Chimica organica applicata alle biotecnologie

NAD+

Il sistema è planare? SI
Il sistema è ciclico? SI
Tutti gli atomi sono ibridati sp2? SI
Gli elettroni π del sistema sono pari a 4n+2? SI
Si ha un fattore di stabilizzazione data dall'aromaticità del sistema.
Abbiamo però una carica positiva su N, questo compromette la stabilità del sistema.

NADH

- Stabilizzato dalla carica netta
- Destabilizzato dall'aromaticità

NAD+

- Destabilizzato dalla carica
- Stabilizzato dall'aromaticità

L'energia complessiva nelle due strutture è paragonabile quindi il sistema NADH/NAD+ può essere convertito facilmente nelle reazioni redox. → Nessuna delle due strutture è completamente stabile, entrambe hanno un fattore di destabilizzazione.

Tutto questo è possibile solo grazie alla presenza di un atomo di N: se in quella posizione non ci fosse N, il sistema non potrebbe funzionare.

Se ci fosse un atomo di O al posto di N: l'ossigeno ha 2 doppietti elettronici non

condivisi ma non è stabile se ci metto un terzo sostituente. Questa molecola rimarrebbe insolubile in acqua e non potremmo sostituire l'eteroatomo con una parte strutturale che renderebbe solubile la molecola. Soprattutto se sostituissimo con un legame, ammesso che la molecola potrebbe fare questa sostituzione mantenendo la solubilità avremmo un ossigeno con carica positiva: l'ossigeno ha già condiviso un doppietto e non ne condividerebbe un altro per rendere aromatico il sistema. Lo stesso il C: può portare il 4° legame, ma poi non ha doppietti non condivisi per far rilasciar dal sistema uno ione idruro. Quindi la scelta di N in quella parte della molecola è fondamentale e insostituibile. L'N ha la possibilità di formare 3 legami, garantendo: - 2 legami in un ciclo che diventa aromatico - Un terzo legame con una parte accessoria della molecola ma fondamentale per la solubilità - Mantiene il doppietto elettronico non condiviso

E che può essere ceduto nella struttura di risonanza affinché si possa rilasciare lo ione idruro-

L'azoto riesce a sopportare la carica positiva

Altro fattore ossido-riduttivo è il FAD/FADH , anche lui lavora sia in senso riduttivo che ossidoriduttivo. È un dinucleotide:

FAD = Flavin Adenin Dinucleotide (coenzima delle deidrogenasi) 89

Il primo nucleotide ha come nucleotide la flavina: possiede 3 cicli condensati (i responsabili della condensazione sono gli N).

Lo zucchero è il ribitolo (forma ridotta del ribosio).

Due gruppi fosfato permettono di fare il ponte.

È presente anche il ribosio in forma ciclina

Il secondo nucleotide è l'adenina.

→Flavina + ribitolo riboflavina (o vitamina B2)

Come si possono far lavorare le ossidoreduttasi in presenza del cofattore?

Il punto chiave è il cofattore: non è possibile usarlo in quantità stechiometriche perché non si può avere una quantità sufficiente

permette di rigenerare il cofattore NADH durante la reazione di riduzione del substrato di interesse. Il cofattore NADH viene convertito nella sua forma ossidata e successivamente rigenerato nella sua forma ridotta utilizzando un secondo substrato chiamato co-substrato. Il co-substrato agisce come donatore di ioni idruro per rigenerare il NADH. Questo sistema, chiamato sistema multisubstrato, utilizza un unico enzima per eseguire entrambe le trasformazioni.

rigenerazione del cofattore• Sistemi multienzimatici

Ho sempre la presenza di 2 substrati, ma questa volta invece di avere un solo enzima che opera su substrato e co-substrato, ho 2 enzimi differenti:

• Il primo enzima lavora sul substrato di mio interesse (ADH A)
• Il secondo enzima lavorerà sulla rigenerazione del cofattore operando sul co-substrato

Quindi:

• Sia nei sistemi multisubstrato e multienzimatici avrò 2 substrati (di interesse e co-substrato)
• Nei sistemi multisubstrato ho solo una ADH che lavora su entrambi i substrati
• Nei sistemi multienzimatici avrò invece 2 enzimi: uno che lavora sul substrato e uno che permette di rigenerare il cofattore

• Cellule intere

Ho tutto ciò che mi serve per rigenerare il cofattore: la cellula ha già tutto ciò che serve per rendere efficiente il sistema.

