Biochimica clinica - esame delle urine e rene

Micro-organismi Contaminanti.

1) Eritrociti provenienti da: glomerulo (dismorfici) e non glomerulari(normali).

Leucociti della classe polimorfo nucleati, eosinofili e linfociti provenienti da ogni

segmento del tratto urinario che indicano infiammazione e disordine immunologico.

Cellule tubulari dovute a Necrosi tubulare acuta, nefrite interstiziale acuta, malattie

glomerulari. Cellule di transizione dell’uroepitelio dovuto a lesioni leggere, lesioni

profonde, sfaldamento fisiologico. Casts (calchi)(calcoli?)(gessi) si formano nei tubuli

distali e nei dotti collettori grazie alle glicoproteine Tamm-Horsfall. Possono essere:

Ialini, Ialini-granulari, Granulari, cerosi, lipidici, Cellulari (erythrocytic,

leukocytic,epithelial), Contenenti cristalli, Contenenti microrganismi, Pigmentati, Misti.

I calcoli o parti di essi provengono dai reni. I cristalli comuni sono: Ossalato di calcio,

fosfato di calcio, fosfato triplo, Urati amorfi e fosfati. I cristalli patologici sono

composti da: colesterolo, cistine, leucine, tirosine e da 2,8 diidrossiadenine.

Ultimamente si è introdotta l’automazione anche nell’esame del sedimento con i

seguenti obbiettivi: • ridurre la variabilità analitica • ridurre l’errore pre-analitico ed

analitico • selezionare i campioni patologici da esaminare al microscopio • refertare in

tempo reale i campioni negativi • aumentare il livello qualitativo • ridurre il personale

dedicato.

Citofluorimetro (UF-100) L’UF-100 analizza campioni di urina “nativa”. Identifica e

conta gli elementi figurati presenti nell'urina utilizzando i principi della

citofluorimetria e dell’impedenziometria. Seleziona i campioni patologici. Studia le

popolazioni cellulari tramite grafici: • distribuzione volumetrica RBC (f. glomerulari e

non) • distribuzione volumetrica WBC (neutrofili e linfociti). Con questo tipo di

organizzazione, in cui i campioni negativi o congruenti sia per la chimica che per la

citofluorimetria vengono validati in automatico, il numero dei sedimenti da controllare

si riduce al 10- 15% dei campioni totali, permettendo una maggiore accuratezza nella

lettura dei vetrini. Ognuno degli elementi ha significato clinico: • emazie (presenti nel

50% dei campioni) = ematuria. • leucociti di solito polimorfonucleati,sono indice di

inf. batterica, ma se linfociti: infezione virale o rigetto • cilindri mucoproteina di

Tamm-Horsfall, in genere indicano patologia del nefrone specie quelli cellulari •

cristalli patologici: leucina, colesterolo, tirosina, cistina.

E’ utile esaminare la morfologia dei GR tramite un esame del sedimento per distinguere

l’ematuria di tipo GLOMERULARE dall’ematuria di tipo NON GLOMERULARE. I GR

urinari, in caso di origine glomerulare, presentano particolari deformazioni morfologiche

delle membrane cellulari (dismorfici). E’ proprio per questo “dismorfismo” è importante

per la discriminazione fra ematuria di origine nefrotica (emazie dismorfiche) e

post-nefrotica (emazie isomorfiche). Tale test è basato sulla valutazione della

morfologia delle emazie in contrasto di fase a fresco del sedimento. L’ematuria è

glomerulare se sono dismorfici almeno l’80% dei GR. Tuttavia limiti di questo test

rimangono la soggettività di valutazione, la presenza di forme dubbie e il cut-off.

PROTEINE URINARIE (Proteinuria) Concentrazione normale: <0,12g/24ore

Origine: plasmatica o renale/tissutale. La proteina principale è l’albumina (< 30 mg/L).

La proteinuria patologica è > 150 mg/24 h. Il quadro proteico è molto variabile.

