Fisiologia 1

Fisiologia

Canali ionici

Sono state scoperte centinaia di geni codificanti per meccanismi di trasporto ionico. Vengono classificati secondo:

• Meccanismo
• Permeabilità
• Gating (meccanismo di controllo di apertura e chiusura)
• Omologia di sequenza
• Farmacologia

Tutti i canali mostrano proprietà comuni: gating, selettività e permeazione. I canali ionici funzionano come enzimi, cioè la loro azione riduce la barriera energetica della membrana plasmatica per il flusso ionico.

Il gating

Un canale ionico presenta più conformazioni stabili (minimi locali di energia). In alcune di queste il canale è aperto, in altre è chiuso. Il gating consiste nell’utilizzo di una data forma di energia per superare le barriere energetiche che separano i diversi stati. Il gating dei canali ionici può venire modificato da:

• Potenziale di membrana (canali voltaggio-dipendenti)
• Presenza di una data molecola (canali ligando-dipendenti)
• Stimoli meccanici (canali meccanosensibili)
• Altri (canali termosensibili, canali di leakage...)

Inoltre, il gating di un canale si può considerare una reazione chimica. La velocità della reazione dipende dalla barriera energetica G’ da superare. La percentuale di canali aperti all’equilibrio dipende da Gc-Go. Il profilo energetico del canale cambia con il gating. Le gates sono parti del canale che cambiano conformazione permettendo o impedendo il passaggio degli ioni. L’inattivazione fa chiudere un canale dopo un certo periodo di tempo nello stato aperto; le gates di inattivazione sono diverse da quelle di attivazione.

Il gating dei canali ionici è suddiviso in gating da voltaggio e gating da ligando. Lo studio delle proprietà del gating avviene mediante la tecnica del patch-clamp con cui si misurano le correnti che fluiscono attraverso i canali.

Classificazione dei canali

Secondo le modalità di attivazione:

• Attivati dal voltaggio
• Attivati da ligandi
• Attivati da stimoli meccanici

Secondo gli ioni permeanti:

• Canali del Na⁺
• Canali del K⁺
• Canali del Ca²⁺
• Canali del Cl^-
• Canali non selettivi

Nomenclatura standard:

• Ione (se il canale è permeabile a una sola specie)
• Meccanismo di gating (es Ach o v)
• Famiglia molecolare
• Numeri progressivi

Voltaggio dipendenti

I canali voltaggio-dipendenti sono tetrameri. Ciascuna subunità (o pseudosubunità) contiene parte del poro ed un sensore del voltaggio (elica S4). L’elica S4 dei canali voltaggio-dipendenti contiene residui carichi positivamente. Le variazioni del potenziale di membrana muovono S4 verso il lato che diventa più negativo della membrana. Il movimento di S4 modifica la conformazione della via di permeazione, aprendo e chiudendo il canale.

Superfamiglia Kv

Originariamente conteneva solo i canali del K voltaggio-dipendenti. È stata estesa ai canali del Na e del Ca voltaggio-dipendenti, ed ulteriormente ai canali Ca²⁺-dipendenti e CNG (cyclic-nucleotide-gated).

Inattivazione ball and chain

I canali possono avere una o più subunità principali e accessorie. Il meccanismo a “ball and chain” può essere sulla subunità principale (alfa) oppure sulla subunità accessoria (beta). L’inattivazione può essere più o meno rapida e completa. I canali del K che inattivano sono detti I_A, quelli che non inattivano delayed rectifier.

Gating dei canali voltaggio-dipendenti

1. Attivazione dovuta al voltaggio
2. Inattivazione (voltaggio-dipendente/tempo-dipendente/Ca²⁺-dipendente)
3. Modulazioni (azione del Ca²⁺ / azione di cAMP, cGMP / fosforilazione-defosforilazione)

I canali per il cloro

Canali ClC: hanno due pori. Canali CFTR: Se non funzionale provoca la fibrosi cistica. Iperattivato dalla tossina colerica. Responsabile della secrezione di muco e sudore. Regolato dall’AMPc. Trasporta Cl^- e bicarbonato. Il poro ha diametro ristretto solo per una parte dello spessore della membrana ma può accomodare più ioni.

