Fisiologia Vegetale, prof. Cerana

NADPH

I vari trasportatori sulla membrana tilacoidale sono disposti in alternanza tra trasportatori di soli elettroni e scambiatori elettroni/protoni. In questo modo si forma un gradiente protonico. Alla luce quindi lo stroma passa da pH 7 a 8 (basificazione) mentre il pH del lume del tilacoide scende sotto 5 (acidificazione). Il gradiente elettrico che si formerebbe è tamponato da ioni Cl- che fluiscono dallo stroma al lume. Dal lume escono invece K+ e Mg2+. Il cloro serve inoltre per attivare il complesso di produzione di ossigeno. Il ΔpH è utilizzato dalla ATPsintasi del cloroplasto per produrre ATP. Questo enzima è una sintasi di tipo F con F0 subunità canale e F1 sito attivo. Anche senza luce il gradiente protonico serve per la sintesi di ATP. Uno scenario alternativo è che la ferredossina riduca il cyt b6-f così da dare un ciclico scambio di elettroni attorno al psI. Il trasporto ciclico non necessita del psII (e quindi non...)

Il fotosistema I preleva gli elettroni dal questo pool di plastochinoni ridotti.

Il ciclo di Calvin-Benson è noto come PCR (Photosintetical Carbon Reduction) ed è presente in tutti i fotosintetici eucarioti. È il ciclo di riduzione fotosintetica del carbonio o ciclo C3, in quanto il primo composto che si forma a seguito della fissazione è un composto con 3 atomi C. Questo ciclo è sempre presente e non è mai sostituito dai cicli ausiliari C4 e CAM.

In un esperimento si tratta il preparato cellulare con anidride carbonica marcata con C e poi lo si lascia riposare con CO2 normale. Calvin e Benson utilizzarono cellule di Chlorella sp. (alga verde). Essi trovarono che tutto il carbonio marcato era passato nel 3-Fosfoglicerato (3-PGA) all'inizio e successivamente veniva trasferito nel saccarosio.

Il ciclo è diviso in 3 fasi:

• Carbossilazione (una reazione)
• Riduzione del C3 (due reazioni)
• Rigenerazione dell'accettore

Il Ribulosio-1,5P viene carbossilato dalla RuBisCO (Ribulosio Carbossilasi Ossigenasi). CO e O competono per lo stesso sito di legame all'enzima. In tutti gli eucarioti la RuBisCO è circa 500kDa ed è formata da 8 subunità L (55kDa) e 8 subunità S (14kDa). Il sito catalitico si trova nelle subunità L. Queste subunità sono sintetizzate dal cloroplasto. Le subunità S sono invece sintetizzate dal nucleo e la loro produzione è stimolata dalla luce. Alghe rosse/brune sintetizzano tutte le subunità nel cloroplasto mentre i batteri hanno solo un dimero S+L. Il Ribulosio è un chetoso ed è in equilibrio con la sua forma enolica. → → La CO si attacca al C del ribulosio: Rub-1,5P (en) + CO C6 + H O 2 3-PGA.2 2 2 20 La carbossilazione ha un ΔG' = -52 kJ/mol e la RuBisCO ha una Km = 8-26μM. Sono delle concentrazioni di CO che si trovano nello stroma, in equilibrio con le concentrazioni

atmosferiche (circa 10μM).

2. Le reazioni sono gluconeogenetiche:

• →3-PGA + ATP →1,3-PGA + ADP (enz: 3 fosfoglicerato chinasi)
• →+ +1,3-PGA + NADPH + H GAP + P +NADP (enz: Gliceraldeide-3P deidrogenasi NADPH-dipendente)

La GAP-DH citosolica lavora con NAD, questa che sta nel cloroplasto usa invece NADPH

Si moltiplica quindi tutto per 3:

• → →3 Rub-1,5P + 3 CO 6 PGA + 6 ATP 6 GAP2

Le 6 gliceraldeidi sono così riutilizzate:

• 1 GAP è usata come guadagno netto
• 5 GAP sono usate nella tappa rigenerativa (tappa 3) e sono impiegate 3 come GAP e 2 come DHA

Il guadagno netto se resta nel cloroplasto forma Amido I, mentre se va nel citosol viene usato per produrre saccarosio.

223. La tappa rigenerativa è un mix di gluconeogenesi e ciclo dei pentoso-fosfati nella sua parte non-ossidativa.

L’isomerizzazione GAP <-> DHAP è catalizzata da una “Trioso fosfato isomerasi”

Le tappe gluconeogeniche sono:

• →GAP

1. DHAP Fru-1,6P (Aldolasi) → Fru-1,6P + H2O Fru-6P + P (Fosfatasi del fruttosio)
2. Fru-6P + GAP Eritrosio-4P + Xilulosio-5P (Trans-chetolasi)
3. Eritrosio-4P + DHAP Sedoeptulosio-1,7P (Aldolasi)
4. Sedoeptulosio-1,7P + H2O Sedoeptulosio-7P + P (Fosfatasi)
5. Sedoeptulosio-7P + GAP Xilulosio-5P + Ribosio-5P (Trans-chetolasi)
6. 2 Xilulosio-5P → 2 Ribulosio-5P (Epimerasi)
7. Ribosio-5P → Ribulosio-5P (Isomerasi)
8. 3 Ribulosio-5P + 3 ATP → 3 Ribulosio-1,5P + 3 ADP (Ribulosio chinasi)

Questa reazione chiude il ciclo poiché i 3 Rub-1,5P possono reagire di nuovo con 3 CO2.

