Diagnosi Virologica

KHPO , MgCl , MgSO , NaCl, NaHCO , Na HPO , Glucosio, Rosso Fenolo).

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I campioni devono essere conservati a 4­8°C fino all’esecuzione delle analisi

In laboratorio

Tamponi

­agitazione sul vortex per 1 minuto

­campione spremuto sulla parete della provetta

­Centrifugare a 3000 rpm per 15 minuti a 4°­8°Craccolgo surnatante (virus è molto leggero).

Saliva ­ BAL ­ Sciacquo faringeo

Se arrivano già in terreno di trasporto:­centrifugare a 3000 rpm per 15 minuti a 4­8°C

­inoculare 250 l di sovranatante

Se non arrivano in terreno di trasporto: ­vortexare per 1 min e diluire nel rapporto 1:2 con il terreno di

mantenimento per ricerche virali (TMRV)

­centrifugare a 3000 rpm per 15 minuti a 4­8°C

­inoculare 250 l di sovranatante

Urina

­miscelare il campione con TMRV nel rapporto 1:2

­controllare il pH con le cartine tornasole e portare il pH a 7­7.5 con Tris­HCl 1M pH7.5 o pH8

­centrifugare a 3000 rpm per 15 minuti a 4­8°C

­inoculare 250 l di sovranatante

Slide32

La maggior parte dei virus presenta una marcata specie­specificità: tende a crescere più facilmente in cellule derivate dal loro ospite naturale o

specie strettamente correlatele cellule usate per lo studio degli agenti virali umani sono generalmente di origine umana o derivano da altri primati.

Esistono poi cellule “universali”, sulle quali può crescere qualsiasi virus.

Da tali colture di tessuto primario, è necessario allestire subcolture (colture secondarie)

Le colture primarie che sono costituite prevalentemente da cellule fibroblastiche possono essere subcoltivate un numero maggiore di volte

(muoiono dopo circa 50 generazioni); Tali cellule conservano il normale cariotipo diploide. In diversi casi e per ragioni sconosciute, le cellule in

coltura possono andare incontro a trasformazione morfologica spontanea ed acquistare un potenziale di crescita illimitato. Quando si verifica la

trasformazione, le cellule divengono generalmente d’aspetto epiteliale e la crescita assume un aspetto casuale, appaiono cromosomicamente

anormali (eteroploidi) e sono anche frequentemente maligne per la specie dalla quale esse provengono. Per la loro capacità di crescere

indefinitamente in vitro, questi sistemi di coltura vengono descritti come linee cellulari continue. Le colture primarie di tessuto preparate

direttamente dai tessuti neoplastici formano facilmente linee cellulari continue.

Dispersione delle cellule (metodo svolto per usare le cellule per fare altre colture)

­Digestione enzimatica con tripsina

La tripsina digerisce il materiale inter­cellulare di natura proteica, facendo sì che le cellule adiacenti si

stacchino una dall’altra pur mantenendo la loro integrità strutturale individuale.

La tripsina viene impiegata a concentrazione di 0,25%, in soluzione salina bilanciata a pH 7.2 ­ 7.4, ad una

temperatura compresa tra 4­37°C.

­Chelazione con versene (EDTA)

Agente chelante cationi bivalenti, tra cui il calcio, importante fattore di alcuni legami intracellulari.

Il versene viene usato ad una concentrazione di 0.02%, in soluzione salina tamponata, priva di sali di calcio e magnesio, ad un pH compreso tra

7,2­7,4, ad una temperatura di 37°C. Stacca cell dello strato superficiale.

­Separazione meccanica

Organi come la milza di adulto e testicolo sono particolarmente adatti per questo metodo di dispersione cellulare. La tecnica non è applicabile a

cellule cresciute in vitro.

Il virus deve essere sempre <1000, perché se no ucciderebbe tutte le cellule e non potrebbe più replicarsi

Valutazione delle cellule vitali

E’ generalmente necessario conoscere il numero di cellule ottenute. Inoltre, è spesso necessario conoscere la proporzione di cellule vitali nella

sospensione. Ciò è essenziale per la preparazione quantitativa di nuove colture di tessuto. Le cellule possono essere contate in una camera di

Bürker. La vitalità si determina aggiungendo alla sospensione iniziale una soluzione di trypan blu allo 0,5%: il colorante viene selettivamente

adsorbito dalle cellule non vitali, che si colorano in blu intenso, mentre le cellule vitali non si colorano. Macroscopicamente le cell morte non

formano più uno strato uniforme nella flask.

Numero di cell morte x fattore di diluizione x 10.000numero di cell per mL

(ad es: 40x20x10.000 = 8.000.000/mL o 8x10 /mL)

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Cellule in coltura

Le cellule misurate vengono sospese ad una adatta concentrazione in terreno nutritivo tamponato, distribuite in recipienti di coltura in proporzioni

standard ed incubate a 37°C perché abbia la crescita.

terreno di crescita

Il fornisce alle cellule il completo fabbisogno metabolico per la loro moltiplicazione: sali fisiologici inorganici, generalmente

tamponata con fosfati e bicarbonato; aminoacidi; siero; vitamine essenziali e capacità tamponante. L’ssigeno richiesto è fornito dallo strato di aria

che ricopre la fase liquida del terreno nel recipiente di coltura. Nei recipienti “aperti”, come le capsule Petri, viene impiegata una fase gassosa

controllata costituita da circa 5% di anidride carbonica in aria, per prevenire la produzione di una eccessiva alcalinità nel terreno di coltura.

