Fisiologia animale (lezioni 1-5)

Fisiologia animale lezione 1

Sperimentazione animale

• Studio dello stato dell’arte (massima conoscenza che si può avere) su un argomento specifico attraverso articoli, libri, etc.
• Definizione di una ipotesi
• Definizione di un design sperimentale
• Esecuzione degli esperimenti
• Analisi dati ottenuti
• Verifica ipotesi
• Discriminazione dei risultati per la pubblicazione

Articolo di giornale

• Titolo che deve essere breve
• Autori che vengono messi in ordine di importanza, il primo e l’ultimo sono i più importanti
• Abstract
• Introduzione che tratta dello stato dell’arte in breve e la definizioni d’ipotesi di lavoro (tutto quello che c’è stato prima del mio lavoro)
• Descrizione materiali e tecniche usate non troppo dettagliata, precisa al punto che un tecnico medio sia in grado di capire
• Risultati degli esperimenti
• Analisi critica e discussione dei dati
• Riferimenti bibliografici
• Dovrà essere approvato dall’editore della corretta rivista scientifica (ve ne sono molte specializzate in diversi campi), che rivolgendosi ad altri collaboratori spesso consiglierà all’autore modifiche, ridiscussione di alcune parti etc.
• Impact factor: rapporto annuale tra il numero di volte che gli articoli di una rivista sono stati citati diviso il numero di articoli pubblicati; più questo valore è alto più la rivista ha una certa considerazione presso una comunità scientifica

Quale modello biologico utilizzare?

• In vitro (modelli abbastanza semplici): linee cellulari (cellule immortalizzate, tutte uguali tra di loro, si coltivano su terreni arricchiti, crescono come un monostrato, costo ridotto, le caratteristiche della linea non cambiano nel tempo), colture primarie (diverse dalle linee cellulari, derivano direttamente da un organismo e non sono immortalizzate), cocolture (metto insieme tipologie diverse di cellule), colture organotipiche (metto più tipi cellulari che si trovano nello stesso organo, si cerca di mimare la complessità di un organo), colture 2D e 3D (es. sospensioni in matrice solida)
• Ex vivo (possono essere tenute senza modifiche rispetto alla loro vita nell’organismo per non molto tempo): colture di tessuto, colture d’organo
• In vivo: topo, ratto, coniglio, primati, ruminanti, cane, gatto, uomo

Invece di usare un modello posso direttamente usare la specie di nostro interesse? È possibile! Ne sono un esempio le cavie umane volontarie, in realtà tutti partecipiamo alla sperimentazione nella fase finale (fase 4) di un farmaco, si raccolgono infatti i dati statistici. Es. dati raccolti sui FANS (farmaci antinfiammatori) aspetto collaterale infiammazione della mucosa gastrica poiché la ciclossigenasi 1 e 2 (crea muco protettivo a livello gastrico) viene inibita dai FANS.

Come scelgo l’organismo modello da utilizzare?

• Scelgo una specie vicina a quella d’interesse, oppure una che determinate caratteristiche che ritrovo nella mia specie d’interesse.

Problemi legati alla sperimentazione animale

• La specie utilizzata è spesso diversa da quella di interesse
• Sistemi complessi (non sempre un risultato è evidente subito, considerando comunque organismi complessi il risultato ottenuto potrebbe non esser dato solo dai meccanismi che ci interessano)
• Riproducibilità dei dati (nel caso di una linea cellulare i risultati delle mie sperimentazioni, essendo le cellule tutte uguali tra di loro saranno gli stessi sia nel mio laboratorio, che in un laboratorio dall’altra parte del mondo; nel caso di un modello animale vi sono fattori che possono ridurre la riproducibilità dei risultati in diversi laboratori)
• Costo (costo acquisto, mantenimento, acquisto gabbie, conti gestione del personale, sistemi controllo temperatura etc.)
• Problemi etici

Cosa si può fare allora?

• Modelli in vitro
• Modelli in silico (molto usato in farmaceutica)

Notevoli semplificazioni rispetto a un modello biologico complesso, maggiori possibilità di generare artefatti, maggiore difficoltà nel trasferimento delle informazioni nell’organismo di interesse.

