Fisiologia dei sistemi

PREPARAZIONE DEI VETRINI

1. Prendi un grande vetrino

2. Lavare il vetro con etanolo al 70%

3. Aggiungere una piccola goccia di mezzo di montaggio al centro del vetrino.

4. Estrarre il vetro di copertura con le cellule (usare ago e/o puntina) e inserire una goccia del mezzo di montaggio

5. ATTENZIONE: ricorda che le cellule crescono sulla cima del bicchiere. Metti il vetro di copertura – con le celle che toccano il mezzo di montaggio CHIEDI assistenza!!

6. Osservare al microscopio a fluorescenza. l’actina

7. I mitocondri appaiono come macchie verdi, appare come una linea verde, il nucleo appare blu

8. Per conservare a lungo ricoprire con smalto da unghie. Tenere al buio.

OSSERVAZIONE + CONSTATAZIONE

Possiamo colorare le tre parti singolarmente o possiamo colorarle insieme in ogni caso avremo sempre le diverse componenti colorate in modo diverso. In questo caso possiamo osservare un fibroblasto:

Citoscheletro colorato in verde dalla falloidina coniugata con FITCH- Mitocondri colorati in

rosso con il Mitotracker red- Nucleo colorato in blu con Hoechst- CRIOCONSERVAZIONE

Requisiti necessari prima del congelamento cellulare:

• Le cellule devono essere prive di contaminazione sotto forma di batteri, lieviti o funghi
• I test del micoplasma devono essere eseguiti prima del congelamento
• I mezzi di congelamento devono essere scelti in base alla linea cellulare
• Un extra-fiala deve essere salvata per testare il successo del congelamento (fiala di controllo)
• Convalida delle linee cellulari
• Dobbiamo essere certi del numero di passaggi e che il numero di cellule sia abbastanza elevato

PRINCIPI DI CRIOCONSERVAZIONE

1. CONTESTO TEORICO DEL CONGELAMENTO DELLE CELLULE

Congelare lentamente per consentire all'acqua di lasciare la cellula, ma non troppo lentamente da incoraggiare la crescita dei cristalli di ghiaccio (freezing slow)

Utilizzare un crioprotettore idrofilo per rimuovere l'acqua dalle cellule

Conservare le cellule alla temperatura più bassa possibile per

Ridurre al minimo gli effetti di alte concentrazioni saline sulla denaturazione delle proteine nelle micelle all'interno del ghiaccio.

Scongelare rapidamente per ridurre al minimo la crescita dei cristalli di ghiaccio e la generazione di gradienti di soluto, che si forma quando il ghiaccio intracellulare residuo si scioglie. (thawing rapid)

CONCENTRAZIONE CELLULARE

Le cellule sembrano sopravvivere meglio al congelamento se congelate a concentrazioni elevate. La migliore concentrazione di cellule va da 1 x 10 / mL a 1 x 10 congelata in 1 mL di mezzo di congelamento. Se congeliamo meno o più cellule dobbiamo di conseguenza diminuire o aumentare (o dividere le cellule i più cryovials) il volume del mezzo di congelamento.

MEZZO DI CONGELAMENTO

La sospensione cellulare viene congelata in presenza di un crioprotettore come glicerolo o dimetilsolfossido (DMSO). Di questi due, il DMSO sembra essere il più efficace, forse perché penetra nella cellula meglio.

del glicerolo. Vengono utilizzate concentrazioni (che dipendono dalla lineacellulare e dal laboratorio) tra il 5% e il 20%, ma il 7,5% o il 10% è più comune. Per i fibroblasti di pecora la concentrazione di DMSO è del 20%

Altri crioprotettori sono stati suggeriti, come il polivinilpirrolidone (PVP), il polietilenglicole (PEG) e- l'amido idrossietilico (HES), ma nessuno ha superato l'efficienza del DMSO o del glicerolo, sebbene possa esserci qualche miglioramento con il trealosio

Il terreno di coltura di congelamento è essenzialmente composto da DMSO o glicerolo (i- crioprotettori) e FBS

Molti laboratori aumentano anche la concentrazione sierica (FBS) nel mezzo di congelamento al 40%, 50% o persino al 100%. Ma la concentrazione delle componenti dipende dai laboratori, dalle cellule che devono essere congelate, dai protocolli ecc…

4) VELOCITÀ DI RAFFREDDAMENTO

La maggior parte delle cellule in coltura sopravvive meglio se viene raffreddata a

1 ° C / min.- Questo è probabilmente un compromesso tra congelamento rapido che minimizza la crescita dei cristalli di ghiaccio e raffreddamento lento che incoraggia la migrazione extracellulare dell'acqua. Il nostro laboratorio usa il contenitore di congelamento Mr. Frosty come una camera per congelare le celle perché consente di raggiungere un tasso di raffreddamento molto vicino a -1 ° C / minuto, esso rappresenta il tasso ottimale per la conservazione delle cellule e fornisce i migliori risultati in termini di vitalità cellulare. 15) CRYOVIALS Le cryovials di plastica sono di solito in polipropilene- solitamente con una capienza di 1,2/1,5 ml. Possono essere etichettati con un pennarello a punta fine, o etichette, che dovrebbero essere resistenti all'alcool e resistere alle basse temperature del congelatore. L'etichetta dovrebbe mostrare la designazione del ceppo cellulare- preferibilmente, la data iniziale e le iniziali che ha eseguito.dell'utente procedura di congelamento, sebbene quest'ultima non sia sempre possibile nello spazio disponibile. Anche i tappi di colore diverso aiutano l'identificazione. -6) CRYO-CONGELATORI Il stoccaggio in un congelatore di azoto liquido è attualmente il metodo più soddisfacente per preservare cellule in coltura, tessuti ed embrioni. Le cellule congelate sono trasferite rapidamente al cryofreezer quando sono a o sotto -70 °C. Esistono due tipi principali di conservazione utilizzati per cryovials da 1 ml che contengono colture cellulari: 1) canna di alluminio; 2) cassetti rettangolari. Essi vengono poi trasferiti nell'azoto liquido e qui vengono conservate per anni. Questi due metodi vanno scelti sempre in base al protocollo, al tipo di cellula, allo spazio disponibile ecc... in laboratorio. Ogni laboratorio che attua metodiche di crioconservazione è provvisto di un quaderno per l'annotazione e la descrizione delle procedure utilizzate. 2