Filtro di selettività: regione che seleziona gli ioni permeanti rispetto agli altri. Il filtro di selettività dei canali del Na è asimmetrico e contiene residui polari o carichi. Lo ione Na passa con una molecola di acqua. Nel caso dei canali del Ca invece, in assenza di Ca i canali sono permeabili al Na; in presenza di Ca a basse concentrazioni la corrente di Na è inibita. Per la permeazione del Ca²⁺ servono due ioni nel canale. Il Mg blocca i canali ionici. I canali inward rectifier non hanno voltaggio-dipendenza intrinseca ma la corrente uscente viene ridotta per blocco da parte del Mg²⁺ (o di poliamine intracellulari).

Ligando-canali-dipendenti

• Kv-simili (Canali CNG, Canali TRP, Canali K(Ca), Canali GIRK, Canali K(ATP); Altri canali Kv-simili sono fortemente modulati da ligandi (es Ih, Cav)
• Canali intracellulari per il rilascio di Ca²⁺ (Localizzati in compartimenti del reticolo endoplasmico (stores) Due classi: IP3R e RyR. Proteine molto grandi)
• nACh-simili
• Recettori del glutamato
• Recettori P2X

Recettori ionotropici (che includono un canale ionico) possono essere distinti in base alle proprietà strutturali in:

1. Recettori nicotino simili (per Ach, GABA, Glicina)
2. Recettori per Glutammato (Nterminale extracellulare e Cterminale intra; il sito di legame extracellulare è tra M3 e M4 – dominio S2)
3. Recettori per ATP (tre subunità e due alfa elica)

I recettori pentamerici – nicotino simili - (detti anche Cys-loop) sono:

• Nicotici (acetilcolina)
• 5-HT3 (serotonina)
• Glicinergici (glicina)
• GABA-A

Recettori per il Glutammato, si dividono in base alla loro affinità per quest’ultimo in:

• NMDA (alta affinità, permeabili a K, Ca e Na; Blocco da Mg)
• NON NMDA (bassa affinità, permeabili a K, Ca e Na, ma cinetica di apertura e chiusura più rapide)

Recettori per ATP:

• P2X, con sette subunità che possono assemblarsi a costituire recettori omo o eteromerici funzionali. Formati da due segmenti transmembrana, con N e C terminali intracellulari, e un’estesa ansa extracellulare fra i due segmenti transmembrana, che rappresenta il dominio d’interazione con ATP.

Altri canali:

• Acquaporine: canali di membrana permeabili all’H₂O. Capacità di permeazione paragonabile alla libera diffusione, escludono il passaggio di specie ioniche. Unico inibitore è il mercurio.

Contrazione muscolare

Il muscolo liscio: involontario, attivato spesso in via riflessa dal sistema nervoso autonomo in risposta a stimoli diversi.

Il muscolo striato: scheletrico, attivato dal SNC, attraverso le fibre nervose motorie, in risposta ad un desiderio cosciente (movimento volontario). Può essere anche responsabile di atti motori involontari (riflessi) in risposta a stimoli esterni. Cardiaco: pur essendo striato, è involontario.

La contrazione muscolare si basa sull’azione di proteine specializzate, i motori molecolari, capaci di convertire l’energia libera dell’idrolisi dell’ATP in uno spostamento reciproco rispetto a strutture filamentose che funzionano da binario.

Nel muscolo, i motori molecolari, sono costituiti da miosina, e lavorano in schiere sullo stesso supporto filamentoso, costituito da actina. La contrazione muscolare quindi è il risultato di interazioni cicliche, ATP-dipendenti, tra motore molecolare miosina II e l’actina, che funziona da binario.

La contrazione varia in base alla struttura del muscolo, che può essere striato o liscio. Il muscolo striato comprende muscolo cardiaco e muscolo scheletrico. Il muscolo cardiaco costituisce un organo cavo le cui cellule, sebbene striate, si contraggono come un’unità e in modo spontaneo e modulato dal SNVegetativo. Il muscolo scheletrico è invece formato da cellule di forma allungata e che in genere si contraggono sotto controllo volontario; generalmente i meccanismi di contrazione del muscolo cardiaco sono comuni a quelli del muscolo scheletrico, e differiscono dalla contrazione del muscolo liscio.

Il materiale contrattile all’interno della fibra muscolare è organizzato in strutture cilindriche, le miofibrille, disposte in parallelo; nelle miofibrille, il materiale contrattile, è disposto in unità dette sarcomeri che si ripetono in direzione longitudinale per tutta la lunghezza della fibra muscolare. Il sarcomero è l’unità strutturale del muscolo striato e contiene la zona di sovrapposizione tra filamenti spessi (polimerizzazione della miosina) e filamenti sottili (polimerizzazione actina). La forza e l’accorciamento sono generati nella zona di sovrapposizione per interazione fra filamento di actina e la porzione globulare (testa) della miosina, che protrude dal filamento a formare il cross bridge (ponte trasverso).

