Genetica applicata

Purificazione dei plasmidi

Il lisozima (rompe la parete delle cellule, per cui si lisano più facilmente)
NaOH + SDS → con l'NaOH il pH va a 14, sfascia le cellule quindi l'SDS solubilizza la membrana cellulare (formata da fosfolipidi), la soluzione si chiarifica.
Sodio-acetato a pH 5.2 → serve per neutralizzare il pH → il plasmide, che è superavvolto, non si denatura più di tanto, e se si denatura si richiude in maniera corretta quando neutralizziamo (la soda denatura il DNA).
Il DNA che si è rotto, i pezzi molto grandi del cromosomale, quando si denaturano, succede che, quando li riportiamo a pH 7 di colpo, si vanno a riappaiare e formano un aggregato, ma ci sono degli appaiamenti errati. Se lo faccio precipitare, ora va in fondo, mentre se centrifugo il plasmide, non gli succede nulla. Avremo dopo centrifugazione, il pellet di DNA cromosomale precipitato e il plasmide superavvolto. Ora prendo il surnatante del tubo, e lo tratto con il fenolo cloroformio.

Perché mi permette di portare via tutte le proteine. Sotto fenolo/cloroformio e sopra la soluzione acquosa. Porto via la parte superiore e avrò il DNA plasmidico senza proteine. Ora faccio precipitare il DNA plasmidico. Faccio neutralizzare le cariche con Na+ (non devo nemmeno aggiungerlo) e butto dentro l'etanolo, dove il DNA non è più solubile, scappa e forma un aggregato, dopo centrifugazione ho il nuovo pellet di DNA plasmidico.

PURIFICAZIONE DEL PLASMIDE CON CENTRIFUGAZIONE SU GRADIENTE DI CLORURO DI CESIO-BROMURO D'ETIDIO

Il plasmide viene separato dal cromosomale perché è più piccolo e superavvolto. Ho necessità di un gradiente di cesio (un sale), e bromuro d'etidio, che si lega al DNA, intercalante, è in grado di far girare una molecola di DNA. Se parto da una molecola superavvolta -, poi diventa circolare, e se la concentrazione di bromuro d'etidio è maggiore, il DNA diventa superavvolto +. Nell'ultracentrifuga,

buttiamo dentro il lisato cellulare, il DNA in presenza di etanolo si appiccica alla resina che sta lì e faccio una serie di lavaggi e poi alla fine, in questa maniera, i lavaggi portano via proteine, RNA, tutto quello che non si è appiccicato alla resina. Poi faccio diluizione in H2O, e poi spinno. Sotto c'è il tubo, raccolgo i 50 microlitri, che si hanno portato via il DNA.

QUALITÀ E QUANTITÀ DI ACIDI NUCLEICI

legge di beer-lambert → A = ε x L x C, è l'assorbanza, L è il cammino della cuvetta, ε è il coefficiente di estensione molare e C è la concentrazione.

Si applicano delle proporzioni semplici, si sa che quando lo spettrofotometro legge una O.D. (è l'assorbanza), io ho una soluzione di 50 microgrammi per ml di DNA e poi moltiplico per il fattore di diluizione. Per RNA o oligo applico: 1 O.D. = 40 μg/ml RNA 1 O.D. = 33 μg/ml oligonucleotide. Questi numeri sono diversi.

Perché c'è bisogno di menomateriale per avere un O.D. Lo spettrofotometro ci può dire anche il grado di purezza della mia preparazione. Il DNA ha assorbanza a 260 (è il picco di assorbimento delle basi azotate a quella lunghezza d'onda). A280 assorbono gli aromatici delle proteine (come triptofano e fenilalanina). Se il rapporto tra A260/A280 cresce troppo, significa che c'è contaminazione da RNA; se tra 1.6-1.8, è una buona preparazione e se minore di 1.6, c'è una contaminazione da proteine.

TRASFORMAZIONE CELLULE BATTERICHE

Metodo del calcio cloruro → le cellule vengono messe in soluzione di acqua+calcio cloruro (50 millimolare), si lasciano lì per molte ore, dalle 3 alle 7-8-10 h, succede che queste cellule preparate in calcio cloruro, quando aggiungiamo il DNA, si fa al freddo, è come se si assorbisse, certi dicono che il DNA precipita sulla membrana cellulare. In questa maniera, quando sta inghiaccio,

Dal ghiaccio, le cellule vengono prese e collocate in un bagnetto a 42°C per 1-2 minuti. Durante questo processo di heat-shock, il DNA si attacca alle cellule e viene internalizzato, permettendo al plasmide di entrare all'interno della cellula. Per i Coli, 42°C rappresenta una temperatura limite, quindi le cellule vengono portate a 37°C per 1 ora, dove i geni presenti sul plasmide, inclusa la resistenza agli antibiotici, vengono espressi. Non viene utilizzato un terreno selettivo, ma un terreno completo senza antibiotici, in modo che tutti i nutrienti siano disponibili per l'espressione dei geni del plasmide. Successivamente, le cellule vengono seminate su un terreno contenente ampicillina. Le cellule che hanno espresso l'ampicillina cresceranno, mentre quelle che non hanno il plasmide non cresceranno.

Nel caso dell'elettroporazione, le cellule vengono rese competenti attraverso una scossa elettrica. Lo strumento utilizzato emette una scossa di millisecondi a voltaggi molto alti, ma molto brevi.

La cuvetta dove mettiamo le cellule assomiglia ad una sorta di cuvetta da spettrofotometro e intorno i 2 elettrodi che si collegano allo strumento. Le cellule vengono messe a 37° senza l'espressione del plasmide, in un terreno senza nessun antibiotico e poi le piastro su terreno con antibiotico. E' una procedura velocissima, soprattutto se le cellule sono congelate.

COSTRUZIONE ED IDENTIFICAZIONE DI PLASMIDI pBR322 RICOMBINANTI

Il clonaggio veniva fatto nel sito Pst al livello dell'ampicillina. Se noi cloniamo un pezzo di DNA in un gene, interrompo quel gene, quindi l'interruzione di quel gene fa sì che non funziona più → cellule sensibili all'ampicillina. Il DNA viene tagliato con lo stesso enzima di restrizione. Faccio il clonaggio con il plasmide linearizzato e il frammento di DNA. 2 opzioni: o entra l'intero, oppure non rientra (vettore uguale a prima). Il problema grosso è che, se ho tante colonie, queste sono tutte resistenti alla tetraciclina.

Perché non l'ho toccata, la differenza sta lì, la differenza sta nell'ampicillina. Le 3 situazioni sono quelle che si possono verificare dopo trasformazione.

1. Resistente alla tetraciclina, suscettibile all'ampicillina.

2. Resistente alla tetraciclina e resistente all'ampicillina.

3. Suscettibile a tet e amp, ovvero non c'è proprio il plasmide.

Come risolvo lo screening?

1. Faccio la (master) piastra in tet → non permette la crescita delle cellule che non hanno il plasmide.

2. Prendo il velluto, sterilizzato, c'è un cilindro che ha la stessa forma della piastra e se noi prendiamo questo velluto sterile, lo appoggiamo sulla master e tiriamo su il velluto ed un tot di cellule rimangono attaccate al velluto.

3. A questo punto prendo una piastra nuova con sola ampicillina, quindi metto il velluto sulla piastra (replica) che contiene l'ampicillina, lo appoggio per un tot e incubo la piastra per tutta la durata necessaria.