La procedura di congelamento cellulare è semplice ma deve essere eseguita con cura per permettere alle cellule di conservarsi nel migliore dei modi per il maggior tempo possibile. Come nella procedura di subcoltura cellulare, le cellule vengono staccate dal contenitore, viene rimosso il terreno di coltura, vengono lavate con PBS, vengono staccate con la tripsina, vengono centrifugate per eliminarla, il surnatante cellulare viene aspirato. In questo step, le cellule devono essere contate per assicurarci della quantità di terreno di coltura di congelamento da inserire (1 x 10^5-7 cellule in 1 mL di mezzo di congelamento).

Le cellule sono poi risospese nel nuovo terreno di coltura; fare attenzione nell'aggiunta del DMSO che è tossico per le cellule (va inserito goccia per goccia). Successivamente, le cryovials vengono inserite nel Mr.Frosty nel congelatore per 24h a -80°C e poi verranno trasferite nell'azoto liquido, dove verranno conservate per anni.

37) SCONGELAMENTO CELLULARE, per minimizzare la crescita intracellulare dei cristalli di ghiaccio i cryovials dovrebbero essere scongelati il più rapidamente possibile durante il processo di riscaldamento. La sospensione cellulare deve essere diluita lentamente dopo lo scongelamento, poiché la diluizione rapida riduce la vitalità. La maggior parte delle cellule non richiede centrifugazione, in quanto la sostituzione del mezzo il giorno seguente sarà sufficiente. Tuttavia, alcune cellule (spesso cellule in crescita) sono più sensibili ai crioprotettori, in particolare al DMSO, e devono essere centrifugate dopo lo scongelamento, ma devono comunque essere diluite lentamente prima nel terreno. Le cryovials vengono tirate fuori dal cryo-congelatore e alle cellule nei cryovials è aggiunto terreno di coltura tiepido (tutta la procedura deve essere condotta sotto cappa). Il congelamento in azoto liquido è.sicuramente il metodo più utilizzato per conservare materiale biologico per lunghi periodi, inoltre la procedura è estremamente semplice. L'unica cosa di cui necessitiamo è l'attrezzatura ovvero cryo-congelatori, terreni per la cryo conservazione e azoto liquido. Svantaggi della crioconservazione: Sono necessarie alcune accortezze: il livello di azoto liquido all'interno dei cryo-congelatori deve essere sempre controllato. Gli operatori devono lavorare con estrema attenzione perché l'azoto liquido a contatto con la pelle provoca gravi ustioni. I costi delle attrezzature sono alti e altri rischi dell'utilizzo del congelamento con azoto liquido sono le contaminazioni dei campioni congelati. L'impatto ambientale nella produzione e nel trasporto di azoto liquido è alto: si produce moltissima CO2 (ogni mese 400000 tonnellate di CO2). Vantaggi della crioconservazione: Porzioni di tessuto, gameti e linee cellulari provenienti daitessuti di animali in via di estinzione- vengono conservati per salvare il loro genoma (48.000 campioni provenienti da oltre 5500 specie in pericolo e non animali; progetto "L'Arca congelata") Sono conservati più di dieci milioni di campioni congelati di linee cellulari per terapia sostitutiva- cellulare e gameti per terapia di riproduzione assistita Metodo veloce, semplice- 4LIOFILIZZAZIONE Tanti sono i problemi legati alla conservazione di materiale biologico per congelamento ecco perché si sta cercando di ricorrere anche ad altri metodi. La liofilizzazione potrebbe essere un metodo alternativo per conservare materiale biologico in uno stato anidrobiosi (ovvero assenza di acqua o una sua presenza molto minima) a temperatura ambiente per lunghi periodi; questa metodica è comunemente utilizzata nell'industria farmaceutica e nel settore alimentare. Al contrario della tecnica di congelamento che segue una semplice procedura, quella di liofilizzazione nonhaancora un protocollo stabilito da seguire. Sappiamo di avere alcuni dati a favore come:

• Conservazione per anni senza bisogno di energia
• Non ci sono danni per gli operatori
• Perdita di peso e di volume pari al 95%
• Può essere conservato a temperatura ambiente
• Conservazione domestica

Per stabile un protocollo di liofilizzazione di materiale biologico dobbiamo essere certi degli effetti dell'aliofilizzazione e dei lioprotettori sul materiale trattato. Sono stati scoperti diversi organismi come semi, lievito, spore fungine, nematodi, tardigradi... che possono sopravvivere alla disidratazione quasi completa per moltissimi anni e dopo essere stati reidratati essi sono in perfette condizioni. ANIMALI ANIDROBIOTICI Tardigradi - il Water bear Questi animali sopravvivono a:

• essiccazione a meno dell'1% di acqua
• una volta che vengono reidratati