ES: lievito

Ciascuno di questi 3 approcci ha i suoi vantaggi e svantaggi: a seconda della trasformazione che devo effettuare devo considerare

Di enzima in quanto i due substrati possono essere molto diversi (→la specificità dell'enzima è una grande limitazione dei sistemi multisubstrato)- La forma ridotta del cofattore (NADH) è in genere meno stabile di quella ossidata (NAD+). Se devo effettuare su larga scala una reazione di riduzione, questa sarà più difficile rispetto all'ossidazione: la forma ridotta è meno stabile.- Si usano spesso 2-propanolo (detto anche isopropanolo) o etanolo come co-substrati- Alte concentrazioni di questi alcoli inattivano l'enzima 91- Horse liver ADH (HLADH) e Lactobacillus brevis ADH sono resistenti in queste condizioni (80% attività)- Turn over per il cofattore: 20 000- Sono state prodotte mediante tecniche di ingegneria genetica diverse ADH resistenti ad alte concentrazioni di i-PrOH Isopropanolo ed etanolo oltre che esser co-substrati possono essere utili per migliorare la solubilità in acqua dei prodotti di interesse.

sostituente c'è un gruppo ciclico di dimensioni moderate. avendo buona solubilità come solventi organici.

ADH usate nei sistemi multisubstrato:

Il fattore NADH/NAD+ può anche essere fosforilato→NADPH/NADP+. Ogni enzima ha specificità per la forma fosforilata o non fosforilata.

I sistemi multisubstrato, ma anche i multienzimatici, possono essere usati sia per reazioni diossidazione che riduzione. Se si effettuano reazioni di ossidazione queste possono essere efficaci per la risoluzione cinetica di racemi: uno dei due enantiomeri può essere ossidato e l’altro rimane invariato. È possibile effettuarlo solo se i sostituenti sullo stereocentro non sono di grandi dimensioni.

Generalmente accettano:

• Un sostituente piccolo con un metile o gruppo metilico
• Un sostituente leggermente più grande di tipo ciclico (sostituenti anti-aromatici)

ES: catena alifatica di lunghezza fino a 10C

Quindi le risoluzioni cinetiche sono efficaci se:

• C’è un gruppo molto piccolo sul primo sostituente
• Sul secondo sostituente c'è un gruppo ciclico di dimensioni moderate.

sostituente l'ingombro sterico può essere maggiore ma comunque limitato Quindi: • Si ottengono buone risoluzioni quando un sostituente è piccolo (Me, Et) e l'altro grande (sostituenti ciclici, aromatici, catene sature o insature fino a 10 C) • L'acetone viene usato come co-substrato per la rigenerazione del cofattore • L'acetone serve anche da co-solvente, migliorando la solubilità dei prodotti Questo sistema che prevede l'ossidazione del substrato in presenza di acetone come co-substrato è molto efficiente. L'acetone viene usato come co-solvente, che poi verrà ridotto al corrispondente alcol. 92 Applicazione: aroma di lampone Ha un gruppo carbonilico sulla catena laterale e tra i sostituenti ha un gruppo fenolico. Il precursore è il rododendrolo racemo: nella reazione di ossidazione si perde lo stereocentro, quindi l'enzima non viene usato per effettuare una reazione enantio-selettiva, maperché è necessario utilizzare due enzimi diversi. Tuttavia, l'utilizzo di sistemi multienzimatici permette di ottenere rese più elevate e una maggiore selettività nella sintesi del composto desiderato. Inoltre, l'utilizzo di un co-substrato per rigenerare il cofattore NAD+ è fondamentale per mantenere attiva l'enzima e permettere la sua continua azione catalitica. Nonostante l'aumento del costo complessivo del processo, l'utilizzo di sistemi multienzimatici offre numerosi vantaggi, come la possibilità di ottenere prodotti di alta qualità e la riduzione dell'impatto ambientale grazie all'utilizzo di reagenti più specifici e meno tossici. In conclusione, l'utilizzo di sistemi multienzimatici, come nel caso della sintesi dell'aroma di lampone con ADH, rappresenta una strategia efficace per ottenere composti desiderati in modo selettivo e sostenibile.Necessito di 2 biocatalizzatori diversi. Però aiuta a risolvere le problematiche derivanti dalle specificità di substrato: - Scelgo un enzima che lavora bene sul substrato di mio interesse, e quindi lo ottimizzo - Un'altra ADH rigenera in maniera irreversibile il cofattore Il sistema è più complesso ma sul substrato di interesse sarà più efficiente, rispetto al sistema multisubstrato. Gli enzimi che possono essere usati come accoppiati sono (entrambi accoppiabili sia a reazioni diossidazione che di riduzione): →1- Glutammato DH parte da acido glutammico e il cofattore in forma NAD+, porta all'acido α-chetoglutarico e rigenera NADH (o viceversa) →2- Glucosio DH parte da glucosio, ossidandolo, ad opera di NAD+, generando il gluconolattone e riportando NADH RIPASSO: formazione di immine Se si ha un gruppo car