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Negli eucarioti l’apparato di trascrizione è + complesso

3 enzimi che riconoscono promotori diversi e sintetizzano classi diverse di RNA

RNA pol II è formata da un “core” (con attività polimerasica ) e da varie

subunità che agiscono di concerto per riconoscere il promotore, legare il

DNA e srotolarlo.

Sul promotore viene riconosciuta in particolare la seq TATA box

Altre sequenze a monte (anche 200 nt al 5’) possono attivare o inibire la RNA

pol mediante interazione con coattivatori o corepressori

Altre sequenze ancora più a monte possono attivare/inibire trascrizone (enhancer)

Es: il coattivatore CBP induce la

trascrizione di tutti i geni con seq

attivatrice CREB ( cAMP

responsive element)

Trascrizione di geni controllata

à

da livelli intracellulari di cAMP

Terminazione di trascrizione

RNA pol II ed altri fattori tagliano l’mRNA a valle del sito di

poliadenialzioneà rilascio dell’mRNA, degradazione del segmento di RNA

3’ e dissociazione di RNA pol II dallo stampo

Maturazione dei trascritti eucariotici

trascritto primario o pre-mRNA (hnRNA)

•Capping

•Metilazione NUCLEO

•Poliadenilazione

•Splicing

•Editing

mRNA maturo Capping

L’aggiunta del CAP di metil guanosina (GMP) al 5’P dell’mRNA ne

protegge l’estremità evitando degradazione da parte di ribonucleasi e

lo posiziona correttamente sul ribosoma durante traduzione

Poliadenilazione

aggiunta di 30-200 adenosine (AMP) al 3’OH dell’mRNA

l’RNAm

àStabilizza

poliAdenilazione avviene a valle di sequenza specifica riconosciuta

àLa

da vari fattori, subito dopo il taglio che termina trascrizione

Splicing

Rimozione di sequenze prive di significato (non

codificanti) o introni e risaldatura degli esoni

•I componenti dello splicesoma riconoscono siti di

giunzione esone/introne/esone

•Tagliano al 5’ per dare struttura a cappio (lariat)

•Taglio al 3’ dell’introne àeliminazione

e risaldatura tra i 2 esoni

Splicesoma= complesso di proteine e snRNAà à

snRNP: small nuclear ribonucleoprotein particle

probabilmente ribozimi

NB in alcuni casi si ha self-splicing introne è ribozima

à

RNA Editing

Cambiamento nella seq dell’mRNA a livello post-trascrizionale:

aggiunta-delezione di nt o cambiamento di basi azotate (UàC)

•Tipico di geni mitocondriali e di cloroplasti

•Richiede stampi di RNA guida (gRNA) originati da introni

Es editing tessuto specifico del mRNA per apoliporoteinaB (ApoB)

Solo gli mRNA maturi lasciano il nucleo

Maturazione degli rRNA eucariotici

•rRNA 28S, 18S, 5,8S derivano da singolo precursore trascritto da RNA pol I

gene ripetuto in tandem centinaia di volte nella zona NORà zona fibrillare del nucleolo

, attivamente trascritta in alcune fasi della vita cellulare

•rRNA 5S invece trascritto da RNA pol III – cluster di geni ripetuti fuori dal nucleolo e

diverso precursore

Maturazione del precursore di rRNA 28S, 18S, 5,8S

•Modificazione di nucleotidi (metilazione e sostituzione di U con Ψ) mediata

da snoRNA

•Associazione con proteine ribosomali

•eliminazione degli spaziatori intragenici

Maturazione dei tRNA eucariotici

Trascritti da RNA pol III che riconosce promotore interno al gene (su

tratto codificante)

•geni organizzati in cluster

•Precursori con geni singoli sono accorciati al 5’ e 3’, subiscono

modificazione di basi ed eventuale splicing

•La maturazione dei pretRNA coinvolge il ribozima RNasiP

CONCETTO DI GENE

•anni ’40: esperimenti di Beadle & Tatum

Si determina la relazione tra geni ed enzimi grazie a ricerche su alcuni ceppi

della muffa del pane (NEUROSPORA ) definiti «mutanti nutrizionali».

ALTERAZIONE DNA PROTEINA DI CRESCITA

àDIFETTO àDIFETTO

Un gene un enzima

à

•Un geneà un polipeptide

Sono possibili varie definizione di gene!!