In tutti i tipi di tessuto muscolare, il segnale di controllo dei meccanismi di contrazione è affidato a variazioni della concentrazione di calcio intracitoplasmatica; molto bassa nelle cellule muscolari rilasciate, aumentata da processi di accoppiamento eccitazione-contrazione che originano nel sarcolemma in riposta ad un pda.

Nel muscolo liscio la regolazione viene esercitata prevalentemente sulla miosina da parte di proteine del filamento spesso, nei muscoli striati la regolazione opera sull’actina attraverso l’inibizione dell’interazione actomiosinica prodotta da un complesso di proteine che fanno parte del filamento sottile: troponina, e tropomiosina.

Le miofibrille delle cellule muscolari scheletriche e cardiache si contraggono in seguito all’insorgenza del pda nel sarcolemma. Nel muscolo striato, è quindi stato dimostrato che il segnale elettrico di membrana attiva la risposta meccanica per cui provoca un transitorio aumento della concentrazione di Ca intracellulare. Muscolo scheletrico e miocardico presentano differenze relative all’origine del Ca che genera il transiente, ai meccanismi che rilasciano il catione nel citoplasma promuovendo la contrazione, e meccanismi che rimuovo il catione e che quindi ne promuovono il rilasciamento. Il muscolo scheletrico sfrutta modalità “tutto o nulla”, rapide ed efficaci, mentre il muscolo miocardico presenta modalità graduate, meno rapide e potenti, ma capaci di modulazione.

Nel muscolo scheletrico l’eccitazione elettrica si propaga lungo i tubuli T, ma il Ca necessario per la contrazione è liberato da depositi intracellulari, ovvero cisterne terminali del reticolo sarcoplasmatico, che formano, con i tubuli T, le triadi. La pompa del Ca, SERCA, è presente ad elevate concentrazioni solo nel RS delle cellule muscolari. A differenza di quanto avviene nel muscolo scheletrico, la presenza di Ca extracellulare è indispensabile per la contrazione dei miociti. Il ruolo principale nell’attivazione della contrazione è svolto, come nello scheletrico, da ioni Ca provenienti da depositi intracellulari; si evince quindi che l’ingresso di Ca dall’esterno serve, in parte, a rifornire i depositi intracellulari che liberano Ca per attivare la contrazione.

Il rilasciamento dei miociti cardiaci è assicurato da SERCA, e macromolecole ancorate al sarcolemma assicurano l’estrusione del Ca entrato dal liquido extracellulare durante pda.

Contrazione del muscolo liscio

Presenta una più bassa velocità di accorciamento e un minore consumo di ATP, il che consente di mantenere una contrazione prolungata nel tempo. Possono essere classificati in unitari e multiunitari. Le cellule muscolari lisce hanno una forma affusolata e un unico nucleo; mancano di una striatura trasversa perché l’apparato contrattile non è organizzato in miofibrille. Sono prive di tubuli T, ma posseggono abbondanti caveole che rappresentano il sito di accoppiamento eccitazione-contrazione. Il RS liscio è il principale compartimento intracellulare di deposito di Ca. Il meccanismo contrattile implica l’interazione di actina e miosina; l’aumento del Ca intracellulare e il suo legame con la calmodulina determina l’azione dell’enzima chinasi della catena leggera di miosina, con conseguente fosforilazione delle catene regolatrici della miosina; quest’ultima attiva l’ATPasi della testa della miosina e consente l’avvio del ciclo dei ponti trasversi dell’actina.

Il rilasciamento muscolare è successivo alla riduzione della concentrazione intracellulare di Ca, con dissociazione del complesso Ca-calmodulina e chinasi della catena leggera della miosina, riduzione dell’attività della chinasi e defosforilazione della miosina da parte della fosfatasi della catena leggera della miosina.