Il bilancio netto è dunque: → + +3 CO2 + 5 H2O + 6 NADPH + 9 ATP GAP + 6 NADP+ + 3 H+ + 9 ADP + 8P2

Alcune considerazioni:

• Per ogni CO2 si usano 2 NADPH e 3 ATP
• Per ogni O2 liberato produco NADPH e ATP (reazioni tilacoidali) sufficienti a organicare CO2

deduce che fase luminosa e oscura sono interdipendenti tra di loro perché se si esaurisce il NADPH/NADP ifotosistemi si bloccano allo stato ridotto. Ogni 6CO si produce un esoso che viene respirato. Quindi per produrre 1 Glc utilizzo 12 NADP e 18 ATP.

2Bilancio energetico:

• 0Respirazione: ΔG' = -2804 kJ/mol
• 0 0Energia utilizzata: 18* -30 kJ/mol (ΔG' ATP) + 12* -217 kJ/mol (ΔG' NADPH) = -3144 kJ/mol 23

Quindi la cellula utilizza più energia per produrre un esoso di quanto poi la sua respirazione possa restituire, l'efficienza è di circa il 90% (estremamente alta).

Regolazione:

Molti enzimi del ciclo sono attivati dalla luce. Alla luce lo stroma si basifica e il lume si acidifica, inoltre, le concentrazionidi magnesio aumentano nello stroma dato che lo ione fluisce dal lume allo stroma.

Regolazione per concentrazione ionica: RuBisCO e fosfatasi sono attivate dall'alcalinizzazione del mezzo

e2+dall’aumento di Mg• 2+RuBisCO nel sito attivo forma un carbammato complessato a Mg grazie al suo residuo Lys201. Per attivare- 2+l’enzima entra una CO attivante a formare il carbammato (-NHCOO ) a cui si lega Mg dato che la sua2concentrazione si alza. Questo complesso fa attivare la RuBisCO che può legare così il suo substrato• Esiste una RuBisCO non attivabile perché ha il sito attivo impegnato da uno zucchero fosforilato. Lozucchero viene staccato grazie alla “RuBisCO-attivasi” che usando ATP determina una modificazioneconformazionale nell’enzima che libera il suo sito attivo• Regolazione per modificazioni covalenti: gli enzimi soggetti sono le fosfatasi, la GAP-DH e altri. Il gruppo S-S deattiva l’enzima. Alla luce la ferredossina si riduce che agendo sulla Tioredossina fa ridurre i pontidisolfuro a -SH HS- così da attivare gli enzimi. Questo fa sì che la fase oscura non avvenga al buio e che

La luce influenzi positivamente l'attivazione di questi enzimi. 24FOTORESPIRAZIONE: Attività ossigenasica della RuBisCO, il ciclo C2 Questa attività si chiama "Ciclo di Ossidazione Fotosintetica" (PCO) o "Ciclo C2" dato che viene metabolizzato un composto a 2 atomi C. È anche detto "Fotorespirazione" perché c'è consumo di ossigeno e produzione di anidride carbonica. Le prime evidenze che in presenza di luce ci fosse fissazione di CO si ebbero negli anni '20 grazie agli esperimenti di Warburg condotti sempre su Chlorella. La fissazione di CO si misura in μM/(m s) e sembra essere inibita dalla presenza di O2. Da questo esperimento si è scoperto che tutte le RuBisCO degli esseri viventi hanno attività ossigenasica. L'anidride carbonica fissata aumenta quindi al diminuire della quantità di ossigeno presente in atmosfera. Nel cloroplasto avviene la reazione catalizzata dalla

RubisCO: → →2 Rub-1,5P + 2 O [2 C5] + 2 H O 2 3-PGA + 2 2-Fosfoglicolato2 2

Il 3-PGA va nel ciclo C4 mentre il 2-Fosfoglicolato entra nel ciclo C2 dato che è un forte inibente della RuBisCO. La metabolizzazione del 2-PGL coinvolge cloroplasti, perossisomi e mitocondri.

Cloroplasto: • →2 2-PGL + 2 H O 2 Glicolato + 2 P (Fosfoglicolato fosfatasi)2

Perossisoma: • →2 Glicolato + 2 O 2 Gliossilato + 2 H O (Glicolato Ossidasi)2 2 2

• →2 H O 2 H O + O2 2 2 2

• →2 Gliossilato + 2 Glu 2 Gly + 2 α-chetoglutarato (Transaminasi)

Mitocondrio: • →+ + 4+Gly + NAD CO + NADH + H + NH2

Il complesso della Glicina-Decarbossilasi catalizza questa decarbossilazione ossidativa e il complesso stesso lega il gruppo metilene della glicina che rimane. Il NADH essendo nel mitocondrio è indirizzato alla catena di trasporto degli elettroni.

• →Metilene-GDG + Gly + H O Serina + GDG (Serina-indrossimetil-transferasi)2

Perossisoma: •

→Serina + α-chetoglutarato Glu + Idrossipiruvato (Transaminasi)• →+ +Idrossipiruvato + NADH + H Glicerato + NAD (Idrossi-piruvato reduttasi)

Cloroplasto:• →Glicerato + ATP 3-PGA + ADP (Chinasi)

Il 3-PGA entra nel ciclo di Calvin. 25→Riassumendo: 2 2-PGL 3-PGA + CO 2• Recupero il 75% del carbonio• Perdo il 25% del carbonio come CO 2• Consumo energia come 1 ATP e nella liberazione di ammonio che è tossico. L’organicazione dell’ammonioconsuma infatti altra ATP e avviene nello stroma del cloroplasto.

Il consumo globale di energia del ciclo C2 è quindi 2 ATP e l’equivalente di 1 NADPH.

Bilancio energetico:Se [O ] = [CO ] dello stroma l&r