie di catene polipeptidiche strettamente

correlate. Scansione che perde (leaky scanning) è il fenomeno per cui non viene utilizzato

il primo codone AUG, ma il secondo o il terzo perchè migliori; viene usato per produrre due

o più proteine strettamente correlate, differenti soltanto per i loro amminoterminali. Le

cellule possono iniziare lontano dall'estremità 5' dell'mRNA anche grazie al sito interno di

ingresso dei ribosomi (IRES). L'incappucciamento, la poli-Adenilazione, lo splicing e

l'editing sono tutti processi che servono per la maturazione dell'mRNA.

Geni espressi: dove c'è una sequenza definita di mRNA perchè quel gene è attivo; si parla

di territori di espressione

Geni costitutivi: sempre presenti perchè probabilmente hanno funzioni fondamentali

Geni ad espressione condizionale: possono essere indotti

Geni specializzati: presenti in tessuti specifici, possono essere costitutivi o condizionali

Controllo traduzionale: determina quando e quanto un mRNA deve essere tradotto. vi è il

controllo della localizzazione di un mRNA in un determinato sito, quale e quanto deve

essere tradotto, la longevità di un mRNA. Sono pressnti delle regioni non tradotte che si

trovano ad entrambe le estremità e sono la sede della maggior parte dei complessi di

controllo (UTR) e indirizzano l'mRNA e ne inibiscono o attivano la traduzione.

MEIOSI

Processo specializzato di divisione nucleare che porta alla formazione di quattro cellule

aploidi che formeranno poi i gameti (uova e spermatozoi). È utile per la riproduzione

sessuata perchè all'ultimo stadio prevede che due cellule aploidi si fondano a formare una

cellula diploide non uguale ai genitori, lo zigote, cioè una cellula fecondata. Vengono

prodotte due serie complete di cromosomi che contengono autosomi, comui a tutti i

membri di una specie, e cromosomi sessuali, che dipendono dal genere dell'individuo. Le

copie di ciascun autosoma sono cromosomi omologhi e vivono indipendentemente tra

loro, tranne durante la mitosi che devono subire ricombinazione omologa che serve

perchè ciascun cromosoma contenga una miscela unica di informazioni paterne e

materne. La riproduzione sessuata è vantaggiosa perchè aiuta ad una varietà che

potrebbe incrementare la sopravvivenza in determinate condizioni; inoltre si possono

eliminare geni deleteri cosicchè una popolazione che si riproduce sessualmente abbia


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DETTAGLI
Esame: Genetica
Corso di laurea: Corso di laurea in biotecnologie (Facoltà di Agraria, di Farmacia, di Medicina e Chirurgia, di Medicina Veterinaria e di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali)
SSD:
Università: Torino - Unito
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher cochiluna di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Genetica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Torino - Unito o del prof Altruda Fiorella.

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