Le 3 R

Nel momento in cui faccio sperimentazione animale devo stare attento al benessere del modello e a non causare sofferenze inutili:

• Replacement: sostituire l’animale con quelli a sviluppo neurologico minore
• Reduction: ridurre il numero di animali utilizzati, decidendo a priori quali sono gli esperimenti e quanti animali utilizzare
• Refinement: miglioramento delle procedure, es. tecniche manipolazioni animale per ridurne lo stress

Come scegliere la specie sperimentale

• Modello vs specie interesse
• Similitudini con la specie di interesse (distanza filogenetica)
• Strutture idonee alla stabulazione
• Costo gestione per animale
• Disponibilità di conoscenze e competenze tecniche
• Tempo di generazione della specie
• Eterogeneità genetica
• Sperimentazioni precedenti

Specie più utilizzate: Mus musculus (topo), Rattus norvegicus (ratto bianco), conigli, in alcuni casi cani e gatti.

Topi

Animali usati molto frequentemente come i FVB (manca di linfociti), C3H e altri tipi. Perché utilizzo modelli immuno-deficienti (i topi nudi)? Per trapianti ad esempio, non avrò infatti reazioni di rigetto; se ho un farmaco può essere interessante vedere gli effetti su un organismo immunodeficiente; non avendo pelliccia sono facilitato nelle misurazioni delle masse tumorali.

L’FVB è un topo bianco, albino. Perché uso albini? Per una questione di comodità, l’albinismo è un carattere recessivo, bisogna stare attenti negli accoppiamenti; si usa l’albinismo per valutare la perdita di altri caratteri.

Un carattere che può cambiare da un ceppo all’altro è l’aggressività nel comportamento. Vi sono diversi ceppi:

• Inbred strain: ceppo mantenuto per accoppiamenti tra fratello e sorella per almeno 20 generazioni, omozigoti per tutti i caratteri
• Coisogenic strain: ceppo che differisce da un inbred solo per una mutazione in un unico locus, es. ci sono due ceppi di topi coisogenici che differiscono per una proteina che è una proteina di superficie delle cellule del sistema immunitario (CD45)
• Congenic strain: ceppo che si ottiene incrociando una progenie eterozigote con un ceppo inbred parentale per almeno 10 generazioni, continuando a selezionare l’eterozigosi per uno specifico locus (introduzione di una eterozigosi in un ceppo inbred)
• Deriva genetica: tendenza ai geni ad “evolvere” anche in assenza di una pressione selettiva
• Knockout, knock-in: topi in cui un locus viene eliminato (KO) oppure uno o entrambi gli alleli vengono sostituiti da transgeni (knock-in)

Notizie di carattere generale

• Raggiungimento maturità sessuale: 5-8 settimane (maschi intorno nella maggior parte dei casi intorno alle 6 settimane)
• Vita media: variabile a seconda del ceppo (alcuni possono essere più inclini a patologie) e delle mutazioni. Dai 6 mesi ai due anni circa
• Vita riproduttiva: 7-8 mesi circa (altamente variabile)
• Ciclo riproduttivo: la durata del ciclo estrale è di circa 4-5 giorni con ovulazione al terzo giorno. La gravidanza dura circa 19-21 giorni e il numero di piccoli varia dai 2/3 a più di 12 a seconda del ceppo
• Età di svezzamento: circa 21 giorni
• Distinzione maschio-femmina: distanza ano-genitale, la dimensione
• Vi sono alcune differenze tra i diversi ceppi a livello di quanti maschi nascono nella progenie o quante femmine, questi valori di solito tabulati servono ad esempio quando si vuole avere una progenie a maggioranza maschile. Una progenie maschile infatti non è sottoposta ai processi ciclici della riproduzione.

Condizioni di stabulazione (devono essere costanti)

• Temperatura e umidità: 16-26°C (ottimale 21°C), 40-60%
• Ciclo luce/oscurità: 12h ciascuno è il più utilizzato. Per incrementare l’efficienza riproduttiva si può passare a 14h di oscurità/10h di luce (topi animali ad attività prevalentemente notturna)

I topi sono molto sensibili a rumori, vibrazioni e odori intensi. Inoltre, una manipolazione delicata effettuata sempre dallo stesso operatore a intervalli regolari riduce il livello di stress dell’animale. Se non sto attento-->STRESS--> ridotta fertilità, cannibalismo dei piccoli da parte della madre, aggressività, alterazioni metaboliche, endocrine e comportamentali.

In una gabbia c’è segatura per assorbire i bisogni degli animali, la ruota limita lo stress dell’animale, gli permette infatti movimento, la carta può essere utilizzata dal roditore per crearsi un ambiente protetto e al contempo deve esser strappata per esser riutilizzata (altra attività fisica).