Il segnale d’inizio della contrazione è l’aumento del Ca intracellulare, che deriva dall’ambiente extracellulare attraverso canali voltaggio-dipendenti per il Ca di tipo L, che si aprono in risposta alla depolarizzazione della membrana. Le fibre muscolari lisce presentano inoltre canali per il Ca ligando-dipendenti, che possono aprirsi in risposta all’azione di uno specifico stimolo, e altri che vengono aperti dallo stiramento della membrana. L’ingresso di Ca dall’ambiente esterno stimola il rilascio di Ca dal RS, un processo noto come liberazione di Ca indotta da Ca. La riduzione della concentrazione intracellulare di Ca avviene per ricattura di Ca da parte del RS oppure per estrusione del Ca nell’ambiente extracellulare. I muscoli lisci sono controllati da segnali che possono essere neurotrasmettitori, ormoni o sostanze paracrine.

Pda: potenziale d’azione

Il pda è una rapida variazione del pdm che segue lo stimolo ma evolve in modo indipendente da esso; viene innescato in risposta ad uno stimolo depolarizzante; quindi è innescato da depolarizzazioni della membrana, e generato dalle cellule eccitabili, cioè cellule provviste di un corredo di canali ionici voltaggio-dipendenti per Na e K. Il pda presenta decorso e ampiezza stereotipata (fenomeno tutto-o-nulla), e una volta raggiunto un valore di picco (+30 mV) si estingue spontaneamente. Il pda si trasmette rapidamente e non decade con la distanza. La depolarizzazione che innesca il pda è detta potenziale generatore, la sua propagazione è unidirezionale, e numero e distribuzione temporale dei pda dipende dalle proprietà dei potenziali generatori e dell’encoder.

Nel muscolo striato il pda viene sempre generato alla giunzione neuromuscolare in risposta a uno stimolo sinaptico, e ha funzione di innescare il processo di contrazione. Nei neuroni l’encoder (regione dove si innesca il pda) è solitamente il cono di emergenza dell’assone e la decisione di generare un pda è molto più complessa, ha funzione di segnale e consente la trasmissione dei messaggi.

Nel sistema nervoso ci sono 10¹²–10¹⁵ neuroni che formano 10¹⁰ sinapsi. Un neurone può ricevere diverse centinaia o migliaia di sinapsi; l’attivazione di ciascuna sinapsi modifica il potenziale di membrana e all’encoder arriva un segnale che rappresenta la somma di tutti i segnali sinaptici. A seconda dell’ampiezza del segnale viene generato o meno un pda.

Le fasi

Il pda è sempre un fenomeno transitorio che insorge e si estingue in tempo breve. In tutti i pda sono presenti due fasi:

• Depolarizzazione: fase iniziale, che insorge non appena lo stimolo abbia raggiunto la soglia (nella maggior parte delle cellule circa 15mV), e che consiste in una rapida depolarizzazione che porta pdm al suo potenziale di riposo di circa -60/-90mV fino a 0 e oltre. Ciò dà luogo ad una transitoria “eccedenza” (overshoot) in cui l’interno della membrana diviene positivo (20/30mV) rispetto all’esterno. Con l’overshoot si tocca il massimo della variazione del pdm (spike del pda).
• Ripolarizzazione: segue alla depolarizzazione, che regredisce più o meno rapidamente fino a portare pdm al livello di riposo. A volte si può andare oltre il potenziale di riposo, livello che permane per un certo periodo e che è detto potenziale postumo.

Il ritardo con cui avviene la fase di ripolarizzazione indica la durata del pda, diversa nei vari tipi cellulari. Nelle cellule nervose è ampio e molto rapido (2ms); nel muscolo scheletrico lento (5ms); nel muscolo cardiaco molto lento (200ms). Nelle cellule eccitabili in cui il pda è particolarmente duraturo, tra le due fasi si interpone un periodo più o meno protratto, detto plateau, in cui la membrana resta polarizzata ad un valore vicino allo zero.

Soglia del pda

Depolarizzazione minima in grado di generare un pda.

Legge del tutto o nulla

Un pda si genera e si sviluppa in tutta la sua ampiezza, oppure non si genera affatto.

Refrattarietà

Per un certo periodo la cellula non è in grado di generare un secondo pda. La sua membrana diviene quindi refrattaria, insensibile, alla stimolazione. Due tipi:

• Assoluta: accompagna e segue il potenziale nessuno stimolo sarà in grado di evocare un nuovo pda (canali Na inattivati).
• Relativa: segue quella assoluta è possibile evocare un pda (canali Na non inattivati), purché lo stimolo abbia un’intensità più elevata rispetto allo stimolo soglia (soglia alta per canali K aperti).

La durata della refrattarietà assoluta è correlata alla durata del pda. Se il potenziale generatore è troppo lento si ha accomodazione e il pda non si genera.