1) Il gene è una sequenza di DNA contenente l’istruzione per la produzione

di un polipeptide (fornisce cioè le istruzioni per la sintesi proteica) (questa

definizione non tiene conto dei geni per tRNA, rRNA , ribozimi e small RNA)

2) Il gene è un’unità trascrizionale (questa definizione esclude le seq regolatrici e

la possibilità che gene dia più prodotti mediante splicing e/o inizi/fine di

trascrizione alternativi)

3) Gene: segmento di DNA contenente un’informazione, non sempre univoca

4) Gene: unità ereditaria

Elementi fondamentali di un gene:

•promotore e regioni regolative,

•tratto codificante,

•terminatore di trascrizione

Negli eucarioti il tratto codificante è “interrotto” da introni!! genomi +ampi

à

Nei procarioti + geni sono trascritti insieme (à mRNA policistronici)

The sequence of a

prokaryotic protein-

coding gene is colinear

with the translated mRNA;

that is, the transcript of

the gene is the molecule

that is translated into the

polypeptide.

The sequence of a

eukaryotic protein-coding

gene is typically not

colinear with the

translated mRNA; that is,

the transcript of the gene

is a molecule that must be

processed to remove extra

sequences (introns)

before it is translated into

the polypeptide. Il codice genetico

Il flusso d’informazione si basa su un codice a triplette di basi:

CODONI

le istruzioni che specificano la sequenza di amminoacidi di un

polipeptide sono scritte nel DNA (e sull’mRNA) come codoni

Seconda base azotata

U C A G U

UUU UAU

UCU UGU Cys

Phe Tyr

UUC UAC UGC C

UCC Ser

U UCA UAA Stop UGA Stop A

UUA Leu

Il codice genetico è UCG UAG Stop

UUG UGG Trp G

universale! U

CAU CGU

CUU CCU His azotata

azotata CAC CGC C

CUC CCC

C Pro Arg

Leu

Quasi tutti gli organismi (dai CGA

CUA CCA A

CAA Gln CGG

batteri alle piante agli animali) CUG CCG base

CAG

base G

condividono lo stesso codice U

ACU

AUU AAU AGU Ser

Asn Terza

Prima Ile

genetico. ACC AGC

AUC AAC C

A Thr

AUA ACA AGA

AAA A

Lys Arg

Met o

Piccole differenze solo per geni ACC AGG

AAG

AUG G

inizio

mitocondriali U

GAU

GCU

GUU GGU

Asp

GAC

GCC C

GUC GGC Gly

Ala

G Val GAA

GCA

GUA GGA A

Glu

GAG

GCG

GUG GGG G

Gli esperimenti di Brenner e Crick su fagi mutanti hanno definito le

proprietà principali del codice genetico

Basato su triplette di basi (perché

inserzioni/delezioni multiple di 3 generalm.

non alterano/compromettono significato

genico)

Non sovrapposto (perché mutazioni di

singoli nt cambiano significato di un solo

aa)

Continuo senza virgole (perché

mutazioni per inserzione/delezione di basi

provocano slittamento della fase di lettura

a valle del sito mutato)

Degenerato: con più codoni codificanti

per lo stesso aa, ma non ambiguo in q.

ad ogni codone corrisponde un solo aa

(altrimenti nel tratto mutato i codoni di stop

sarebbero molto frequenti) degenerazione

evidente sulla terza base

Il codice è stato decifrato grazie ad esperimenti di sintesi proteica in vitro

usando come stampo RNA sintetici a sequenza nota

•Il messaggio sull’mRNA è letto

in direzione 5’à3’

•il polipeptide è sintetizzato

in direzione NH COOH (esp di Dintzis)

à

2

Il codice genetico mette in relazione seq nucleotidica con seq amminoacidica

Questo codice molecolare consente di decifrare/tradurre in sequenza

aminoacidica l’informazione genetica del DNA

Filamento da trascrivere

T A C T T C A A A A T C

DNA A T G A A G T T T T A G

Trascrizione

5’ 3’

G U U U A G

A U A A G U

mRNA Codone Codone

di inizio di arresto

Traduzione

Met

Polipeptide Lys Phe

NH COOH

2

La traduzione:

trasferimento dell’informazione genetica

dall’RNA alle proteine

– Il messaggio sull’mRNA è tradotto in sequenza amminoacidica

– avviene nel citoplasma sui ribosomi (gli organuli che

coordinano le operazioni necessarie per passare dalle

sequenze nucleotidiche alle catene polipeptidiche).