Spesso è necessario avere condizioni di grande sterilità, ad es. con i topi immunodepressi anche l’uomo può diventare agente di patologia. Per ogni gabbia si ha un cartellino identificativo con diverse informazioni es. data inizio trattamento, ceppo del topo, sesso, etc.

Accoppiamento e gravidanza: quando?

• Vaginal plug: tappo di eiaculato solidificato che è possibile identificare nella vagina della femmina tra le 8 e le 30h dopo l’accoppiamento (esame fatto al mattino). INDICA SOLO L’ACCOPPIAMENTO NON L’INSTAURARSI DELLA GRAVIDANZA! (per capire se femmina è gravida palpazione addome al giorno 11, posso anche valutare se il peso aumentato o meno).
• Vi sono alcuni ceppi modificati in cui la madre non può allattare--> adozione da parte di un’altra madre; metodo utilizzato di solito per dividere in piccole nidiate una progenie con più di 6 piccoli, di solito la femmina che adotta necessita di riconoscere il suo odore nei cuccioli per adottarli, come si fa? Si mettono insieme i piccoli da adottare con i piccoli propri della femmina, la madre adottiva viene stimolata a urinare da un tecnico di laboratorio, che fa sì che l’urina cada sui cuccioli--> prendono l’odore della femmina che li riconosce come “propri”

Alimentazione

Si cerca di non avere variabili diverse dai nostri esperimenti: bisogna mantenere costante una dieta che scegliamo, di solito si usano dei pellet solidi che contengono tutti i nutrienti essenziali e acqua in abbondanza. Si possono però utilizzare delle diete più idonee a un determinato ceppo, ad es. diete iper/ipocaloriche; in altri casi ad esempio per un animale transgenico che ha problemi nella masticazione non si usano pellet solidi ma sostanze nutritive gelatinose. Si adatta la dieta a quello che si ha davanti e alle proprie esigenze alimentari. Per gli animali immunodeficienti possono essere anche comprati nutrienti sterilizzati. La gabbia è caratterizzata da una parte in cui si trovano gli animali (sopra la lettiera) e al di sopra da una gabbietta in cui viene messo il cibo e un beverino in cui è infilata una bottiglia d’acqua, di solito l’animale si alza sugli arti posteriori per nutrirsi. Un’eccezione a questo metodo di alimentazione si può fare durante lo svezzamento poiché gli animali sono piccoli, si mettono i pellet direttamente nella segatura.

Esistono sistemi in cui la gabbia viene inserita in un sistema di circolazione forzata dell’acqua, la gabbia è infilata in degli armadi che presentano valvole per l’acqua--> non si utilizzano bottiglie d’acqua. Spesso c’è un filtro sulla superficie per un ricircolo forzato dell’aria, serve per rimuovere accumuli di ammoniaca dovuti all’urinazione dell’animale.

Come faccio ad accorgermi che nello stabulario è entrato un patogeno?

Me ne accorgo dallo stato di salute degli animali o ancora meglio posso far gabbie in cui metto degli animali “sentinella” che sono utilizzati per verificare la presenza di patogeni, questi animaletti saranno poi soppressi e studiati. Le sentinelle devono essere ultra esposte ai potenziali agenti patogeni, vengono fatte confluire nella loro gabbia tutte le altre arie delle altre gabbie. Se però non ho un sistema di ventilazione forzata ma statica come faccio? Posso mettere gli animali sentinella in gabbie con arie non filtrate, oppure nel momento in cui devo cambiare la segatura delle altre gabbie ne tengo un pochino e la metto nella gabbia delle sentinelle--> si crea un misto di segature che espone per forza le sentinelle a possibili patogeni.

Identificazione degli animali

Cartellino sulla gabbia: numero dei topi, sesso, DOB (date of birth), trattamento in corso, accoppiamenti, codice alfanumerico esperimento, etc.; spesso ho bisogno di identificare un topo in una gabbia, ci sono due modi, una marcatura temporanea e una permanente.

• Temporanea: non molto usata, colorazione con pennarello (dura solo 1-2 giorni), coloranti nel cibo (dura 1-2 settimane), rasatura del pelo.
• Permanente: metodo ear tag (marca auricolare, placca metallica pinzata all’animale su cui è messo un numero progressivo) l’animale a volte però può staccarselo da solo; ear clipping si fanno dei taglietti o delle punzonature sulle orecchie seguendo una determinata legenda, l’animale deve essere anestetizzato per la marcature; toe clipping, raramente autorizzato, si tagliano delle dita all’animale, lo si può fare solo nei primi 12 gg di vita, arti anteriori per numerare le decine, arti inferiori per le unità, il vantaggio di questa tecnica sta nel riutilizzo delle dita che possono essere usate per estrarre DNA; tatuaggio, permette enumerazione molto numerata, posso usarla sia su animali adulti che neonati, nel primo caso tatuo un numero sulla coda, nel secondo una macchia sul palmo delle mani.

