Chimica organica applicata alle biotecnologie

Chimica organica applicata alle biotecnologie

Le biotecnologie producono prodotti chimici, quindi la chimica è alla base. PET: polietilentereftalato. Danone, Nestlè ecc si sono unite con l’obiettivo di ottenere il PET ottenendo come fonte rinnovabile la canna da zucchero→natural bottle. Il PET è un polimero costituito da 2 monomeri, derivante dalla polimerizzazione di:

• Acido tereftalico deriva da petrolio
• Monoetilenglicole (MEG)

Se il MEG è prodotto da fonti rinnovabili, viene indicato come bioMEG. Questi 2 monomeri vengono legati tra di loro attraverso legami esterei, che derivano dalla condensazione dei gruppi ossidrili con quelli carbossilici. I poliesteri sono polimeri molto usati e spesso sono ottenuti anche con mezzi biocatalitici (“vede”) attraverso enzimi, quali biocatalizzatori. Il MEG deriva da etilene per via sintetica, che è una piccola molecola organica gassosa, a sua volta l’etilene può essere prodotto dall’etanolo. Da dove otteniamo l’etanolo? Per fermentazione o da fonti fossili.

Quindi MEG può provenire da: fonti rinnovabili, cellulosa o canna da zucchero.

[Affinché i prodotti della ricerca arrivino sul mercato, e con costi competitivi, ci vogliono anni di ricerca]

[Bio-based: prodotti provenienti da fonti rinnovabili]

La Bio-on produce bioplastiche, naturali e biodegradabili (→giochi dei bambini→lego). Anche la Novamont si occupa di produzione di polimeri, uno è quello biodegradabile per i sacchetti per l’umido. Nelle aziende biotech, il 25% dei lavoratori si dedica a R&D, anche se la media nazionale è nettamente più bassa→le aziende biotech investono molto nella R&D. La Lombardia è il territorio in cui si ha la massima concentrazione di aziende biotech in Italia→contributo del 32% sul totale del paese.

Applicazioni biotech

• Red: ambito sanitario (maggior parte)
• White: ambito industriale, più chimiche
• Green

Il settore industriale si è espanso del 4% degli ultimi 2 anni. In ambito biotech industriale il 38% di industrie esportano, rispetto al 28% dell’abito manifatturiero. Il fatturato delle biotech ha un peso di circa 8% sull’economia. Molti beni di consumo sono prodotti nell’industria chimica, e che poco tempo fa derivavano solo da petrolio. Sono molecole organiche ma tuttavia negli ultimi anni si cerca di ottenerli tramite biosistemi.

E consegue che è necessaria un’approfondita conoscenza chimica. Per via biotecnologica si ha produzione di:

• Piccole molecole
• Anticorpi
• Peptidi (usati come farmaci, integratori alimentari…)
• Proteine ricombinanti (importante per processi che utilizzano biocatalizzatori)
• Terapia cellulare
• Vaccini
• Terapia genica

Chimica organica e le biotrasformazioni

Le biotrasformazioni esistono da quando esiste l’uomo, ma con un grosso problema di comunicazione con la società. L’uomo ha iniziato a usare i sistemi biologici per ottenere prodotti nel 5000 A.C., l’uomo si è accorto che prodotti fermentati (es: birra, vino, aceto…) portava a bevande che erano più salutari e sicure dell’acqua che c’era all’epoca (non c’erano sistemi di potabilizzazione). Si hanno migliaia di anni di sperimentazione e affinamento delle tecniche arrivando ad avanzamenti nelle biotecnologie con basi scientifiche: si studiano sistemi biologici. Il primo processo industriale evoluto e studiato è quello di acido acetico derivante da etanolo.

Importante il traguardo del 1934 in cui si ottiene per la prima volta una ossidazione regio-selettiva di un derivato zuccherino (derivato del sorbitolo) a sorbosio per la sintesi chimica in laboratorio della vitamina C: importante cofattore nelle reazione di ossidoriduzione nell’uomo, una di queste è la ossidazione della prolina a idrossiprolina, fondamentale nella struttura primaria del collagene; carenze di vitamina C sono gravi perché non interviene nelle reazioni di ossidoriduzione, causando patologie tra cui lo scorbuto (se non si hanno nutrienti adeguati nel giro di 7/10 giorni si hanno problemi alle articolazioni e in massimo 15gg si arriva alla morte). La scoperta della struttura della vitamina C e la sua relazione allo scorbuto è stata scoperta nel sud Italia (presenza di limoni e arance, quindi agrumi) e si notò che lì i marinai non morivano di scorbuto→assunzione di vitamina C. dato che la vitamina C non può essere sintetizzata dall’uomo è importante ottenerla come integratore, la sua sintesi è stata possibile sono con l’utilizzo di un enzima isolato il quale ha permesso di realizzare un passaggio impossibile da ottenere chimicamente.

