Etilene, brassinosteroidi e acido abscissico

Etilene

Introduzione all'etilene

L'etilene regola diverse funzioni nelle piante: maturazione dei frutti, risposte allo stress, espansione degli organi, risposte alle ferite, senescenza e risposte alla sommersione. Nel 1901, Dimitry Neljubow, studiando la crescita di plantule di pisello in laboratorio, si accorse che mostravano strani sintomi definiti tripla risposta: inibizione dell’allungamento del fusto, aumentata crescita radiale del fusto e aumentata formazione dell’uncino apicale. Se le plantule erano cresciute all’esterno del laboratorio, non mostravano tali sintomi. Neljubow ipotizzò che l’etilene prodotto dalla combustione del gas illuminante delle lampade del laboratorio fosse la causa della crescita anomala. Il gas illuminante era prodotto dalla distillazione del carbone e conteneva alti livelli di etilene.

Caratteristiche dell'etilene

L’etilene è un ormone gassoso ed è il più semplice degli alcheni con molecola planare. A temperatura e pressione ambiente, è un gas più leggero dell’aria, infiammabile e facilmente ossidabile. L’ossidazione porta prima alla formazione di ossido di etilene e quindi di glicole etilenico. Nei tessuti vegetali, l’etilene è completamente ossidabile a CO₂. Tutti i tessuti delle piante superiori hanno la capacità di sintetizzare etilene. La sintesi avviene al sito di azione, ma l’ormone può muoversi liberamente attraverso le cellule. L’etilene diffonde attraverso la fase gassosa degli spazi intercellulari verso l’esterno nell’aria.

Con una concentrazione di etilene in fase gassosa di 1 µL/L (= 45 mM) a 25 °C, la concentrazione di etilene in fase acquosa è circa 4.4 nM (~ 10.000 volte di meno: praticamente insolubile in acqua). Alte produzioni di etilene si riscontrano in tessuti senescenti, in tessuti sottoposti a stress o a ferite e nei frutti in fase di maturazione (> 1 nL/g peso secco/h). L’etilene è biologicamente attivo a concentrazioni bassissime: ≤ 1ppm (= 1 µL/L). Pertanto, dato che frutti, vegetali e fiori producono etilene durante la conservazione, la concentrazione dell’ormone nell’ambiente di conservazione deve essere strettamente controllata.

Funzioni e risposte delle piante all'etilene

Sin da subito è stata scoperta la sua funzione associata alla maturazione dei frutti, e anche adesso è molto utilizzato per questo aspetto. Infatti già in antiche colture veniva utilizzato per far maturare le mele, ed è utile anche per la maturazione dei fichi. Ciò che accade a mutanti nella percezione di tale ormone è un'inibizione dell’espansione della foglia, un’accelerazione della senescenza sempre della foglia e un’inibizione dell’elongazione della radice (e questo fa sì che le piante wild type siano molto più grandi di quelle mutate, che sono nane).

Le prime analisi sono state fatte su come l’etilene potesse regolare un processo di sviluppo. Si vide da subito che l’etilene contiene al suo interno tre risposte principali, per questo quando si parla di etilene si parla di tripla risposta:

• Riduzione dell’elongazione
• Ispessimento a livello della porzione dell’ipocotile
• Marcato ripiegamento dell’uncino apicale, che normalmente viene a formarsi ma che l’etilene ripiega fortemente

Questo tipo di tripla risposta è indispensabile per far sì che vengano selezionate le piante sensibili, ipersensibili e resistenti all’etilene, proprio perché varia questa risposta che è facilmente osservabile. L’etilene ha anche una risposta molto veloce. In particolare, in un esperimento è stato introdotto etilene in una pianta che è stata monitorata per circa 7 ore. Si è visto che quando viene aggiunto etilene si blocca la crescita della porzione apicale, se invece viene eliminato l’ormone la crescita riprende da subito. Ciò significa che l’ormone è percepito immediatamente e la sua risposta è attivata in tempi molto brevi.

Quando fu identificato per la prima volta, l’etilene fu “purificato” da mele in maturazione. In pratica vennero catturati i composti volatili da frutti in maturazione. A seguire, la gas cromatografia ha permesso di rilevare e percepire composti un po’ più sviluppati. È stata vista una correlazione tra la produzione di etilene e alte temperature. Inoltre, va considerato che l’etilene è un determinante per causare la maturazione, e non solo una conseguenza. L’etilene è comunque correlato a una risposta da stress e si è visto che doveva essere presente un precursore per l’etilene in seguito a una privazione di ossigeno.