L’apparato di traduzione comprende ribosomi e tRNA che

interagiscono con l’mRNA per tradurlo in polipeptide

I ribosomi sono complessi formati da rRNA e proteine

Ricerche recenti indicano che gli rRNA hanno attività catalitica (ribozimi)

80S

70S

Le subunità ribosomali si pre-assemblano nella regione

granulare del nucleolo

Le subunità si associano solo durante sintesi proteica

Nobel 2009 Chimica

a scienziati che hanno studiato la

struttura 3D dei ribosomià

applicazioni quali disegno di nuovi

antibiotici

Il ribosoma ha 4 siti di legame per RNA (3 per tRNA e 1 per mRNA)

Le due subunità associandosi formano un tunnel nel quale scorre l’mRNA in

traduzione

La subunità maggiore ha attività peptidil-trasferasica (forma legami peptidici tra

aa portati dai tRNA)

Subunità minore offre piattaforma di appaiamento tra tRNA e mRNA

tRNA

Enzima aminoacil-tRNA sintetasi lega aa al 3’OH del sito accettore

L’anticodone si appaia con il codone complementare sul mRNA

La terza base dell’anticodone è vacillante (wobble) in q puo’ non essere

determinante/stringente per l’appaiamento sul codone

Struttura simbolica Struttura 3D ad “L”

a trifoglio

Il tRNA interagisce con il messaggero a livello del suo anticodone

Spesso la 3° base non è determinante per il riconoscimento del codone

L’enzima aa-tRNA sintetatsi “carica” l’aa sul suo tRNA corrispondente

Di regola esistono almeno 20 enzimi (1 per aa)

L’enzima riconosce il tRNA grazie a seq nt specifiche

La reazione consuma ATP

Le 3 fasi della traduzione

Inizio: riconoscimento del codone di inizio ed assemblaggio componenti (ribosoma,

tRNA e mRNA)

Elongazione: sintesi della catena e scorrimento del ribosoma sul mRNA

Terminazione: codone di stop e dissociazione tra mRNA, ribosoma e polipeptide

Inizio nei procarioti

•IF-1-2-3 si legano a subunità minore

•Legame di tRNA iniziatore (formil-Met)

•mRNA si lega a subunità minore grazia

appaiamento tra seq Shine-Dalgarno e

rRNA 16S

•Idrolisi di GTP e associazione dela

subunità maggiore

Elongazione

Ingresso su sito A di aatRNA scortato da Eftuà idrolisi GTP e rilascio di

EFtuà formazione legame peptidico:aa del sito P trasferito su aa su sito Aà

traslocazione: ribosoma scivola in avanti di un codoneà tRNA scarico passa

su sito E, polipetidil tRNA su sito P, sito A vuoto pronto per ingresso di nuovo

aa-tRNA Terminazione

•Il codone nonsenso (stop) è riconosciuto da fattori di rilascio

•La catena polipeptidica è tagliata mRNA e subunità ribosomali si dissociano

•Consumo di GTP

Lo stesso mRNA viene “letto “ contemporaneamente da più ribosomi

che scorrono verso il 3’ poliribosoma

à

Differenze nella traduzione eucariotica

Nella fase di inizio il posizionamento sul mRNA si basa sul cap e

meccanismo di “scansione” dell’mRNA fino a trovare il primo AUG

(all’interno della seq Kozak)

Molti + fattori di inizio coinvolti rispetto ai batteri

mRNA monocistronici (vs) mRNA policistronici tipici di batteri

Le differenze nel processo di traduzione eucariotica e procariotica sono

alla base dell’uso di farmaci antibatterici selettivi

Alcuni inibitori della sintesi proteica batterica sono infatti potenti antibiotici

Ripiegamento, maturazione e traffico delle proteine

Prima di svolgere la sua funzione biologica il polipeptide deve ripiegarsi

correttamente e, a volte, subire modificazioni chimiche specifiche

(acetilazione, metilazione, glicosilazione, fosforilazione, aggiunta di lipidi).

