Genetica applicata

Enzimi di restrizione

Lezione 1

Enzimi di restrizione sono degli enzimi che troviamo nei microrganismi. Hanno la funzione di tagliare il DNA (endonucleasi), tagliano DNA estraneo, ed è una sorta di sistema immunitario. Il sistema di restrizione-modificazione è dove l'enzima riconosce la sequenza e taglia.

EcoR1 potrebbe trovare la stessa sequenza di 6 basi nel DNA cromosomiale. Questo DNA è protetto da una metilasi, viene metilato, in questo caso metila la A nel sito di restrizione e l'ER non riesce più a tagliare. (questo avviene nel DNA del Coli) Quando entra un DNA virale, non è metilato in quella posizione, quindi l'ER è in grado di tagliare e degradare il DNA del batteriofago. Questo dipende da quanti batteriofagi. Il batterio tende a difendersi in questa maniera qua.

Il primo esperimento risale agli anni '70. Sono stati presi due plasmidi, uno è stato linearizzato e tagliato con EcoR1, l'altro plasmide è stato fatto in 4 frammenti differenti (tagliati con lo stesso enzima). Hanno inserito i pezzi nel vettore (ha una origine Ori di replicazione). Il plasmide aveva una resistenza alla tetraciclina, uno dei pezzi dell'altro plasmide aveva una resistenza all'ampicillina. Hanno clonato a caso ed ognuno di questi pezzi era libero di legarsi al plasmide e diveniva chiuso. È stato piastrato in presenza della ligasi (consuma ATP), hanno trasformato le cellule del Coli e l'hanno piastrata su ampicillina e tetraciclina. Se era entrato il pezzo con l'ampR, avrei avuto la resistenza all'ampicillina. Se non avesse introdotto quel frammento, non sarebbe cresciuto nulla. Questa è la creazione di una molecola che prima non esisteva in natura, con ampR e tetR: la prima molecola chimerica, è un clonaggio, inserisco un gene in un vettore.

Il primo esperimento ha dato il nome restrizione-modificazione (10 anni prima dell'altro), con E.Coli e Lambda. Ha fatto capire che esistevano gli ER. Hanno preso i 2 ceppi di Coli, B e K, e l'hanno infettati con il fago lambda. Quando infetto un batterio con un fago, ottengo delle placche di lisi (osservabili sulla piastra, ci dice che i batteri sono morti). Hanno rimesso il fago, sia su Coli B che sulla piastra di Coli K, il fago veniva da Coli B. Efficienza di piastramento = 1, dall'altra parte ho dieci alla 4 volte di meno. Da una parte il Coli mi è cresciuto, dall'altra parte è stato ristretto. Poi hanno fatto l'esperimento inverso. Se il fago si trova in quel ceppo, il fago che esce da quel ceppo, porta le modificazioni del ceppo B, dall'enzima Eco-B, il superstite (tanti saranno stati tagliati). Quando lo rimetto nello stesso ceppo, se porta le modificazioni nei punti giusti, è protetto. Non è una modificazione permanente del fago.

Tipi di enzimi di restrizione

Ci sono 3 tipi diversi di ER. Quelli che ci interessano, come EcoR1, sono del secondo tipo. Frequenze degli enzimi nei vari organismi: 1%, 98% di tipo 2 (sono quelli che si maneggiano in maniera più semplice, sono delle singole proteine, necessitano del magnesio, oltre il tampone, sono di facile uso) > 1%. Gli altri 2 hanno un problema: il sito di riconoscimento e quello di taglio non corrispondono. Il lavoro di clonaggio è un lavoro molto preciso, per cui tipo 1-3 non potrebbero mai essere usati. Gli ER del secondo tipo riconoscono e tagliano all'interno del sito di riconoscimento (4-8 basi, molto piccolo). Quelli del primo e terzo tipo usano composti strani come catalizzatori della reazione.

Enzimi di restrizione di tipo 2

Disponiamo di 3000 enzimi, più di 250 venduti dalle aziende. Molti non sono specie specifici, possiamo trovarli in organismi diversi ma che tagliano nello stesso punto (detti anche isoschizomeri). In un catalogo, abbiamo il nome dell'enzima, le lettere tipo Eco sta per l'organismo (E.Coli), il sito di restrizione, già tagliato. Possono tagliare in 3 modi diversi: 5' protruding (il 5' fuoriesce), 3' protruding (sporgente), piatto (5' e 3' stanno sullo stesso livello). La maggior parte degli enzimi sono 5' protruding. La sequenza è corta, 4-8 nucleotidi e palindromica. Molti enzimi che lavorano sul DNA sono Mg²⁺ dipendenti (la maniera più semplice per bloccare la reazione di un ER, contiene il DTA che chela il magnesio).