È stato fatto un esperimento in cui sono stati studiati frutti a cui era stato tolto ossigeno; dopo la privazione di ossigeno si è visto che doveva esserci un qualche accumulo di precursori per produrre etilene, perché anche in assenza di ossigeno veniva prodotto etilene. Da questo studio quindi si capisce qual è il primo precursore dell’etilene: amminocicloopropano-carboxilic acid (ACC) questo è il precursore che va ad accumularsi in assenza di ossigeno e va a produrre etilene.

Pathway di biosintesi dell'etilene

L’etilene è prodotto dalla metionina (MET, carbonio 3 e 4) attraverso la S-adenosilmetionina sintetasi e successiva azione degli enzimi ACC sintasi (ACS) e ACC ossidasi (ACO). ACC sintasi e ACO sono enzimi rari e instabili; ACO è una ossidasi contenente ferro che richiede ascorbato come accettore di elettroni e bicarbonato come attivatore. La sintesi di etilene è regolata soprattutto a livello della reazione catalizzata dall’enzima ACS. L’accumulo di ACS è il passaggio rate-limiting per la sintesi di etilene.

• L’enzima ACS è codificato da 9 geni in Arabidopsis e da 12 in pomodoro; queste differenti proteine mostrano diverse funzioni.
• Alcune proteine ACS sono fortemente regolate con meccanismi post-traduzionali.

Il mutante con perdita di funzione di tutti e 9 i geni ACS non è vitale. Pertanto l’etilene è necessario per la sopravvivenza della pianta. In Arabidopsis, ACS è codificato da 9 geni ed è un dimero. I prodotti della famiglia genica ACS possono generare potenzialmente 45 tra omodimeri ed eterodimeri. Tuttavia, solo 25 sono funzionanti. Differenti dimeri di ACS possiedono diverse proprietà catalitiche. Il set dei geni per ACS espressi in ogni cellula determina il tipo di dimeri che si formano ed influenza la velocità di sintesi di etilene. I pattern di espressione dei geni variano col tipo cellulare e in base all’inducibilità da diversi fattori (es. IAA, ferita). Alcuni di questi geni sono inducibili da etilene.

Regolazione e funzione dell'ACS

Studi genetici hanno identificato i mutanti eto (ethylene-overproducer). Partendo da semi trattati con agenti mutageni e fatti germinare e crescere su agar in presenza o in assenza di etilene, è stato isolato il mutante eto1 ed altri mutanti simili (eto3). I mutanti eto mostrano la risposta tripla in aria (quindi anche in assenza di etilene). La causa è una produzione di etilene da 10 a 100 volte superiore rispetto al WT.

Perché il mutante eto1 produce una quantità esagerata di etilene?

La mutazione porta alla perdita di funzione della proteina ETO1 che nel wild type interagisce con l’enzima ACS e lo ubiquitina avviandolo alla degradazione proteolitica. Gli isoenzimi ACS sono normalmente soggetti a rapida proteolisi; la fosforilazione stabilizza gli isoenzimi interferendo con l’azione di ETO1. Perché in certe condizioni l’attività di ACS è stabilizzata? Allorché la pianta è esposta ad attacchi da parte di patogeni, a ferite, a stress o ad ormoni (ad esempio auxine). La maggiore stabilità di ACS è conseguita con la fosforilazione della proteina e porta alla maggiore produzione di etilene, necessaria per affrontare le suddette situazioni.

I recettori e la via di signaling

La risposta all’etilene. Nel 1980 fu realizzato uno screening genetico in semi di Arabidopsis trattati con agenti mutageni e fatti germinare e crescere su agar in presenza o in assenza di etilene, furono scoperti vari mutanti che mostravano insensibilità all’ormone. Su tali mutanti furono intrapresi una serie di studi per identificare la via di signaling dell’etilene a livello molecolare:

• Mutanti insensibili all’etilene: non presentano la tripla risposta in presenza dell’ormone (etr = ethylene-resistant; ein = ethylene-insensitive; ers = ethylene response sensor).
• Mutanti con risposta costitutiva: presentano sempre la tripla risposta in assenza di etilene (aria) (ctr = constitutive triple response).