Nel 1950 si ha la bioconversione degli steroidi: lipidi con scheletro in comune, il principale è lo sterolo ma ci sono anche strutture steroidei che derivano dai vegetali (fitosteroli). Molto importante è anche il cortisone. Ci si accorse che estraendo fitosteroli da fonte vegetale (radice di una pianta) e usando biocatalizzatori si era in grado di sintetizzare degli analoghi steroidei degli ormoni sessuali femminili. Negli stessi anni c’erano medici che studiavano il ruolo biologico degli ormoni sessuali femminile nella cura dell’infertilità. Insieme a 2 femministe, decisero che questi studi dovessero portare alla creazione di contraccettivi orali (periodo del femminismo).

Negli anni '70 si riesce ad avere a disposizione il core della struttura degli antibiotici β-lattamici, questo ha fatto sì che le aziende farmaceutiche potessero produrre antibiotici semisintetici, con uno spettro d’azione più ampio della penicillina stessa→migliorato lo stato di salute. C’è però un fenomeno di resistenza agli antibiotici: ne è stato fatto un abuso e ha portato oggi ad avere resistenza, sono in studio ricerche di antibiotici che non portino a resistenza.

Nel 1985 si ha produzione di acrilamide (altamente tossica come monomero e deve essere maneggiato sotto cappa). Il polimero è relativamente inerte, non volatile, quindi perde parte della sua tossicità.

Del 1995 si ha un enorme sviluppo delle biotecnologie che continua tutt’oggi.

Biotrasformazioni

Parlando di biotrasformazioni ci si riferisce a:

• Trasformazioni con biocatalizzatori (con enzimi isolati)
• Trasformazioni con cellule intere

Consentono di ottenere trasformazioni altamente stereo-, chemo- e regio-selettive. Con le biotrasformazioni è possibile ridurre gli stati sintetici: i chimici per manipolare molecole e arrivare al prodotto finale devono fare degli stadi obbligati, con conseguenza di costi elevanti. Una delle principali applicazioni è di produzione di intermedi per l’industria farmaceutica.

Chemo-selezione

Fa riferimento alla selezione che si ha all’interno del nostro sistema tra i gruppi funzionali. Il nostro sistema presenta più gruppi funzionali, ma per arrivare al prodotto finale io ne voglio modificarne solo uno, peccato che alcuni non possono essere modificati selettivamente. Viceversa, gli enzimi sono perfettamente in grado di distinguere i gruppi funzionali e agire solo su uno di questi e non sugli altri.

La prima molecola è un lipide, esterificata e presenta un legame acetilico con un residuo zuccherino.

[un chetone reagisce con un alcol portando ad avere un emichetale. In condizioni catalitiche acide dall’emichetale si forma un chetale]

Se volessimo modificare la molecola lipidica rompendo i legami esterei, in condizioni acide, gli esteri si idrolizzano e si rompono i legami esterei ma anche il legame acetalico: chimicamente con un’idrolisi acida non è possibile discriminare le rotture dei legami→non ottengo il mio prodotto (→non ho chemo-selezione).

Se però uso degli enzimi, so che le lipasi idrolizzano molto bene i legami esterei, senza toccare minimante i legami acetalici: l’enzima è totalmente chemo-selettivo. Se volessi invece idrolizzare il legame acetalico e non l’estereo userò delle glicosidasi.

Altro esempio di chemio-selezione è a livello del ganglioside (importante nel SN), sono glicolipidi con una parte glucidica e una parte lipidica: è presente 1 legame ammidico e diversi legami acetalici.

Regio-selezione

Gli enzimi sono totalmente regio-selettivi. Nel ganglioside ci sono 4 legami acetalici, quindi nella stessa molecole ci sono tanti gruppi funzionali della stessa natura. Se non della stessa natura avrò difficoltà chimicamente a modificarne uno rispetto agli altri in quanto avranno tutti la stessa reattività. Usando un biocatalizzatore, o un sistema che lo contiene, riesco a rompere selettivamente un legame acetalico: sialidasi riesce a rompere un legame specifico, oppure per romperne un altro posso usare una galattosidasi.