Cause dell’aumento della proteinuria Fisiologica: intermittente (ortostatica,

post-prandiale, sforzo, stress) Pre-renale: alta pressione, ipertermia, problemi cardiaci o

epatici,… Alta concentrazione proteica (proteinuria da sovraccarico). Renale: danno

glomerulare o tubulare (o entrambi). Post-renale: danno al tratto urogenitale. Proteinuria

da sovraccarico La concentrazione di una proteina è aumentata a livelli patologici, al di

sopra della capacità di riassorbimento dei recettori tubulari specifici per questa proteina.

Cause catene leggere libere, nelle gammopatie monoclonali beta 2 microglobulina, in

alcune sindromi linfoproliferative lisozima, in alcune leucemie mieloidi acute

emoglobina, nella emolisi, quando l’aptoglobina è saturata orosomucoide, nel carcinoma

bronchiale mioglobina, nella rabdomiolisi Alcune di queste proteine possono indurre

una nefropatia (in particolar modo la proteinuria di Bence-Jones, con le catene leggere

libere).

Danno glomerulare: L’albumina e le proteine a peso molecolare > 67 kDa vengono

trovate nelle urine. Il più frequente negli adulti e nei bambini, in generale associata ad

un aumento della proteinuria (> 1 g/24h) Cause : diabete, malattie infettive

(batteriche, epatite B, varicella, sifilide, mononucleosi,…), varie malattie sistemiche

(autoimmuni, tumori,…), intossicazioni (sali d’oro, farmaci,…).

Danno tubulare: L’albumina (<30%) e le proteine a peso molecolare < 67 kDa

passano nelle urine. Di solito transitorio e sotto i 0.5 g/24-ore. Cause: primaria

(sindrome di Fanconi, sindrome di Bartler), malattie metaboliche (diabete, ossalosi),

gammopatie monoclonali (mieloma, Waldenström), farmaci (amminoglicosidi),

intossicazioni (metalli pesanti, amminosidi).

Riassorbimento tubulare: Le proteine a basso peso molecolare, < 67kDa, sono

riassorbite nel tubulo (endocitosi attiva). 99% delle proteine che sono filtrate dal

glomerulo, sono riassorbite nel tubulo.

Interesse diagnostico dell’elettroforesi delle proteine urinarie : Ricerca e

caratterizzazione di proteine ad alto e/o basso peso molecolare per la definizione del

danno renale (pre-renale, glomerulare, tubulare, post-renale). Ricerca e tipizzazione delle

catene leggere libere monoclonali nelle urine o proteina di Bence Jones e delle

Componenti Monoclonali intere (valutazione dello stadio di avanzamento di una

gammapatia monoclonale, prevenzione di problemi legati all’azione nefrotossica della

PBJ).La valutazione della proteinuria viene poi fatta su gel SDS-PAGE.

Immunofissazione: Tecnica immunologica per la rivelazione e la tipizzazione delle

componenti monoclonali in un siero o in un’urina. Per il DOSAGGIO IN SITU si utilizza

l’IMMUNOFISSAZIONE. Consiste nel fissare le CM (catene pesanti e leggere) in situ

(lastrine di agarosio) mediante specifici antisieri e poi colorarle dopo aver rimosso tutte

le altre bande non fissate, permettendo l’identificazione di una banda.

1. Migrazione., 2. Reazione Antigene anticorpo _Precipitazione dell’immunoglobulina

monoclonale in presenza degli antisieri diretti contro la sua catena pesante e quella

leggera nel gel, 3. Eliminazione delle proteine che non hanno reagito, 4. Colorazione del

gel. La presenza di una immunoglobulina monoclonale (gammapatia) è caratterizzata

da una banda monoclonale rivelata sia con uno degli antisieri anti catena pesante

(gamma, alfa o mu) che con l’antisiero anti catena leggera (kappa o lambda). La banda

monoclonale evidenziata, solitamente ben delimitata e netta, deve essere localizzata

alla stessa altezza di migrazione della presunta banda monoclonale vista nel profilo

proteico (ELP). L’assenza di reazione con gli antisieri anti-catena pesante applicati e la

reazione con uno degli antisieri anti-catena leggera può indicare: (a)* gammapatia IgD

o IgE (molto rara) da confermare con l'uso di antisiero anti-catena pesante delta e

epsilon. (b)* presenza di una catena leggera libera da confermare con antisieri

anti-catena leggera libera kappa e lambda.

