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Diagnosi virologica

Diretta_ricerca del virus e dei suoi componenti

Ricerca

Indiretta_ricerca sierologica degli anticorpi

Esame colturale (ricerca diretta)

Essendo i virus parassiti obbligati, il loro isolamento, la loro crescita ed il loro studio richiedono la disponibilità

dei cellule viventi

Uova

Inoculo nella cavità amniotica e/o allantoidea di uova embrionate di pollo

Incubazione a 33­34°C per 2­3 giorni

La presenza del virus viene dimostrata in quanto esso produce emoagglutinazione delle cellule del liquido amniotico e vengono visualizzati

come inclusioni citoplasmatiche o nucleari. (Possibile visualizzare lesioni di membrana dopo 1 sett, ma agglu più veloce). Sono lesioni

macroscopiche, osservabili anche al microscopio. Le inclusioni sono dovuto alla precipitazione di sostanze cellulari e visibili solo dopo

colorazione.

Essenziale per avere a disposizione virus vivo per la preparazione del vaccino, dopo purificazione e depurificazione (virus influenzale);

potrebbe creare allergia se il paziente è allergico alle proteine dell’uovo.

Ricerca di virus infettante (porta a morte cell che infetta):

­tradizionale isolamento del virus in coltura

in monostrato, di linee cellulari continue: MDCK (cellule di rene di cane)

Vero (cellule di rene di scimmia)

Si utilizzano cellule MRC­5 (fibroblasti embrionali umani)

in sospensione_tenute in sospensione attraverso un magnete oppure inibendo adesione

Altre cellule: fibroblasti embrionali umani (HEL (carcinoma cervice uterina), PEU, MRC5, WI38 etc)

cellule epiteliali di scimmia (BSC1, VERO, LLC­MK2, etc)

cellule epiteliali umane (Hep 2, Chang liver, Intestine 407)

Incubazione a 34°C per 48­72ore fino a 10­14 giorni

La presenza del virus viene dimostrata osservando l’effetto citopatico. In assenza di quest’ultimo, è necessario dimostrare le proprietà

emoagglutinanti del virus.

Principali effetti citopatici:

­Arrotondamento delle cellule, conseguente alla rottura del citoscheletro cellulare (CMV)

­Formazione di sincizi, con formazione di cellule giganti contenenti diversi nuclei (es: morbillo, virus respiratorio sinciziale, parotite, HIV)

­Arrotondamento e aggregazione di cellule in grappoli (es: adenovirus)

­Formazione di inclusioni, acidofile o basofile, apprezzabili dopo colorazione

Materiali: Liquor, Lavaggio bronco­alveolare (BAL), Liquido amniotico, Umor acqueo/umor vitreo, Sciacqui faringei, Saliva, Urina, Feci, Tamponi

vaginali ed uretrali, Tamponi cervicali, Tamponi balano­prepuziali, Tamponi congiuntivali, Tamponi faringei, Tamponi cutanei vescicolari, Aspirato

nasofaringeo, Biopsie.

Raccogliere il campione in un contenitore sterile, in un terreno adatto ai virus.

Il trasporto può avvenire a temperatura ambiente se di breve durata (15 minuti) altrimenti a 4­8°C.

Terreno di trasporto: (HBSS) Hanks’ Balanced Salt Solutions

2

(composizione: gelatina o albumina bovina (0,5%), fungizone (5g/ml), penicillina (200 g/ml), vancomicina (200 g/ml), sali inorganici (CaCl , KCl,

2

KHPO , MgCl , MgSO , NaCl, NaHCO , Na HPO , Glucosio, Rosso Fenolo).

4 2 2 3 2 4)

I campioni devono essere conservati a 4­8°C fino all’esecuzione delle analisi

In laboratorio

Tamponi

­agitazione sul vortex per 1 minuto

­campione spremuto sulla parete della provetta

­Centrifugare a 3000 rpm per 15 minuti a 4°­8°Craccolgo surnatante (virus è molto leggero).

Saliva ­ BAL ­ Sciacquo faringeo

Se arrivano già in terreno di trasporto:­centrifugare a 3000 rpm per 15 minuti a 4­8°C

­inoculare 250 l di sovranatante

Se non arrivano in terreno di trasporto: ­vortexare per 1 min e diluire nel rapporto 1:2 con il terreno di

mantenimento per ricerche virali (TMRV)

­centrifugare a 3000 rpm per 15 minuti a 4­8°C

­inoculare 250 l di sovranatante

Urina

­miscelare il campione con TMRV nel rapporto 1:2

­controllare il pH con le cartine tornasole e portare il pH a 7­7.5 con Tris­HCl 1M pH7.5 o pH8

­centrifugare a 3000 rpm per 15 minuti a 4­8°C

­inoculare 250 l di sovranatante

Slide32

La maggior parte dei virus presenta una marcata specie­specificità: tende a crescere più facilmente in cellule derivate dal loro ospite naturale o

specie strettamente correlatele cellule usate per lo studio degli agenti virali umani sono generalmente di origine umana o derivano da altri primati.

Esistono poi cellule “universali”, sulle quali può crescere qualsiasi virus.

Da tali colture di tessuto primario, è necessario allestire subcolture (colture secondarie)

Le colture primarie che sono costituite prevalentemente da cellule fibroblastiche possono essere subcoltivate un numero maggiore di volte

(muoiono dopo circa 50 generazioni); Tali cellule conservano il normale cariotipo diploide. In diversi casi e per ragioni sconosciute, le cellule in

coltura possono andare incontro a trasformazione morfologica spontanea ed acquistare un potenziale di crescita illimitato. Quando si verifica la

trasformazione, le cellule divengono generalmente d’aspetto epiteliale e la crescita assume un aspetto casuale, appaiono cromosomicamente

anormali (eteroploidi) e sono anche frequentemente maligne per la specie dalla quale esse provengono. Per la loro capacità di crescere

indefinitamente in vitro, questi sistemi di coltura vengono descritti come linee cellulari continue. Le colture primarie di tessuto preparate

direttamente dai tessuti neoplastici formano facilmente linee cellulari continue.

Dispersione delle cellule (metodo svolto per usare le cellule per fare altre colture)

­Digestione enzimatica con tripsina

La tripsina digerisce il materiale inter­cellulare di natura proteica, facendo sì che le cellule adiacenti si

stacchino una dall’altra pur mantenendo la loro integrità strutturale individuale.

La tripsina viene impiegata a concentrazione di 0,25%, in soluzione salina bilanciata a pH 7.2 ­ 7.4, ad una

temperatura compresa tra 4­37°C.

­Chelazione con versene (EDTA)

Agente chelante cationi bivalenti, tra cui il calcio, importante fattore di alcuni legami intracellulari.

Il versene viene usato ad una concentrazione di 0.02%, in soluzione salina tamponata, priva di sali di calcio e magnesio, ad un pH compreso tra

7,2­7,4, ad una temperatura di 37°C. Stacca cell dello strato superficiale.

­Separazione meccanica

Organi come la milza di adulto e testicolo sono particolarmente adatti per questo metodo di dispersione cellulare. La tecnica non è applicabile a

cellule cresciute in vitro.


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in tecniche di laboratorio biomedico
SSD:
Università: Milano - Unimi
A.A.: 2016-2017

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Andrea P. di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Tecniche diagnostiche in Virologia, Micologia e Microbiologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano - Unimi o del prof Clerici Pierangelo.

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