Ciclo diagnostico e Campioni biologici

PRELIEVO EMATICO

Prima di effettuare il prelievo bisogna sempre disinfettare la cute. Si procede poi con l'introduzione dell'ago nella vena e drenaggio del sangue nella provetta sterile sottovuoto.

Le modalità di prelievo prevedono di:

• Effettuare il prelievo preferibilmente a digiuno;
• Individuare il sito di prelievo;
• Lavare accuratamente le mani e indossare i guanti;
• Disinfettare la cute lasciando, in sede di prelievo, un impacco antisettico per almeno un minuto;
• Introdurre l'ago in vena, senza toccare con le dita la cute disinfettata;
• Collegare al set di prelievo l'apposita provetta;
• Prelevare 5 ml di sangue;
• Estrarre l'ago dalla vena;
• Rimuovere i guanti e gettarli nel contenitore per rifiuti speciali.

Conservazione ed invio

Le provette devono essere consegnate tempestivamente. Ove ciò non fosse possibile si raccomanda di conservare le provette in posizione verticale, a temperatura ambiente e non oltre 3

Da oredall’esecuzione del prelievo. Campione biologico: SIERO

La provetta di sangue può essere poi centrifugata per cui viene separato il siero. Il siero, si separa dal sangue quando viene lasciato coagulare, per cui è privo dei fattori della coagulazione. Sul siero si possono eseguire test ai fini di indagini relative a:

• Ricerca sierologica
• Virus dell’HBV – DNA (quantitativo)
• Virus dell’HCV – RNA (qualitativo/quantitativo)
• Genotipizzazione di HCV

Campione biologico: PLASMA

Il plasma è composto da globuli rossi, globuli bianchi e piastrine. È formato soprattutto da acqua, proteine, glucosio, lipidi, ormoni e vitamine. La provetta in foto è quella utilizzata per la raccolta di sangue intero e contiene un anticoagulante. Sul plasma si possono eseguire esami microbiologici, come la ricerca diretta di:

• HIV – RNA (quantitativo)
• CMV – DNA (quantitativo)
• EBV – DNA (qualitativo)

EMOCOLTURA

Isolamento colturale di microrganismi nel sangue. Il prelievo deve essere effettuato:

• Prima di iniziare la terapia antibiotica;
• Prima della somministrazione dell'antibiotico;
• Prelievi in rapida successione, a distanza di 5-10 minuti.

Sono diverse le motivazioni che spingono a richiedere un emocoltura, tra cui nell'adulto il sospetto di endocardite acuta, per cui si effettuano 3 set di emocoltura a distanza di 30-60 minuti; quando vi è il sospetto di sepsi, per cui si effettuano 2-3 set di emocoltura anche a distanza di 5-15 minuti; si può anche sospettare una batteriemia primitiva, quindi si effettuano flaconi per aerobi sia da catetere venoso centrale, sia da vena periferica: in tutti i casi, i flaconi devono essere incubati per almeno 5 giorni, oppure 7 giorni se la metodica utilizzata è quella manuale, prima di dare un referto negativo.

Emocoltura da vena periferica per germi comuni

In figura si osservano i flaconi da emocoltura

precedentemente menzionati. Il sangue per emocoltura viene prelevato da una vena periferica e viene poi inserito all'interno di questi flaconi. Il set di emocoltura prevede quindi:

• Set emocoltura (aerobi e anaerobi);
• Set prelievo a circuito chiuso (vacutainer);
• Garza sterile;
• Antisettico (Clorexidina alcolica 0,5% o soluzione alcolica 70% o soluzione iodata);
• Guanti.

Il set di emocoltura prevede quindi:

• 1 flacone per aerobi
• 1 flacone per anaerobi
• 1 flacone per miceti

I flaconi con all'interno il sangue vengono poi incubati in uno strumento chiamato BACTEC. Questo segnalerà la positività dell'emocoltura, ma comunque i flaconi devono rimanere incubati per almeno 7 giorni prima di segnalarne la negatività. La quantità del campione per l'emocoltura deve essere sufficiente per poter effettuare una buona indagine diagnostica:

• Per i neonati deve essere 1-3 ml di sangue;
• Tra i 2-12 anni: 3-5 ml di sangue;

• Adolescenti e adulti: 8-10 ml.

Una volta effettuato il prelievo bisogna estrarre l'ago e gettarlo nel porta aghi ed agitare gentilmente per evitare la formazione di coaguli.