Ricerca e tipizzazione della proteina di Bence Jones La componente sierica è

costituita da sole catene leggere in forma di monomeri, dimeri o trimeri. E’ dovuta ad

una eccessiva produzione di catene leggere omogenee (kappa o lambda)

parallelamente ad una mancata sintesi di catene pesanti. Per la ricerca e la

determinazione qualitativa della PBJ si usa la tipizzazione immunologica

(Immunofissazione) in elettroforesi, che permettere la verifica delle due caratteristiche

essenziali (Libere-Monoclonali). La proliferazione di un clone linfocitario B (cellule

linfonodali) o di una plasmacellula (midollo osseo), dà luogo alla formazione di

componenti monoclonali intere (CM) e di proteine di Bence-Jones (PBJ). La proteina di BJ

è il nome che viene dato alle catene leggere libere monoclonali (CLLM), rilevabili nelle

urine. In un individuo normale, vengono prodotte 500 mg/l/die di CLLM. (CM e PBJ nelle

urine sono sempre di origine sierica)( La proteina di BJ compare quando la loro

sovrapproduzione aumenta al punto da saturare la capacità di riassorbimento e

metabolizzazione del tubulo)( La componente monoclonale intera appare quando il

glomerulo è danneggiato al punto tale da lasciare passare proteine di grossa taglia

(proteinuria glomerulare)).

Produzione ed escrezione della PBJ nelle urine: Le plasmacellule normali

producono un leggero eccesso di catene leggere. Questo squilibrio è enfatizzato nei

neoplasmi delle cellule B (mieloma multiplo e micromolecolare). Grazie alle loro

dimensioni ridotte, le CLLM sono capaci di passare attraverso il glomerulo. Quando il

meccanismo di riassorbimento tubulare viene saturato, le PBJ sono escrete nelle urine.

La massa molecolare della PBJ è piuttosto variabile: - PBJ monomerica: 22 kDa; -

dimero: 44 kDa; - gradi di polimerizzazione più elevati; - frammenti di 5-18 kDa. La

presenza di PBJ è associata a: • Mieloma Multiplo (indicatore prognostico negativo) •

Gammopatie monoclonali a significato incerto (MGUS) • Amiloidosi • Macroglobulinemia

di Waldenström. È importante diagnosticare la presenza di PBJ perché è un indicatore

prognostico negativo della progressione del mieloma. La PBJ è spesso di per sé

nefrotossica.

Determinazione quantitativa delle CLLM seriche ed urinarie. Metodica

nefelometrica: buona specificità e sensibilità analitica determinata dall’uso di anticorpi

diretti contro epitopi “nascosti” che si legano solo alle CLLM e non alle catene leggere

legate. Vantaggi: • si esegue su siero facilmente reperibile • permette uno screening

nei pazienti asintomatici • fornisce risultati numerici necessari per monitorare la

malattia • marcatore più accurato di remissione completa di malattia • ha una emivita

più breve per una rapida valutazione della risposta al trattamento Sono utili

nell’identificazione di pazienti affetti da Mieloma non secernente e MGUS, patologie con

danno renale, malattie reumatologiche ed Amiloidosi AL negativi con i tests

convenzionali.

INSUFFICIENZA RENALE ACUTA( IRA) è una sindrome in cui si ha una rapida

compromissione della funzionalità renale. I.R. è la patologia più diffusa nel