Il ripiegamento/folding proteico

può essere assistito da altre

proteine chaperon

Molti chaperon altamente

conservati tra procarioti ed

eucarioti si attivano in condizioni

di shock termico (HSP)

Alcune patologie derivano da ripiegamento proteico difettoso

Es Alzheimer e Parkinson derivano da accumulo di fibrille amiloidi

(depositi di proteine insolubili malripiegate) morte neuroni

à

Malattia da prioni:

neurodegenerazione dovuta ad

accumulo di proteina PrP malripiegata

Nella encefalopatia spongiforme le

proteine PrP malripiegate assunte con

l’alimentazione vanno ad alterare la

struttura delle PrP endogene in una

reazione a catena

Unico caso di agente”infettivo” di

natura proteica

Smistamento delle proteine cellulari

Le proteine sintetizzate sui ribosomi citoplasmatici si spostano verso vari

comparti cellularià traffico proteico

Le proteine sono indirizzate grazie a corte seq AA : seq segnale

La seq segnale può essere N- o C-terminale oppure interna

Può essere rimossa (o meno) una volta raggiunta destinazione

La seq AA di indirizzamento è riconosciuta da specifici

recettori/trasportatori

ingresso/scambio di proteine:

•Da/per RE, mitocondri, cloroplasti, perossisomi avviene grazie a

traslocatori proteici inglobati nella membrana di questi organelli

•Da/per nucleo grazie a pori nucleari

•Da/per RE Golgißà

ßà

lisosomißàmembrana plasmatica e

spazio extracellulare grazie a sistema del

traffico vescicolare dal citosol al RE

Mentre la proteina è in traduzione, la seq segnale (7-25 aa N terminali con tratto idrofobico) è

riconosciuta da una SRP(RNA catalitico+proteine)à rallenta traduzione e consente attracco su

recettore per SRP sul RE distacco della SRP sintesi riprende e catena inizia ad inserirsi

à à

nel canale traslocatore (Blobel, Nobel medicina1999)

Il polipeptide nascente indirizza il ribosoma vs RE se contiene seq segnale

•Ribosomi liberi sintesi di proteine destinate a nucleo, perossisomi, mt,..

à

•Ribosomi associati al REà proteine con seq segnale, destinate a Golgi, secrezione,

membrana plasmatica, lisosomi,…

La dissociazione tra SRP e recettore guidata da idrolisi di GTP (energia)

La seq segnale si inserisce ad ansa nel canale trasolcatore, ed è poi tagliata da

enzima peptidasi segnale- il polipeptide si allunga ed è rilasciato nel lume del RE

Le proteine integrali di membrana oltre alla seq segnale hanno una seq (idrofobica)

che blocca il trasferimento e si sposta nel core lipidico di membranaà resta

inglobata di membrana (monopasso) con porzioni

àProteina

N terminale nel lume

C-terminale nel citosol

nelle proteine multipasso vari segmenti di arresto si alternano con seq.segnale

che non sono tagliate da peptidasià vari tratti transmembrana

Il canale traslocatore (Sec61) si apre lateralmente permettendo al tratto

polipeptidico idrofobico (tratto di arresto trasferimento) di entrare nel core di

membrana

All’interno del RE le proteine vengono modificate e rimodellate

Es N-glicosilazione: albero saccaridico sintetizzato su fosfolipide dolicolo e poi

trasferito su proteina a livello di Asn (oligosaccaride sarà successivamente

rimaneggiato nel Golgi)

Nel RE le proteine si ripiegano per assumere strutt 3D funzionale

Processo controllato e favorito da appositi chaperon molecolarià CONTROLLO

QUALITA’ delle proteine

Nel RE possono assemblarsi + catene per dare complesse strutture quaternarie

(es anticorpi)

I principali chaperon del RE sono:

•BiP porzioni idrofobiche dando tempo a proteina affinchè si ripieghi

àlega

•Sistema calnexina/calreticolina ripiega specificamente proteine glicosilate

à

•PDI ripiega proteine mediante formazione/rottura di ponti disolfuro

à

Le proteine malripiegate sono riconosciute (forse grazie a loro porzione

oligosaccaridica?) e ritraslocate nel citosol dove saranno degradate

STRESS del REà

Eccessivo accumulo di proteine malripiegate stimola la UPR (unfolded protein response)

via segnalazione che parte dal RE e attiva la trascrizione di geni per chaperon

Proteine chinasi/sensore inglobate nella membrana del RE avvertono

presenza di proteine malripiegate

attivano

àsi

mediante meccanismi vari

à (es splicing che favorisce sintesi di fattore

attivano la trascrizione di geni per chaperon

trascrizionale specifico) Citosol nucleo

ßà

Passaggio obbligato attraverso nucleoporo

libero per molecole piccole

controllato per molecole e proteine con dimensioni maggiori

Sequenze di indirizzamento NLS (nuclear localization signal) e NES (nuclear

export signal) guidano le proteine dentro e fuori dal nucleo Aa basici e Pro

Ricche in Leu

NLS e NES interagiscono con importine ed esportine : recettori che ne favoriscono

passaggio attraverso poro nucleare interagendo con nucleoporine

L’attività di importine ed esportine è regolata da

proteine RanGTP

-Importine:associazione con RanGTP nel nucleo fa

rilasciare cargo, mentre l’idrolisi a GDP la fa riassociare a

cargo nel citoplasama;

- Esportine: idrolisi del GTP nel citoplasma fa rilasciare

cargo

Associazione con Ran GTP nel nucleo fa legare la proteina

cargo

Per molte proteine il passaggio da/per nucleo può essere regolato

Il transito di fattori trascrizionali può essere inibito/favorito da

fosforilazione/defosforilazione (o associazione con inibitori di trasporto)

Es NFAT di cellule T (regolatore trascrizionale di geni immunitari)

-nello stato P esportato nel citosol

à

-Stato dePà importato nel nucleo (lo stato P dipende dalla [Ca2+]

Citosol mitocondrio

ßà

Importazione di proteine nella matrice mitocondriale richiede presenza di

segnale di indirizzamento (elica anfipatica)

e dei complessi traslocatori TOM (m est) e TIM (m. interna)

•La proteina è sintetizzata su ribosomi liberi

•La proteina è mantenuta parzialmente non ripiegata e trasportata verso TOM da chaperon

citosolici (hsp70)

•La seq segnale riconosce TOM ed inizia traslocazione

•L’interazione del segnale con TIM fa traslocare attraverso m. interna

•Proteina “tirata” dentro matrice grazie a ddp a cavallo di membrana mt int (interno negativo) e

ripiegamento assistito da chaperon mitocondriali (con consumo di ATP)

•Taglio della seq segnale da parte di peptidasi mitocondriale

Citosol perossisomi

ßà

•Proteine sintetizzate su ribosomi liberi

•Possiedono segnali di indirizamento (PTS1 e 2)

•Interazione con trasportatori Pex 5-7 che le fanno passare attraverso complesso di perossine

transmembrana fino a matrice

•Nella matrice dissociazione da trasportatore

NB trasporto richiede energia e riguarda proteine già ripiegate (es catalasi)

Biogenesi dei perossisosmi

Recenti studi indicano che

oltre che per fissione di

perossisomi maturi

i perossisomi originano anche

da gemmazione del RE/Golgi

dove si accumulano specifiche

proteine perossisomiali (PMPI)

Sistema ubiquitina-proteasoma regolatore di attività e

emivita delle proteine

Degradazione delle proteine: perchè?

• errori di traduzione/sintesi

• danni (es denaturazione)

• ripiegamento scorretto

• meccansimo di regolazione temporale dell’attività di quella proteina

• normale turnover

Degradazione mediata

1. da lisosomi

2. da sistema UPS (ubiquitina-proteasoma): riconoscimento proteina da

degradareà aggiunta di molecole di ubiquitinaà proteolisi nel

proteasoma (complesso macromolecolare formato da diverse

proteasi) Nobel per la Chimica, 2004


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127

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3.18 MB

AUTORE

kalamaj

PUBBLICATO

+1 anno fa


DETTAGLI
Esame: Biologia
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in medicina e chirurgia (a ciclo unico - 6 anni)
SSD:
Docente: Cicero A.
Università: Foggia - Unifg
A.A.: 2012-2013

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher kalamaj di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Foggia - Unifg o del prof Cicero A..

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