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Struttura del DNA
CC Nucleotide Ofosfatodel DNA H C HC3 C NO CCTT CHOO P H N O2 Timina (T)–O OCH CHGG HH C CHO Zucchero(deossiribosio)TT Nucleotide del DNAPolinucleotide del DNAInizio anni ’50•Regole di Chargaff:A=T, C=G;somma purine (A+T)=sommapirimidine (G+C)•Rosalind Franklin:quadri di diffrazione ai raggi Xrivelano una strutturaperiodica•1953: Watson e Crick propongono il modello della doppia elicaIl modello del DNA di James Watson e Francis Crick•2 catene polinucleotidiche antiparallele si avvolgono su un’asse centralecon andamento destrorso•Basi azotate di filamenti opposti appaiate specificamente mediantelegami idrogeno e formano strutture planari su piani perpendicolariall’asse•Alternanza di solchi maggiori e minori•Passo= 3.4 nm =10.4 coppie di basi•Diametro= 2.0 nm Conformazioni del DNADNA B: situazione fisiologica più diffusaDNA Z: (avvolgimento sisnistrorso) in particolari regioni probabilefunzione regolativa (associata
La metilazione delle citosine è un processo che modifica il modello molecolare della doppia elica ed è coerente con la funzione di deposito dell'informazione genetica.
L'informazione genetica è rappresentata dalla sequenza di basi che viene tradotta in sequenza di amminoacidi nelle proteine (codice genetico).
La complementarità specifica tra le basi è alla base dei processi di:
- trasmissione (DUPLICAZIONE)
- trasferimento (TRASCRIZIONE-TRADUZIONE)
- ed evoluzione (RICOMBINAZIONE) dell'informazione genetica
Il flusso dell'informazione genetica avviene attraverso tre macromolecole che governano le funzioni vitali della cellula:
- L'informazione viene trasferita da DNA ad altro DNA (duplicazione)
- Dal DNA all'RNA (trascrizione)
- Dall'RNA alle proteine (traduzione)
L'organizzazione dei genomi avviene attraverso i geni, che sono segmenti di DNA contenenti una specifica informazione sotto forma di sequenza nucleotidica (ad esempio, informazione per la sintesi di polipeptide).
Il genoma è l'insieme di...
geniProcarioti: genoma costituito da una sola molecola di DNA dscircolare Eucarioti: genoma formato da numerose molecole di DNA dslineari (cromosomi) Negli eucarioti la sequenzacodificante del gene(l’informazione) è interrotta dasegmenti privi di informazione Dimensione dei genomi •Grande variabilità •Dimensione non sempre corrisponde alla complessità della specie Virus- decine di migliaia di basi Batteri-milioni di basi Mammiferi-miliardi di basi Piante-centinaia di miliardi di basi numero di interazioni geniche Complessità La denaturazione del DNA consiste nella dissociazione delle 2 eliche (ladenaturazione può essere seguita monitorando l’assorbimento molecolarea 260nm) La cinetica di riassociazione dipende dalla concentrazione e dalla lunghezzadei filamenti Confrontando le cinetiche di rinaturazione di genomi da organismidiversi si ottengono informazioni sul grado di complessita genomica I DNA eucariotici contengono sequenzealtamente/mediamente ripetute (rinaturazione rapida) e seq. uniche (rinaturazione lenta)
Nelle cellule il DNA non può essere contenuto in forma estesa!
Strategie di compattamento mediante associazione con proteine e superavvolgimenti
Nei batteri il DNA circolare presente nel nucleoide è superavvolto e ripiegato in anse trattenute da segmenti di RNA e proteine (HLP)
Negli eucarioti il DNA si avvolge attorno ad ottameri di proteine istoniche (molto basiche) per dare i nucleosomi
H1 stabilizza il nucleosoma associandosi al DNA linker tra nucleosomi successivi
La struttura a collana di perle è confermata da varie osservazioni sperimentali
La "struttura a collana di perle" si impacchetta ulteriormente ripiegandosi in un solenoide
Livelli di compattamento progressivo caratterizzano la cromatina (DNA+proteine) eucariotica e permettono al genoma di essere contenuto nel nucleo
Max compattamento nei cromosomi metafasici (DNA inattivo, duplicato e pronto per essere diviso)
tra nuclei figli)Durante interfase prevale la struttura fibra cromatinica lassa (DNA rilassato e attivo trascrizionalmente)
Le anse cromatiniche si formano su impalcature di proteine non istoniche associate al nucleoscheletro (matrice nucleare)
La cromatina può trovarsi:
- Costitutiva (DNA sempre in stato rilassato, eucromatina, compatto mai trascritto)
- In stato fortemente compattato, eterocromatina
- Facoltativa (inattiva solo in alcune fasi della vita cellulare)
Dallo stato della cromatina dipende l'accessibilità di enzimi e proteine di trascrizione/duplicazione.
Il grado di compattamento può essere modulato mediante modificazioni chimiche sugli istoni e/o sul DNA, come l'acetilazione/deacetilazione degli istoni.
La metilazione delle citosine di tratti di DNA ("isole CpG") compatta la cromatina.