Topo transgenico

Mi serviranno poi dei sistemi per vedere se effettivamente il topo presenta il transgene Genotipizzazione, non serve in caso di inbred strain o di caratteri sempre omozigoti poiché la progenie sarà sempre omozigote. Genotipizzazione: recupero materiale biologico, estraggo DNA, PCR; per gli animali transgenici la PCR non è ritenuta sufficiente perché pur permettendo di capire omo/eterozigosi per determinati caratteri non posso capire sempre dove si trova e quante copie del transgene si sono integrate nel genoma, utilizzo allora il southern blotting. Il southern blotting: frammento il DNA, lo separo per elettroforesi e trasferisco i frammenti su una membrana di solito di nitrocellulosa e con una sonda marcata vado a vedere i transgenici, a seconda delle bande che otterrò avrò diverse integrazioni dei transgeni.

Crioconservazione degli embrioni (di solito in azoto liquido)

• Permette il mantenimento a basso costo di ceppi poco utilizzati
• Riderivazione per eliminazione di patogeni
• Maggiore facilità e sicurezza nel trasferire ceppi
• Costo elevato
• Conoscenze tecniche richieste

In quali animali posso reimpiantare gli embrioni? In una femmina pseudo-gravida, il ciclo estrale di 4-5 giorni si allunga a circa 11 giorni nel caso in cui ci sia stato accoppiamento ma non fecondazione, la condizione è simile alla gravidanza.

Metodiche di soppressione degli animali

Ad esempio se mi accorgo che l’animale sta soffrendo troppo oppure se ho bisogno di alcuni organi alla fine del mio periodo di sperimentazione, oppure se decido che devo solo fare sperimentazioni sui maschi sopprimo buona parte della progenie femminile. Ideale: indolore, rapida, ininfluente sui test sperimentali, causa poco stress all’animale, affidabile, sicura per l’operatore. Tutela sia il benessere animale che le esigenze sperimentali. Sempre CONFERMARE la morte dell’animale! Indipendentemente da metodiche consentite a livello ministeriale o di ateneo, ogni struttura di stabulazione può avere normative più restrittive in atto.

• Asfissia con CO2 (molto efficace e usata, non tutela però il benessere dell’animale)
• Dislocazione cervicale (ratti sotto i 150g)
• Decapitazione
• Iniezione letale (overdose di barbiturico, anestetico+tanax), cessa respirazione, si usa ad esempio per sopprimere cani e gatti
• Proiettile captivo penetrante (animali di media-grossa taglia), la pressione causa la fuoriuscita istantanea del proiettile morte per danno cerebrale

Lezioni 2-3

Lo stress

Stress: risposta a una compromissione del proprio stato di benessere fisico e psicologico, l’alterazione può avere diverse graduazioni, la risposta dovrebbe essere commisurata alla frequenza degli stimoli stressanti. La risposta può essere neuroendocrina (ipofisi, surreni, glucocorticoidi, GH, ormoni tiroidei), immunitaria (glucocorticoidi, GH, citochine), comportamentali (generalmente lotta o fuga, con varie sfumature ad esempio ci può essere un aumento aggressività, esplorazione, vigilanza).

Ipotalamo e ipofisi

Nel diencefalo, ventralmente al talamo, forma il pavimento del terzo ventricolo, estremamente associato a ipofisi. Ipofisi ghiandola principale poiché regola il comportamento di tutte le altre ghiandole, si trova sotto l’ipotalamo nella sella turcica. Si divide in adenoipofisi, pars intermedia, neuroipofisi (estensione ipotalamo). Ipotalamo produce fattori di rilascio che son rilasciati nel sistema portale ipofisario e questo produce ormoni che hanno funzione di controllo altre ghiandole es. surrenale, tiroide, gonadi, in alcuni casi come l’ormone della crescita, si ha crescita tessuti periferici. In un sistema del genere diventano fondamentali i sistemi a feedback. Gli ormoni che sono prodotti dall’ipofisi e dalla surrenale arrivano anche alle cellule dell’ipotalamo che esercitano funzione inibitoria per i fattori di rilascio di ormoni che permettono controllo surrenale es. CHR, feedback negativo; esistono anche alcuni meccanismi...