Il tipo 2s, come Fok1, sono degli enzimi che riconoscono una sequenza, ma tagliano lontano (circa una 20 di basi), si possono usare, a noi ci interessa dove è avvenuto il taglio. L'ER taglia entrambi i filamenti. Nel caso del tipo 2s ho un nick. L'ER non si attacca al DNA e taglia i 2 filamenti, ma va in giro a cercare la sequenza target e va nickando (quando ce n'è parecchio, nicka di qua e di là, per cui il DNA sarà completamente tagliato!!). La reazione lascia un fosfato da una parte e l'OH al 3': ci servirà per la marcatura del DNA, al 3' OH sarà possibile estendere la molecola.

Frequenza degli enzimi di restrizione

Mi fa capire, quando taglio il DNA, quanti pezzi mi aspetto. ¼, perché ci sono 4 basi, quindi è la frequenza delle basi, essendo 4. Sau3A, ho un taglio ogni 256 basi. (¼)⁴. BamH1: ¼ alla sesta, per cui ho un taglio ogni 4 kb. Assumendo che ho il 25% di A/T, G/C. Not1 (raro da 8): escono pezzi grossissimi. N: ci posso mettere qualsiasi base, per cui Hind ha ¼ alla 4 e poi ½ alla seconda. HpaII, in un virus SV40 taglia 1 volta, e nel plasmide pBR322 ha 26 siti.

Definizione di unità

Quando compriamo un ER, arriva il tubo, è fondamentale l'attività dell'enzima (correlata alla quantità di enzima venduto, potrebbe essere più o meno attivo). Più DNA ho e più enzima dovrò mettere. Una unità è uguale alla quantità di enzima x che taglia in un'ora 1 microgrammo di DNA in 60 minuti a condizioni ottimali (col tampone suo, venduto insieme, e nelle condizioni di T corrette, normalmente tagliano a 37°). Questo ci permette di decidere più o meno in base alla stima di DNA, quanto enzima devo mettere. Star activity: Se c'è troppo enzima per troppo tempo: taglia specifici. L'enzima lo compro ad unità. Tutti gli enzimi possono tagliare:

• 5' protrudente (EcoR1): l'estremità 5' è protrudente, fosfato al 5' e OH al 3'. La maggior parte tagliano a 5' protrudente: avendo un 3' OH, è come se fosse un primer, un enzima come klenow (il frammento della Pol1) permette di riempire il sito, aggiungere le 4 basi, trasformando un'estremità in piatta.
• 3' protrudente (il più usato, Pst1): non è possibile farlo a partire dal fosfato. Non c'è nessun enzima in natura che fa questo lavoro.
• Blunt (piatto): sono in numero ridotto. Il vantaggio di un blunt è che 2 enzimi, anche se diversi, le estremità possono essere legate. La reazione di ligasi di un blunt è più difficile che quella di un protruding.

Isoschizomeri

Sono enzimi che vengono da organismi diversi ma riconoscono lo stesso sito di taglio. La sequenza GATC è presente in tutti e 3 gli enzimi in questo caso. Bisogna stare attenti perché in Sau c'è N: potrebbe esserci qualsiasi nucleotide. Bisogna stare attenti quando rilegiamo 2 frammenti di DNA tagliati con 2 isoschizomeri, perché le estremità sono compatibili, GATC si appaia, (nell'ER il sito viene sempre mantenuto, può essere ritagliato con lo stesso ER), ma in questo caso, devo guardare bene le sequenze. Se ho tagliato Sau3A e BamH1, il sito BamH1 è perso o conservato? N sono tutti e 4, per cui se in quel punto, c'è una G il sito BamH1 viene conservato. Quindi sì o no a seconda di N. Se rilegato BglII con Bam, non rimane nessun sito. Normalmente si clona con lo stesso enzima. Palindrome: se la leggo da sinistra a destra e destra sinistra del frammento sotto, sono uguali. Può essere interrotta, con una N in mezzo, non è detto che sia perfetta.

Dam metila la A in GATC

Dcm metila la C

Il sito GATC o CCAGG, possono coincidere con il sito dell'ER. Se ci sono degli enzimi che hanno queste sequenze, possono essere influenzati dalla metilazione e non funzionare. Sono sensibili alla metilazione. Esempio Cla1. In dam- il problema non c'è. È importante guardare il genotipo del ceppo in cui si fa il clonaggio. Se dam+, esempio Cla1, nel suo sito di restrizione, la dam metila la A, per cui non taglia. Devo vedere sul catalogo se ho a che fare con un ER sensibile alla metilazione. Alcuni enzimi, nonostante la metilazione, funzionano. Esempio Sau3A1 (riconosce lo stesso sito di Mbol, ma Mbol è sensibile, Sau insensibile).