ETHYLENE RESPONSE1 (ETR1) codifica per un recettore di etilene in Arabidopsis. ETR1 fu la prima proteina ad essere identificata in modo non ambiguo, come recettore ormonale nelle piante (1993). La struttura dedotta comprende:

• Dominio di legame dell’etilene.
• Dominio GAF (forse con funzione di regolazione, anche se non è nota la funzione precisa; si sa che simili domini presenti in altre proteine legano il cGMP e funzionano da domini regolatori).
• Dominio dell’istidina chinasi (H).
• Dominio ricevente (D).

Il genoma di Arabidopsis contiene una famiglia multigenica (5 geni) che codifica per 5 proteine con funzione di recettori: ETR1, ERS1, EIN4, ETR2, ERS2. Tuttavia, l’attività dell’istidina chinasi è presente solo in ETR1. L’attività chinasica contribuisce poco al signaling? Si distinguono due subfamiglie i cui membri condividono alte percentuali di identità di sequenza; le differenze tra le due famiglie sono invece alte. La sottofamiglia II ha un dominio transmembrana extra (rettangolo verde) nel dominio legante l’etilene rispetto alla sottofamiglia I. Inoltre, nella sottofamiglia II il dominio dell’istidina chinasi è poco conservato. Infine, un membro di ogni sottofamiglia manca del dominio ricevente D.

Funzionamento dei recettori per l'etilene

Non sappiamo ancora quale sia l’esatto meccanismo di signaling, ma abbiamo un’idea generale sul funzionamento dei recettori dell’etilene. Mutanti in cui almeno tre recettori dell’etilene hanno perso la loro funzione (Fig. A) mostrano un fenotipo con risposta costitutiva all’etilene (ctr). Da ciò si ricava che se i recettori sono integri, in assenza dell’ormone, inviano segnali (con un meccanismo sconosciuto) inibitori della risposta ormonale. Pertanto, nel wild type (Fig. B) i recettori, in assenza dell’ormone, sono attivi e sopprimono la risposta all’etilene. Quando si lega l’etilene, il recettore si disattiva (forse attraverso un cambiamento conformazionale delle sue proteine) permettendo alla via di signaling di procedere oltre (Fig. C). Il legame dell’etilene col suo recettore richiede rame come cofattore. Il dominio transmembrana del recettore dell’etilene è un omodimero in cui ciascun monomero è formato da tre segmenti transmembrana (1, 2, 3). I due monomeri sono uniti da un doppio ponte disolfuro –S––S–. La cisteina-65 e l’istidina-69 dei segmenti 2 transmembrana coordinano un atomo di Cu²⁺ (Fig. A). L’etilene si lega al Cu²⁺ accettando elettroni dal metallo (Fig. B). I mutanti ran di Arabidopsis presentano la mutazione di una proteina (RAN1) che trasferisce il Cu al dominio transmembrana del recettore; il risultato della mutazione del gene RAN è un recettore privo di Cu e incapace di legare l’etilene.

Cosa accade dopo il legame di etilene col recettore ETR1?

Il mutante ctr1 di Arabidopsis presenta tripla risposta costitutiva in assenza di etilene (Fig. A). Tale mutazione non interessa il recettore ma qualche altro componente della via di signaling. Il fatto che questa mutazione causi l’attivazione della risposta all’etilene in assenza dell’ormone (via normalmente repressa nel wild type, Fig. B), suggerisce che la proteina codificata dal gene CTR1 agisca come un regolatore negativo nella via di signaling sopprimendo la risposta all’etilene. In presenza di etilene, ETR1 interagisce con CTR1 e lo inattiva. CTR1 interagirebbe direttamente col recettore dell’etilene ETR1, percependo il segnale ormonale (ma non si conosce ancora in che modo) e inattivandosi. L’analisi delle sequenze di CTR1 ha mostrato somiglianze con le proteine RAF, ossia un tipo di proteina chinasi serina/treonina MAPKKK (Mitogen Activated Protein Kinase) coinvolte nella trasduzione del segnale negli animali. In assenza di etilene, la cascata di chinasi sarebbe attiva, causando l’inibizione della via di risposta all’ormone.

Inibitori della sintesi di etilene

Gli inibitori della sintesi di etilene sono:

• L’acido amminoossiacetico (AOA)
• L’acido amminoetossivinilglicina (AVG)

Entrambi inibiscono l’attività degli enzimi che partecipano alla sintesi dell’etilene.