Chimica organica applicata alle biotecnologie

PLC-

Il meccanismo catalitico non è ancora ben chiaro, si pensa che nella catalisi siano coinvolti ioni Zn (metallo idrolasi) e che la reazione prevede l'intervento di un residuo di aspartato che funge da base attivando l'acqua.

PLD-

Il sito catalitico presenta due sequenze His-Lys-Asp disposti in modo simmetrico, nel corso della reazione si forma un intermedio covalente His-P. Le due Lys servono per la coordinazione del substrato mentre Asp e His partecipano in modo attivo nella reazione. Da un lato è presente Asp in forma basica adiacente all'His in modo che la seconda espone l'N acido verso il substrato. Sull'altro lato la situazione è opposta, Asp è presente in forma acida e His espone al substrato N basico. Il carbossilato ha la funzione di attivare His in modo che l'N acido possa usare il suo doppietto elettronico libero per dare attacco a P, contestualmente si rompe il legame π fra P e O (O assume una carica negativa). Si forma

quindi un intermedio covalente in cui N dell'istidina è legato al gruppo fosfato. L'intermedio appena formato non è stabile e l'O cercherà di ripristinare il doppio legame con P, per farlo dovrà uscire il miglior gruppo uscente. L'alcolato è un pessimo gruppo uscente, grazie alla presenza della seconda His l'O viene protonato grazie a un trasferimento di elettroni e protoni tra His e Asp acido. A questo punto interviene l'acqua, che deve essere attivata in quanto pessimo nucleofilo (His le strappa un H e si rigenera Asp acido, come nelle lipasi). Lo ione idrossido a questo punto da attacco nucleofilo a P, si rompe il legame P=O e O assume una carica negativa. L'intermedio non è stabile e O ripristina il legame π, nel farlo si rompe il legame N-P. Se al posto di H O2 abbiamo un alcol R''-OH si ottiene una transfosfoesterificazione. Applicazioni industriali Produzione di lyso-lecitina con- PLA1 e

PLA2: le lyso-lecitine sono ottenute tramite idrolisi delle lecitine, presentano solo R1. Le lecitine, a causa della loro maggior idrofobicità, sono pessimi emulsionanti rispetto ai MAG, le lyso-lecitine sono nettamente migliori. Possono essere prodotte con PLA2 in un tampone Ca dalla lecitina di soia, il processo prevede l'idrolisi, la rimozione di H2O e dell'acido grasso liberato tramite estrazione in acetone. Mercato di 3.32 milioni di tonnellate/anno usate come emulsionanti. Sono stati messi a punto diversi metodi produttivi con diverse PLA, con quelle ottenute da maiale si ha l'80% di conversione in 1h. Se si usano PLA1 si sfrutta la successiva migrazione del gruppo acilico. Oltre alla produzione a partire dalle lecitine di soia è possibile migliorare le caratteristiche emulsionanti delle lecitine naturalmente presenti nel tuorlo d'uovo.

Degumming-: idrolizzare il fosfolipidi per eliminarli dagli oli vegetali in quanto non migliorano le caratteristiche, fino

A qualche anno fa veniva effettuata un'idrolisi per via chimica. Le fosfolipasi aumentano la resa, si lavora a temperature inferiori con un minor consumo di acqua. L'obbiettivo è di degradare completamente i fosfolipidi, possono essere quindi usate più lipasi che idrolizzano legami diversi in combinazione o in sequenza.

Transfosfoesterificazione con PLD-: come per la transesterificazione con lipasi, se al posto di H O come nucleofilo usiamo un alcol di interesse possiamo ottenere un fosfoestere con un R diverso da quello di partenza. Si può partire da fosfocolina, molto abbondante, e ottenere fosfolipidi di interesse farmacologico. In particolare questo processo viene sfruttato per la produzione di fosfatidilserina che inizialmente veniva ottenuta da cervello bovino venduta come integratore alimentare.

Esterasi (o carbossilesterasi): hanno una minor applicabilità industriali rispetto a lipasi e fosfolipasi, idrolizzano legami esterei di molecole più semplici.