rosso fenolo

Il viene incorporato nella maggior parte dei terreni standard come indicatore biologicamente inerte del pH. Le cellule viventi in vitro

non tollerano valori estremi di pH, particolarmente durante le prime fasi, ed esse stesse producono una quantità variabile di acido carbonico e

tamponi fisiologici

lattico durante il metabolismo normale. Si incorpora perciò nel terreno dei (fosfati acido ed alcalino di potassio e sodio e

bicarbonato di sodio). Le cellule cominciano a sedimentare appena sospese nel terreno di coltura e l’adesione “irreversibile” alla parte del

recipiente si ottiene, in numero significativo, entro la prima ora. L’adesione si completa a temperatura più alta rispetto a quella ambientale

pertanto, le colture cellulari devono essere trasferite nel termostato più rapidamente possibile dopo l’allestimento. La progressione della coltura di

tessuto viene seguita mediante un regolare esame microscopico. Un più rapido controllo si può realizzare osservando il pH del liquido colturale

utilizzando il rosso fenolo come indicatore: al pH iniziale di circa 7.2 il terreno è color arancio, ma cambia durante le prime ore fino ad un colore

roseo man mano che il pH sale. Da allora in poi il pH comincia ad abbassarsi e continua con una velocità variabile a seconda del tipo di cellula e

per altri fattori. Il colore del terreno di coltura cambia parallelamente, passando attraverso l’iniziale stadio color arancio e diventando meno arancio

e più giallo man mano che il tempo passa. asettico.

Tutto il procedimento va eseguito sotto cappa in modo completamente

Le cell vengono mantenute in coltura, anche quando non c’è un virus da studiare, così da averle già pronte nel momento del bisogno.

Cellule adese (cellule BSC1 (African Green Monkey kidney); cellule PEU (Embryonic human lung)

­Incubare a 37°C le soluzioni che vengono utilizzate per la preparazione delle colture cellulari

­Eliminare dalla fiasca il terreno di crescita

­Lavare il substrato con soluzione salina tamponata o tripsina

­Eliminare la soluzione del lavaggio dopo pochi minuti

­aggiungere la tripsina (la quantità dipende dalle dimensioni della fiasca)

­Distaccare completamente il monostrato cellulare

­Diluire la sospensione cellulare ottenuta in appropriato terreno colturale secondo l’indice di replicazione (spipettare molto bene)

­Suddividere la sospensione cellulare nelle fiasche

­Aggiungere la quantità appropriata di terreno completo (terreno di crescita + siero bovino fetale + L­glutamina)

­Incubare a 37°C in atmosfera al 5% di CO sino al raggiungimento della confluenza e quindi ripetere l’operazione.

2

Cellule in sospensione (CEM­CM3 (Human acute lymphoblastic leukemia);RAJI (Burkitt lymphoma human)

­Contare le cellule

­Centrifugare la sospensione cellulare a 1000g per 10 min a TA o a 37°C

­Eliminare delicatamente il sovranatante e risospendere le cellule in appropriato terreno colturale secondo l’indice di replicazione

­Suddividere la sospensione cellulare nelle fiasche

­Aggiungere la quantità appropriata di terreno completo

­Incubare a 37°C in atmosfera al 5% di CO2 sino al raggiungimento della confluenza e quindi ripetere l’operazione

Svataggi coltura cellulare

­lunghi periodi per avere i risultati ( > 4 settimane)

­sensibilità bassa (conservazione campione)

­suscettibilità alle contaminazioni batteriche

­suscettibilità alle sostanze tossiche (es.antibiotico) che sono presenti nei campioni

­alcuni virus non crescono in coltura ad es. HBV, virus enterici, parvovirus, papillomavirus.

Ricerca di virus infettante:

­rapido ricerca di Ag precocissimi/precoci mediante immunofluorescenza o immunoperossidasi

Coltura

In vetrini per colture cellulari o in piastre o in singole provette di plastica

­l’inoculo dei materiali patologici nelle colture cellulari viene eseguito con una centrifugazione a bassa

velocità per un’ora a 30­37°C

­incubazione per 16 ­ 48 ore

Immunofluorescenza indiretta

­Fissazione e permeabilizzazione: aspirare il terreno, immergere i vetrini in:

­metanolo:acetone (3:1) ­ soluzione fredda ­ incubare 5’ a ­20°C o 20’ a 4°C

­metanolo ­ soluzione a temperatura ambiente ­ incubare 20’ TA

­acetone ­ soluzione fredda ­ incubare 10’ a ­20°C

­formaldeide ­ soluzione a temperatura ambiente ­ incubare 10’ a TA

­Aspirare la soluzione permeabilizzante/fissante

­lavare 2x con PBS a TA

­Ca­Mg

­incubare i citopreparati con l’anticorpo monoclonale (MAb) per 30’ a 37°C in atmosfera umida

­lavare 3x con PBS a TA ­ 2’ ciascuno

­Ca­Mg

­incubare i citopreparati con il coniugato fluorescinato anti IgG di topo per 30’ a 37°C in atmosfera umida

­lavare 3x con PBS a TA ­ 2’ ciascuno

­Ca­Mg

­colorare i citopreparati con Blu di Evans per 5’ circa

­lavare 1x con PBS a TA

­Ca­Mg

­prendere i vetrini dal fondo dei pozzetti con una pinza a punte sottili e porli rivolti con le cellule verso il basso su un vetrino portaoggetto su cui è

stata preventivamente posta una goccia di liquido montante (glicerolo 50% in PBS )

­Ca­Mg

È possibile svolgerla anche dopo citocentrifugazione, direttamente sul campione (no coltura)

Osservare a microscopio

Immunofluorescenza diretta

­lavare 2x con PBS a TA

­Ca­Mg<