Esercitazioni istologia

i nuclei sono colorati con azocarmìno che li colora in rosso (Azan Mallory), a differenza dei nuclei, le fibre collagene saranno colorate in blu grazie alla miscela di Mallory.

sotto c’è tessuto connettivo fibrillare.

il materiale istologico deve essere preparato, per fare questo si incorre in diversi problemi.

1. la luce attraversa solo materiale con spessore molto ridotto, quindi il materiale deve essere sezionato (lo spessore più usato è 4 micron, che si ottiene solo attraverso i microtomi).
2. i tessuti biologici sono molli, quindi prima della sezione deve essere indurito, per la microscopia ottica si parla di inclusione in paraffina (solida a temperatura ambiente) oppure di congelamento in azoto liquido ad una temperatura di circa -196°, all’interno delle nostre cellule si cerca di evitare la formazione di grossi cristalli di ghiaccio quindi si (i tessuti congelati vengono sezionati con il criostato che ha un microtomo a una temperatura fra -5 e -69 gradi) serve per mantenere la morfologia.
3. i tessuti sono incolori e privi di contrasto.

Sequenza dei passaggi in una tipica procedura istologica

1. fissazione di un campione di tessuto
2. congelamento o inclusione del pezzo
3. taglio al microtomo
4. montaggio su vetrino
5. “bagni” in soluzioni di coloranti
6. disidratazione e coverslipping (montaggio)
7. osservazione al microscopio ottico

la fissazione viene fatta per immersione e, dopo essere trascorso il tempo necessario, si arriva alla paraffina (fonde a 60° e quando è liquida non si mescola con l'acqua); si deve togliere l’acqua dopo la fissazione, cioè una disidratazione con concentrazione crescente di alcool etilico. Quando dovrò togliere l’alcool utilizzerò lo xilene.

Alla fine della colorazione la sezione deve avere sopra un vetrino coprioggetto che verrà saldato tramite resina sintetica in modo da sigillare centralmente la sezione.

Le sezioni non sono idrofile quindi se dopo la colorazione ho ancora acqua devo disidratare ancora fino ad arrivare allo xilene.

1. la fissazione serve a preservare la struttura, la formalina aiuta ad evitare la degradazione; la fissazione deve essere eseguita velocemente prima dell’inizio dell’attività enzimatica, esistono vari fissativi (da ricordare solo formalina e formaldeide e tetrossido di .....)
2. l’inclusione prevede prima la disidratazione con l’alcol, la chiarificazione e l’infiltrazione in paraffina.
3. il taglio si fa al microtomo o al criostato che ha una fascia di temperature possibili che dipendono dal tipo di tessuto che si taglia.
4. recupero delle sezioni in un bagnetto di acqua, vanno distese altrimenti al microscopio si ha una cattiva messa a fuoco.
5. la colorazione serve per aumentare il contrasto e rendere visibili i particolari. i coloranti si comportano come molecole acide o basiche, uno basico legherà molecole acide (basofile) mentre uno acido legherà molecole basiche (acidofile).

(per le miscele da ricordare solo la Mallory)

per vedere i neuroni serve la tecnica di impregnazione di argento (istochimica), il nitrato di argento si lega ai neurofilamenti (una parte del citoscheletro), con questa tecnica si vede, oltre al corpo cellulare, anche dendriti assoni (sono con ematossilina eosina si vede solo il corpo cellulare).

Lo striscio di sangue la goccia viene messa su un vetrino, con un altro tiro verso sinistra per creare uno strato di cellule che devono aderire per cui si lascia asciugare lo striscio a temperatura ambiente e si fa una colorazione (i globuli rossi sarebbero trasparenti, il colore deriva dalla massa delle cellule, vedendone una non c'è). la colorazione per lo striscio è la May-Gruwald.

Istochimica

Insieme di metodi che mettono in evidenza molecole specifiche nella sezione, l’ematossilina eosina non è istochimica perché fa vedere componenti in generale, l’istochimica si riflette solo su particolari componenti. Per i lipidi abbiamo Suden 3 che da colore rosso, per i glucidi il reattivo di Schiff che da un colore magenta, il blu di toluidina genera la metacromasia cioè un viraggio di colore, uso un colorante blu ma la matrice della cartilagine si presenta in fucsia per un alto numero di cariche elettriche negative. C’è anche la possibilità di vedere la presenza di enzimi dando il substrato giusto all’enzima.Impregnazione argenica, gli spazi bianchi sono occupati da linfociti che non vengono colorati. Le fibre mieliniche sono membrane quindi fosfolipidi che vengono individuate con l’SO4. Tecnica di Von Kossa usa il nitrato di argento e fa ottenere colore nero dove ci sono depositi di cslcio (tessuto osseo). Per le fibre elastiche uso la resorcina fucsina che colora le fibre elastiche in blu.Nel tessuto adiposo i nuclei sono rossi (Azan Mallory).