Una reazione è regio-selettiva quando in presenza di più gruppi funzionali con la stessa reattività, posso intervenire in modo selettivo solo su uno di questi.

Stereo-selezione

Gli enzimi sono altamente stereo-selettivi: sono in grado di distinguere gli stereoisomeri (un chimico non riesce). Nel cellobiosio le molecole di glucosio sono legate tramite legame β, nel maltosio invece tramite legame α. E volessi distinguere i 2 legami α e β chimicamente non è possibile, viceversa con enzimi avrò degli enzimi specifici per lo stereocentro α o β.

Il nostro organismo possiede delle glucosidasi che sono specifiche per il legame α, possono quindi permettere di degradare l’amido (ruolo energetico), ma non ci sono invece specifiche per il legame β e quindi non possiamo degradare la cellulosa (ruolo strutturale).

Settori interessati dalle biotrasformazioni

• Farmaceutico
• Alimentare
• Agroalimentare
• Cosmetica
• Sintesi di polimeri

Molecole ottenute

• Derivati di carboidrati
• Peptidi e beta-lattami
• Amminoacidi
• Alcoli secondari (importanti come intermedi sintetici per l’industria farmaceutica)

Enzimi usati

• Idrolasi
• Ossidasi
• Reduttasi
• Isomerasi
• Transferasi
• Ossido-reduttasi

È importante sapere il meccanismo con cui l'enzima lavora in termini di stereoselezione. Devo conoscer quindi sia la stereochimica del prodotto di partenza che la stereoselettività dell’enzima. È importante anche quanto l’entità chirale è importante nella stereochimica.

Le biotrasformazioni vengono largamente utilizzate nei processi di risoluzione cinetica (il termine risoluzione fa riferimento alla separazione di 2 enantiomeri: racemo→miscela di enantiomeri equimolare. Il prodotto di interesse è 1 solo di 2 enantiomeri all’interno di un racemo, l’altro enantiomero può non avere alcun effetto ma può anche avere effetti collaterali). Si utilizza quindi un enzima in grado di effettuare la risoluzione.

Le biotrasformazioni vengono anche usate nella sintesi asimmetrica: parto da un substrato che non è chirale e voglio ottenere un prodotto chirale→introduco una importante modificazione. Un chimico ottiene un racemo, non uno stereoisomero tra quelli possibili, le biotrasformazioni con enzimi invece che portare al racemo portano ad un enantiomero invece che ad un racemo (→introduco l’asimmetria).

I prodotti enantiomericamente puri sono molto rilevanti:

• Enzimi e biocatalizzatori da cellule intere, data la loro chiralità intrinseca sono strumenti d’elezione per la produzione di stereoisomeri otticamente puri.
• La Food and Drug Administration (FDA – regola l’immissione sul mercato dei farmaci) richiede che lo stereoisomero inattivo sia caratterizzato e NON teratogeno.

Ciò significa che per mettere sul mercato un farmaco che è un possibile stereoisomero di quella struttura, deve essere puro o se messo come miscela, gli stereoisomeri non attivi non devono essere teratogeni.

• Si richiede che la purezza enantiomerica sia > 98%, quindi devo avere strumenti sia analitici che di purificazione adeguati per lavorare con gli stereoisomeri

Alla fine degli anni '80 nasce una normativa a causa di un farmaco che è stato prescritto a donne in gravidanza (Talidomide), presente in 2 forme:

Veniva prescritto alle donne per alleviare la nausea mattutina in gravidanza e veniva somministrato come racemo, però i figli nascevano con mutazioni o si aveva un aborto. Il problema deriva dal fatto che l’enantiomero attivo farmacologicamente è l’R, mentre l’S ha attività teratogena e mutagena. Si è cercato di separarli ma non si riesce, o meglio oggi è possibile separarli, ma a causa della struttura molecolare della molecola, se somministro solo R in vivo racemizza (perde l’integrità stereochimica: parto da R ed ottengo entrambi nello stomaco a causa della forte acidità del protone sullo stereocentro).