Complessi di "rimodellamento cromatinico": complessi enzimatici che idrolizzano ATP per rimodellare la cromatina, allentando il DNA attornoall'istone
- Scivolamento del necleosoma
- Trasferimento dell'ottamero istonico
Alla metafase massimo compattamento cromatina.
Cromosomi: strutture di cromatina compatta.
Colorabili e visibili al microscopio ottico.
In metafase (mitotica-meiotica) formati da 2 cromatidi fratelli identici tra loro uniti a livello del centromero.
Sul centromero si forma un complesso proteico che media l'aggancio con i microtubuli del fuso mitotico.
Estremità: telomeri.
Preparazione di un cariotipo da un campione di sangue:
Un insieme di cromosomi ordinati in coppie in base alla loro morfologia costituisce il cariotipo.
Soluzione Fissatore
I globuli rossi ipotonici si stratificano in fondo.
Colorante
Centrifuga Globuli
Campione bianchi di sangue
Si elimina il liquido e le cellule vengono centrifugate ancora, i globuli bianchi gonfiano.
Plasma mescolate con una soluzione ipotonica.
Precipitano sul fondo.
campione di sangue
Questo procedimento fa gonfiare e scoppiare i globuli rossi. I globuli bianchi si gonfiano ma non si rompono, e i cromosomi si allontanano uno dall'altro.
Si aggiunge un fissatore ai globuli bianchi.
La disposizione ordinata dei cromosomi che si ottiene è il cariotipo.
Il retino viene osservato con un microscopio a cui è collegata una macchina fotografica digitale. L'immagine dei cromosomi viene immessa in un computer, che li ordina per forma e dimensione.
REPLICAZIONE DEL DNA
Processo semiconservativo: da una molecola
origine di replicazioneavviandone la denaturazioneNei batteri un solo sito originereplicazione (oriC) Nei cromosomi eucariotici origini direplicazioni multiple (es ARS di lievito)chiamati "repliconi"Formazione della bolla replicativaLa bolla è formata da 2 metà simmetriche: forcine replicativeche avanzano in direzione oppostaProteine che permettono avanzamento della forcina•Elicasi: enzimi ad elica che separano i filamenti del DNA•Primasi: enzimi che sintetizzano un breve filamento di RNA detto primer•DNA polimerasi: enzimi che sintetizzano il nuovo filamento di DNA•Ligasi: enzimi che uniscono i frammenti di OkazakiFormazione dei frammenti di OkazakiLa sintesi del filamento discontinuo avviene in frammenti detti frammenti di Okazaki•I frammenti di Okazaki sono sintetizzati in direzione opposta al movimento della forcina•I frammenti di Okazaki vengono poi uniti dalla ligasiFormazione dei telomeriI telomeri sono le estremità dei cromosomi•I telomeri proteggono i cromosomi dall'erosione e dalla fusione•I telomeri vengono sintetizzati dall'enzima telomerasi•La telomerasi aggiunge sequenze ripetute di DNA alle estremità dei cromosomianello che scorrono sul DNA denaturandolo•
SSB: proteine che legano DNSss stabilizzandolo•
DNA topoisomerasi: allentano stress torsionale del DNA conseguente asvolgimento doppia elica L’avanzamento della forcella induce unsuperavvolgimento (stress torsionale) nel tratto diDNA successsivoLe topoisomerasi tagliano il DNA sulsingolo filamento (tipo I) o su entrambi Ifilamenti (tipo II) in modo da allentare latensione torsionale e rilassare il DNADopo il taglio il DNA è risaldato
Sintesi del DNAcatalizzata da enzimi DNA polimerasi: leggono lo stampo ss inØSintesidirezione 3’à5’ e sintetizzano prodotto in direzione 5’à3’nucleotidi trifosfato (energeticamente attivati)Øincorporanobisogno di un breve tratto a ds per partireà innesco di RNA (primer)ØHannocatalizzato da primasiPoichè la sintesi ha direzionalità definitaà un filamento è sintetizzato nellastessa direzione dello
spostamento della forcina (leading strand), l'altro indirezione opposta all'avanzamento della forcina (lagging strand)
Il filamento leading o guida è sintetizzato in modo continuo
Il filamento lagging (ritardatario) in modo discontinuo a partire da inneschi multipli
I segmenti di DNA (frammenti di Okazaki) del filamento discontinuo saranno poi saldati da DNA ligasi
La sintesi avviene in modo rapido:
Inneschi di RNA: 25-50 nt /sec
DNA: 500-1000 nt/sec
Gli inneschi di RNA sono diversi (tra eucarioti e procarioti) per lunghezza e per tipo di enzima coinvolto
Eucarioti inneschi di 10nt RNA +30nt DNA
Procarioti inneschi di 5nt
Le DNA polimerasi che svolgono vera e propria sintesi durante la replicazione del DNA sono la DNA pol III (procarioti) e la DNA pol δ (eucarioti)
Le DNA pol III e delta sono dotate anche di attività esonucleasica 3'→5': consente la correzione di bozze o proof reading del segmento appena sintetizzato (mismatch/appaiamenti errati si
verificano con frequenza di 10-6 ma grazie a correzione scendono a 10-9
Gli inneschi sono eliminati e sostituiti con DNA dall'attività esonucleasica 5'->3' di DNA pol I nei batteri e da RNasiH negli eucarioti
Ligasi salda frammenti
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