Diagnosi Virologica

Diagnosi virologica

Diretta: ricerca del virus e dei suoi componenti

L'esame colturale è un metodo diretto per la ricerca dei virus. Essendo i virus parassiti obbligati, il loro isolamento, la loro crescita e il loro studio richiedono la disponibilità di cellule viventi.

Uova embrionate

È possibile inoculare nella cavità amniotica e/o allantoidea di uova embrionate di pollo. Si procede con l'incubazione a 33­-34°C per 2­-3 giorni. La presenza del virus viene dimostrata poiché esso produce emoagglutinazione delle cellule del liquido amniotico e vengono visualizzate come inclusioni citoplasmatiche o nucleari. Queste possono essere rilevate come lesioni macroscopiche, osservabili anche al microscopio, dopo colorazione.

È essenziale avere a disposizione virus vivo per la preparazione del vaccino, dopo purificazione e depurificazione (ad esempio per il virus influenzale); potrebbe creare allergia se il paziente è allergico alle proteine dell’uovo.

Ricerca di virus infettante

Il tradizionale isolamento del virus in coltura avviene in monostrato su linee cellulari continue, come:

• MDCK (cellule di rene di cane)
• Vero (cellule di rene di scimmia)

Si utilizzano anche cellule MRC-5 (fibroblasti embrionali umani) in sospensione, tenute in sospensione attraverso un magnete oppure inibendo l'adesione. Altre cellule includono:

• Fibroblasti embrionali umani (HEL, PEU, MRC5, WI38)
• Cellule epiteliali di scimmia (BSC1, VERO, LLC-MK2)
• Cellule epiteliali umane (Hep 2, Chang liver, Intestine 407)

Incubazione avviene a 34°C per 48­-72 ore fino a 10­-14 giorni. La presenza del virus viene dimostrata osservando l’effetto citopatico. In assenza di quest’ultimo, è necessario dimostrare le proprietà emoagglutinanti del virus.

Principali effetti citopatici

• Arrotondamento delle cellule, conseguente alla rottura del citoscheletro cellulare (CMV)
• Formazione di sincizi, con cellule giganti contenenti diversi nuclei (es: morbillo, virus respiratorio sinciziale, parotite, HIV)
• Arrotondamento e aggregazione di cellule in grappoli (es: adenovirus)
• Formazione di inclusioni, acidofile o basofile, apprezzabili dopo colorazione

Materiali per la raccolta dei campioni

I materiali raccolti includono: liquor, lavaggio bronco-alveolare (BAL), liquido amniotico, umor acqueo/umor vitreo, sciacqui faringei, saliva, urina, feci, tamponi vaginali ed uretrali, tamponi cervicali, tamponi balano-prepuziali, tamponi congiuntivali, tamponi faringei, tamponi cutanei vescicolari, aspirato nasofaringeo e biopsie. Raccogliere il campione in un contenitore sterile, in un terreno adatto ai virus.

Il trasporto può avvenire a temperatura ambiente se di breve durata (15 minuti), altrimenti a 4­-8°C. Il terreno di trasporto (HBSS - Hanks’ Balanced Salt Solutions) contiene gelatina o albumina bovina (0,5%), fungizone (5g/ml), penicillina (200 g/ml), vancomicina (200 g/ml) e sali inorganici (CaCl₂, KCl, KHPO₄, MgCl₂, MgSO₄, NaCl, NaHCO₃, Na₂HPO₄, Glucosio, Rosso Fenolo).

I campioni devono essere conservati a 4­-8°C fino all’esecuzione delle analisi.

In laboratorio

Per i tamponi:

• Agitare sul vortex per 1 minuto
• Spremere il campione sulla parete della provetta
• Centrifugare a 3000 rpm per 15 minuti a 4­-8°C

Saliva, BAL, Sciacquo faringeo:

• Se arrivano già in terreno di trasporto, centrifugare a 3000 rpm per 15 minuti a 4­-8°C e inoculare 250 µl di sovranatante
• Se non arrivano in terreno di trasporto, vortexare per 1 minuto e diluire nel rapporto 1:2 con il terreno di mantenimento per ricerche virali (TMRV), centrifugare a 3000 rpm per 15 minuti a 4­-8°C e inoculare 250 µl di sovranatante