Perché questo protone è così acido? Se perdo il protone acido su quell’atomo di C avrò una carica negativa, questa carica può essere stabilizzata per risonanza sull’O carbonilico adiacente, facendo cambiare ibridazione al carbonio diventando da tetraedrico a planare, la struttura enolica che si forma non è stabile e in una reazione di equilibrio si inserisce di nuovo il protone, che sarà libero di attaccare da sopra o da sotto il piano (probabilità 50:50), se attacca sotto formo l’enantiomero R iniziale, se attacca da sopra ottengo invece S→dopo l’assunzione ho di nuovo il racemo.

Il talidomide quindi non viene più prescritto in donne in gravidanza, ma essendo teratogeno può essere usato per altri scopi (es: tumori). Dagli studi effettuati sul talidomide, si è deciso che se la molecola può esistere sotto diverse forme stereoisomeriche, tutte le forme devono essere caratterizzati ed eventualmente eliminare lo stereoisomero che dà effetti collaterali.

ES: efedrina esiste in 2 forme enantiomeriche, uno attivo e uno con attività inferiore ma è abbinata ad effetti cardiotossici, quindi l’effetto negativo è a carico solo di 1 dei 2 enantiomeri.

ES: le metanfetamine e anfetamine hanno uno stereocentro e quindi possono essere disponibili come miscela di enantiomeri, uno dei due ha effetto “ludico” e l’altro ha pesanti effetti sul sistema cardiovascolare che porta anche all’infarto (soprattutto se abbinate ad alcool e altro). Le metanfetamine sono in forma racemica.

Rilevanza dei prodotti enantiomericamente puri

NCE = New chemical entity. Negli ultimi anni sul mercato non vengono messe sostanze chirali ma racemi cercando di mettere sul mercato enantiomeri puri. La biocatalisi è favorita anche da fattori derivanti dal fatto che i biocatalizzatori, dal momento che sono catalizzatori in organismi viventi, hanno:

• Chemo- stereo- e regio- selettività
• PH vicino a quello fisiologico PH=7 (tranne alcuni che fanno parte degli organismi estremofili, che vivono a PH e T estremi). Quando lavoro in condizioni di sintesi chimica plastica le condizioni non sono di PH fisiologico. ES: sintesi di poliesteri.
• Temperatura: i biocatalizzatori lavorano in condizioni fisiologiche anche di T e di conseguenza mi consente di avere delle condizioni che costano poco alle aziende.

[Il legame estere si forma tramite l’esterificazione di Fisher]

L’esterificazione di Fisher avviene in PH acido e T>60°C. ES: sintesi di antibiotici, si degradano facilmente quindi le reazioni per manipolarli devono avvenire a bassa temperatura (→costo per l’azienda perché bisogna abbassare la T).

Chimica verde: molto spesso i processi sono più ecosostenibile perché non uso reagenti dannosi ma catalizzatori (i catalizzatori sono comunque biomassa che devo smaltire, quindi ho comunque dei costi ma più bassi e sono eco-compatibili). Questi fattori spingono verso la sostituzione della sintesi organica classica con sintesi usando biocatalizzatori.

Fattori che limitano la biocatalisi

• Disponibilità dell’enzima: ne serve una quantità minima rispetto al prodotto che voglio trasformare, deve però essere presente nelle quantità adeguate e deve essere in grado di catalizzare la reazione di interesse.
• Costo dell’enzima e di produzione complessiva: posso avere l’enzima ma se il processo costa troppo allora sul mercato non è competitivo.
• Specificità di substrato: i catalizzatori si sono evoluti per essere specifici su un certo substrato, in ambito industriale spesso uso catalizzatori in una reazione dove il substrato non è quello naturale dell’enzima, quindi devo essere sicuro che l’enzima abbia un’ampia specificità consentendomi di ottenere il prodotto e allo stesso tempo l’enzima deve mantenere le proprietà di catalizzatore (chemo- stereo- e regio- selettivo).
• Stabilità delle condizioni operative: l’enzima deve essere stabile nel sistema di reazione (solvente di reazione). La maggior parte dei prodotti di interesse industriale sono prodotti organici e quindi non solubili in acqua, che è il mezzo in cui lavorano i biocatalizzatori, quindi necessito di sistemi adeguati per portare in soluzione i substrati per poterli convertire e allo stesso tempo devo mantenere l’attività dell’enzima (alcuni enzimi in solvente organico perdono le loro capacità→perdono il loro folding a causa di interazioni diverse dell’enzima con il solvente quali legami idrogeno e dipolo).

Negli ultimi anni si stanno sviluppando dei solventi detti liquidi ionici in grado di portare in soluzione composti organici ma allo stesso tempo mantengono la...