Esempio di un catalogo: sticky ends (protruding), sticky vuol dire appiccicose. Negli enzimi è molto importante: T e tampone. Alcuni tagliano a basso, medio, alta concentrazione di sale. Questo problema non c'è più perché il tampone viene mandato con l'enzima. Il problema è nella doppia digestione (avviene molto spesso in laboratorio). La strategia è quella di prendere un tampone in cui tutti e due gli enzimi funzionano abbastanza bene e metto i 2 enzimi insieme. Nei tamponi:

• Il magnesio ci deve essere sempre
• La [NaCl] cambia
• DTT: è un antiossidante, si mette nella reazione, nel tampone in cui forniscono l'enzima, perché evita l'ossidazione dell'enzima stesso, scioglie i punti di solfuro.
• Il tampone con l'acetato fa funzionare bene parecchi enzimi
• L'enzima viene fornito in glicerolo, perché la proteina non può esser congelata in acqua, si denatura, per cui glicerolo perché funge da anticongelante (40-50%)

Nella tabella, fornita su cataloghi e testi, vedo l'attività dell'enzima nei vari tamponi. La Taq1, funziona a T alta, a 37° non taglia per niente. DNA umano tagliato con EcoR1, e DNA del mais, tagliato con lo stesso enzima. La parte protrudente è la stessa, si appaia, quando faccio la ligasi, il sito di restrizione viene conservato, per cui la molecola che ho fatto nuova, se la taglio di nuovo con EcoR1 si deve tagliare nello stesso posto.

Mappa di restrizione

Individuo in un frammento di DNA gli enzimi che lo tagliano. Se io sto lavorando con un frammento di DNA, posso aver il dubbio che non sia il mio, amplificato per esempio per PCR. La certezza la potrei avere sequenziandolo ma è un lavoro lungo. Se io so che il mio frammento viene tagliato a metà da EcoR1 è una prova che io stia lavorando con il frammento giusto. Un frammento di 450, ha un sito Eco, ed un campione, stessa dimensione. Sul gel vedo il campione da 450 (non viene tagliato) e sotto un frammento della metà. Se non ho la mappa di restrizione, posso farla, provando gli enzimi che ho in laboratorio.

• No enzyme: è il frammento che non è stato digerito, poi lo digerisco con altri enzimi.
• La digestione con i due enzimi insieme è molto informativa.
• Il frammento di 600 sta su Bam ma non nella doppia digestione (è un frammento bam ma non c'è Eco)
• Il frammento 300, è tagliato da EcoR1 ma non da Bam
• Il frammento di 850 potrebbe essere un 600+250
• Il frammento da 950, potrebbe essere 400+300+250

La mappa è scrivere le distanze e i siti di restrizione. Oggi, con il sequenziamento dei genomi, la mappa si fa al pc.

Tecniche di ibridazione degli acidi nucleici e marcatura degli acidi nucleici

Lezione 2

Blotting

Blotting: trasferimento di DNA da un gel ad un filtro. Il DNA bersaglio: trasferito sul filtro. Sonda: complementare al gene che sto cercando. La prima tecnica che fu ideata è DNA contro DNA. Significa che sul filtro ho DNA e la sonda è di DNA. Southern ha ideato il southern blot. Questa è la tecnica originale. Sul filtro posso avere anche l'RNA e lavorare con una sonda a DNA (chiamata Northern). Il western blot: sul filtro ci sono le proteine (riconoscimento di proteine spottate su filtro attraverso ab specifici).

Southern blotting

Passaggi fondamentali:

• Corsa su gel d'agarosio (nel DNA cromosomiale, non vedo bande, ma una strisciata bianca) e separo il DNA. Trattamento con NaOH, perché quando corro un gel d'agarosio e digerito DNA con enzimi di restrizione, ho a che fare con un dsDNA (se lo ho a ssDNA uso l'ER). Se voglio fare un appaiamento di 2 DNA, devo avere 2 molecole a singolo filamento, quindi devo denaturare il DNA sul gel e poi il gel è immerso in un tampone di neutralizzazione, per riportare il pH in condizioni normali. Il DNA molto grande, pezzi di 20000, non riesco a trasferirlo da gel su filtro, quindi per alleggerirlo tolgo un po' di purine (A-G), questo si fa con l'acido (parte la base, non si rompe il DNA).
• Ho un tampone in una vaschetta (salino), un ponte con delle cartine (va a finire sopra il gel, lo tengono umido e permettono il passaggio del tampone per capillarità). Sopra al gel metto il filtro, può essere di nitrocellulosa o di nylon, il DNA sale, non passa attraverso il filtro, e fa una sorta di impronta, come se il gel fosse stato fotocopiato su filtro. Sopra metto carta assorbente ed un peso. Si lascia tutta la notte. Il gel la mattina dopo è sottile sottile.
• Prendo il filtro, in cui ho il DNA, e le bande rispecchiano la posizione su gel. Tra tutte le bande avrò la mia che devo identificare.
• Baking: cuocere. Il DNA si attacca a filtro ma non è legato in maniera covalente. Quindi devo fissare il DNA in maniera irreversibile. Fa legami covalenti con la nitrocellulosa (va messa a 80° sottovuoto). Ora ci sono membrane di nylon sintetiche, fissate con UV.
• Ibridazione: devo mettere il filtro in determinate condizioni, che contiene il DNA denaturato e devo appaiare la sonda. Le condizioni determinano la stringenza. La sonda, di colore rosso, nello schema è completamente appaiata in un caso, e nell'altro c'è come una bolla, in cui c'è un matching non del 100%.

Preibridazione: Dopo aver fissato la membrana, devo fare la preibridazione, ovvero metto il filtro in una soluzione dove c'è un tampone ad una certa [] salina, e delle soluzioni che permettono di saturare i siti aspecifici sulla membrana, dove la sonda può attaccarsi. Si usa mettere dei DNA specifici freddi, come sperma di salmone (DNA cromosomiale, disponibile in commercio). Butto la sonda dentro e faccio ibridazione vera e propria. Si lascia parecchio, 2 giorni.

• Il giorno dopo faccio dei lavaggi, ovvero uso soluzioni che mi permettono di staccare la sonda dove è attaccata in maniera è aspecifica e conservare quella specifica
• Rilevazione del segnale: si prendeva il filtro radioattivo, dopo averlo lavato, lo mettevo sulla lastra fotografica, mettevo sopra la pellicola fotografica (più sensibile a bassa T), necessità di una camera oscura e sviluppavamo la lastra.

Sono partita da molte bande ed alla fine poche. Sacchettini con pochi ml di soluzione, chiusi con un sistema a calore, in questa maniera avevo sonda, filtro, e mettevo il sacchetto ad una giusta T. Aprire il sacchetto con il liquido radioattivo, si rischia di contaminarci noi, il bancone.. quindi era noioso come sistema dal pdv della manualità. Oggi si sono inventati un sistema con delle bottiglie con un tappo, messe dentro ad un fornetto, dove le bottiglie girano, e quindi mettiamo il filtro arrotolato, per cui anche se metto pochi ml, non c'è problema perché la bottiglia gira. Il fornetto è termostatato. Tiro fuori poi il filtro, (nella bottiglia faccio anche i lavaggi, metto soluzione di ibridazione e lavaggio), il filtro poi sarà lavato (95% della radioattività l'ho portata via). Lavoro in camera oscura e metto sopra la pellicola. Oppure utilizzo l'imager, che mi dà la scansione del filtro.

Tempo fa', fatto il blot, si prendeva il gel, e vista la posizione della banda specifica, veniva tagliato con il bisturi, si estraeva il DNA da quel punto e ci si faceva il clonaggio. All'inizio il southern ci ha permesso il clonaggio di un gene e se oggi non sappiamo nulla di un gene dobbiamo tornare al southern. (PCR anche, ma se non conosco la sequenza...)

Northern blot

Non posso fare un passaggio con soda, è estremamente sensibile al pH, lo degrada tutto quindi non posso denaturare l'RNA (non è una molecola lineare, precisa, può formare stem-loop), quindi quando voglio ibridizzare sonda con RNA, deve essere denaturato, per cui uso un gel denaturante, gel d'agarosio corso con la formaldeide e quindi corro un gel in condizioni denaturanti (nel DNA è un gel d'agarosio semplice)

Fine: studio l'espressione genica (di un messaggero). Qui ho geni di virulenza. + e – potrebbe essere qualsiasi condizione. Nelle 2 condizioni, nel virF, in una ce n'è tanto ed in uno poco, per cui in – la trascrizione è calata. Espressione di un gene indotto da freddo. Qui vedo la curva di crescita del Coli. All'inizio c'è un segnale forte e poi va scomparendo. Dice che il gene viene trascritto all'inizio e poi viene bloccato.