Azan Mallory da nuclei rossi colorati con azocarmimio, il citoplasma appare più chiaro, in alto ci sono delle linee tute della stessa altezza che sono cellule epiteliali di rivestimento con nuclei tutti alla stessa altezza; vi è poi una cellula che si colora in modo differente e quindi è una cellula diversa che ha forma di un calice ed è una cellula epiteliale secernente esocrina. sotto c’è un intrecclo di cellule di cui si vedono principalmente i nuclei che compongono il tessuto connettivo fibrillare (propriamente detto). quelli sopra che possono sembrare ciglia in realtà non si può dire cosa siano (noi già lo sappiamo) con la microscopia ottica, si deve passare a quella elettronica a trasmissione.

ciglia sulla parte apicale, la linea rossa di prima corrisponde ai puntini allineati in superficie, cellule mucipare: nucleo verso la base e citoplasma pieno di vescicole, mentre le cilindriche non hanno la stessa colorazione. connettivo in basso

nuclei alla base, cellule con nuclei più in alto, in superficie, oltre ai microvilli e le ciglia, si possono trovare le stereociglia (non hanno capacità di movimento), in alto c’è una massa composta da spermatozoi e quindi ci troviamo sul dotto deferente. la parte connettivale ha una colorazione blu molto intensa quindi si tratta di un denso ed ha un orientamento dei fasci intrecciati, cioè in tutte le direzioni dello spazio.

ingrandimento sulle stereociglia e quindi si tratta di un epitelio

epitelio di transizione o polimorfo, si riconosce perchè ci sono cellule a forma di cupola sullo strato superficiale con nuclei sferici, queste cellule ricoprono le piriformi cioè le cellule sottostanti; l’epitelio non si lacera cambiando la propria superficie interna in base alle esigenze. sarà alto quando la vescica è vuota e basso quando è piena. sotto c’è un connettivo fibrillare mediamente denso, negli spazi bianchi del connettivo troviamo la sostanza fondamentale amorfa che non si colora.

si tratta sempre della vescica e quindi dell’epitelio di transizione, leggermente più basso del precedente.

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Azan Mallory, connettivo in blu che è il derma, ci sono strutture ad acino, i nuclei sono sempre più piccoli andando verso la parte centrale e il dotto escretore quindi vuol dire che le cellule sono programmate per morire e vanno a costituire il secret secondo modalità olocrina.

ghiandola esocrina perché vedo una struttura centrale con cavità molto ampie e un solo strato di cellule di forma cubica, è un dotto escretore. intorno c’è una confusione ma seguendo i nuclei vedo che la forma è sferica e non sono schiacciati, se sono di forma sferica e questa è una ghiandola allora la struttura circolare con una cavità che nemmeno si vede corrisponde ad un acino; i nuclei sono sferici e quindi le cellule dell’acino sintetizzano siero (se fosse stato muco il nucleo sarebbe stato schiacciato). tra i vari adenomeri (la maggior parte si vedono male) c’è del tessuto connettivo e quando sono molto uniti fra di loro sono presenti fibre reticolari e quindi collagene di tipo III. parte della parotide e la colorazione è una Mallory

presenza di ghiandole mucipare e sierose insieme, colorazione Azan Mallory, le strutture bianche (sono poche) e sono adenomeri a secrezione mucosa, i puntini rossi sono spinti alla base e non sferici; nella parte sierosa i nuclei sono rotondi e il citoplasma è colorato. si vedono poi 2 dotti escretori di diverso, questo fa presagire la presenza di un dotto principale ramificato (man mano che si ramifica il diametro dei dotti si riduce) la secrezione che prevale è quella sierosa. la parotide è completamente sierosa, la sottomandibolare è prevalentemente sierosa e la sottolinguale è prevalentemente mucosa sono le ghiandole salivari maggiori.

ghiandola esocrina, dotto escretore nella parte centrale sezionato longitudinalmente, non va confuso con il vaso e la differenza sta nell’epitelio, quello del dotto è cubico e quello dei vasi è un endotelio con cellule pavimentose. qui prevale la mucosa. in alto a sinistra ci sono nuclei sferici con citoplasma non bianco, si tratta di adenomeri sierosi. con una secrezione mista possono esserci anche adenomeri misti, quello che produce il siero è la semiluna del giannozzi. in basso a destra ci sono 2 spazi bianchi sotto al connettivo che sono cellule adipose.