Rilievo della positività

I sistemi automatici provvedono alla lettura ogni 10-24', segnalando eventuali flaconi positivi. Non è necessario procedere a sottocolture cieche. Il microbiologo deve rilevare dallo strumento le positività in continuo nell'arco della giornata. Non è accettabile la rimozione a Batch di campioni positivi, ma al contrario i flaconi positivi devono essere prontamente rimossi all'atto della segnalazione strumentale. In caso di positività dell'emocoltura si procede, nel più breve tempo possibile, all'esecuzione della colorazione di Gram (in caso di negatività può essere utile la colorazione con arancio di acridina o un Gram usando come colorante di contrasto la carbofucsina) o più semplicemente con

blu di metilene per evidenziare i batteri che hanno eventualmente perso le affinità tintoriali. I risultati vengono trasmessi immediatamente al medico curante, per telefono e/o via fax e/o altra modalità rapida (telematica), segnalando al contempo data e ora di positività. Il referto riporta la positività dell'emocoltura e i caratteri morfologico-tintoriali dei microrganismi negativi, distinguendoli in: Stafilococchi e Streptococchi, Diplococchi Gram-positivi (enterococchi), Cocchi gram-negativi, bacilli Gram-negativi. È bene preferire alla definizione generica "difteroidi" quella più specifica di "bacilli Gram-positivi" o "bacilli Gram-positivi pleomorfi".

Sub-coltura delle emocolture positive

Tutte le emocolture positive devono essere sottoposte a sub-coltura su un set appropriato di terreni di coltura, ad esempio Trypticase Soy Agar + 5% sangue di montone o Agar cioccolato (terreni in grado di assicurare la

crescita di germi anche più esigenti) è anche molto diffuso nella pratica comune l'utilizzo di terreni cromogeni che possano fin da subito orientare nell'identificazione microbica. Le sub-colture dovrebbero essere incubate in aerobiosi ed anaerobiosi e agar cioccolato in CO2. Sta a ciascuna microbiologia decidere se seminare anche altri terreni per una più rapida identificazione dopo 24 ore di incubazione (es. Agar lattosato per Gram negativi o terreno selettivo differenziale per Stafilococchi o terreni cromogeni) o sulla base del risultato dell'esame microscopico.

Identificazione ed antibiogrammi definitivi

Sulle colonie isolate deve sempre essere effettuata l'identificazione a livello di specie e l'antibiogramma definitivo con misura della MIC (minima concentrazione inibente).

Campione biologico: URINE

- Lavare con cura le mani con acqua e sapone;

- Lavare con cura i genitali esterni con acqua e sapone (non con antibatterici);

- Aprire il

dovrà essere manutenuto a 4°C.

esistono diversi metodi di raccolta del campione:

• Mitto intermedio;
• Catetere a permanenza;
• Cateterismo estemporaneo;
• Urine da stomia;
• Urine da sacchetto;
• Urine gravidanza;
• Antigeni urinari;

Ovviamente, campioni diversi implicano protocolli diversi di indagine.

URINOCOLTURA è un esame colturale quantitativo, per cui si vanno a contare le unità formanti colonia. La conta dei batteri consiste nel determinare il numero dei batteri presenti per millilitro di urina per diluizioni seriali con fattore 10 del campione di urine (si possono anche impiegare anse calibrate). La conoscenza della quantità dell'inoculo seminato permetterà di risalire al numero di colonie sviluppatesi, cioè alla carica batterica presente nel campione di partenza. Il campione può essere seminato intero o diluito: l'incubazione deve avvenire per 24-48 ore a 37°C e devono essere necessariamente utilizzati

terreni universali, quali agar CLED o agar sangue (Gram) per poter effettuare la conta batterica e, quindi, le unità formanti colonia, e poi devono essere associati terreni di coltura selettivi, ad esempio il terreno MacConkey per i Gram e il terreno selettivo per i miceti come il Sabouraud. Interpretazione dell'urinocoltura L'urinocoltura deve essere poi interpretata secondo il criterio di Kass (Kess) e, quindi, si avrà refertazione di urine positive se la conta batterica è uguale o superiore a 100.000 CFU/ml (oppure espresso come urinocoltura positiva se è ≥ 10 CFU/ml). È comunque importante che la conta batterica sia rapportata all'anamnesi del paziente, perché in soggetti particolari devono essere segnalate anche 50.000 unità formanti colonie (CFU)/ml (Es. nefropatici o donne in gravidanza). ESAME DELLE FECI L'esame delle feci riveste un'importanza notevole in clinica. Ad esempio, se un paziente evacua feci rosse,può significare emissione di sangue misto al materiale fecale che nell'ipotesi più semplice significa una perdita di sangue con le emorroidi, specie se non vi è stato dolore; se il sangue rosso è commisto a feci diarroiche e si accompagna l'evacuazione a tenesmo, allora il medico pensa a colitie rettocoliti. In altri casi, le feci assumono un colore francamente scuro, o nero intenso, tanto che sembrano fatte di catrame e in questo caso si parla di "feci picee", per cui si pensa a sangue digerito. Le feci vengono raccolte in un contenitore apposito e, solo in alcuni casi, si può utilizzare un tampone che viene poi sigillato in un contenitore. L'esame delle feci può essere richiesto per 3 scopi: - Studio chimico delle feci; - Studio batteriologico (coprocoltura); - Studio parassitologico. Il contenitore in foto è quello utilizzato per la raccolta delle feci: al tappo è legata una