con un'enorme specificità di substrato, a volte idrolizzano trigliceridi con R corte (4-6 atomi di C). Sono delle serin idrolasi, la triade catalitica estremamente conservata Ser-Asp-His ha lo stesso meccanismo catalitico delle lipasi. Le esterasi possono essere classificate in base all'allineamento di sequenza, dà informazioni relative alle relazioni evoluzionistiche fra le diverse esterasi ma non dà informazioni in merito alle proprietà dell'enzima (specificità di S, pH, T, stabilità nei mezzi di reazione). Una classificazione più utile è quella fatta in base alla specificità di substrato. Hanno una limitata disponibilità commerciale e possono essere usate per reazioni enantioselettive (solo raramente è elevata), chemoselettive e regioselettive. Applicazioni industriali: - Risoluzione cinetica del naprossene: in alcuni casi commercializzato come racemo, alcune aziende lo commercializzano in forma.produzione di coloranti), e molto altro ancora. La carbossilesterasi NP è un enzima che può essere utilizzato per la produzione di linalolo. Il linalolo è un composto aromatico che viene utilizzato come profumo e aroma alimentare. La produzione di linalolo avviene attraverso l'azione dell'enzima feruloil esterasi, che lavora su polisaccaridi esterificati con acido ferulico, componenti della parete cellulare vegetale. L'acido ferulico è una molecola che può essere utilizzata per la produzione di bioetanolo, antiossidanti modificati e aromi alimentari, come la vanillina. La produzione di vanillina da fonti naturali non è sufficiente per soddisfare la richiesta di mercato, quindi può essere prodotta per via chimica o tramite un processo chemoenzimatico. In generale, partendo dalla biomassa è possibile ottenere oligo- e monosaccaridi, acidi idrossicinnamici (come l'acido ferulico), transferuloilazione e facilitare l'accesso a ossidoreduttasi, utili per diverse industrie.

candeggioo dall'industria cartiera, in entrambi i casi per aumentare la purezza dellacellulosa). Stesso meccanismo di reazione della lipasi, triade catalitica Ser-His-Asp.-PLE (Pig Liver Esterase) : il sito catalitico dellaPLE è rappresentabile con 4 cavità (due polari dipiccole dimensioni e due apolari una grande euna piccola) in cui si accomodano i vari"domini" della molecola. La dimensione diqueste cavità si è evoluta in modo che ilsubstrato si dispone con un'orientazione benprecisa orientando il legame estereo daidrolizzare in prossimità della serina catalitica.Sono stati fatti diversi studi sulla forma delsito enzimatico utilizzando diversi substraticiclici a 4,5 e 6atomi dicarbonioche possiedono due legami esterei prostereogenici (idrolizzandone uno piuttostoche l'altro si origina uno stereoisomero. Si è visto che nel caso delle molecole conanello a 4 o 6 atomi si idrolizza uno specifico legame estereo

mentre nel caso dell'anello a 5 atomi di C si forma il racemo. Questo dipende dalla dimensione del ciclo, da come si dispone all'interno del sito attivo dell'enzima e quindi da quale legame viene esposto alla serina catalitica.

Carboidrati ed enzimi correlati

I carboidrati sono composti contenenti C, H e O (talvolta N e S) definiti come poliidrossialdeidi o poliidrossichetoni (possiedono un gruppo C=O e diversi O-H) che possiedono una reattività tipica di alcoli e composti carbonilici. Possono dare reazioni intramolecolari, la principale è la formazione di emiacetali ciclici e successiva condensazione intermolecolare degli emiacetali che porta all'acetale nella formazione di polimeri. Sono i composti più abbondanti sulla terra, principalmente sotto forma di cellulosa. Possono essere classificati in base al numero di unità (mono- di- oligo-polisaccaridi). I carboidrati complessi possono avere una funzione energetica (amido e glicogeno).

ostrutturale (cellulosa). Esistono anche glicoconiugati in cui la parte saccaridica è coniugata a un accettore:

Glicoproteine- : gli amminoacidi normalmente glicosidati sono serina, treonina e a volte asparagina. I primi due O-linked mentre nel caso dell'asparagina N-linked, molto difficile da ottenere per via chimica perché N è un pessimo nucleofilo (difficilmente da attacco nucleofilo al C emiacetalico).

Glicolipidi-I polimeri a base di carboidrati, grazie alle loro caratteristiche intrinseche, garantiscono un'enorme variabilità strutturale nettamente superiore rispetto a quella ottenibile con amminoacidi e nucleotidi. Di conseguenza la variabilità di informazione contenuta è molto elevata. Ad esempio, un trimero dello stesso monosaccaride può originare 120 strutture diverse (diversa posizione e stereochimica del carbonio anomerico), mentre con gli amminoacidi e i nucleotidi c'è solo una possibilità. Un trimero di tre

monomeri diversi, invece, porta a 6 possibili strutture per amminoacidi e nucleotidi mentre per i carboidrati si arriva fino a 720. I monosaccaridi possono essere classificati in base alla posizione del gruppo carbonilico, del numero di C (da 3 a 9, gliceraldeide e diidrossiacetone sono i più semplici; acido sialico è spesso presente in glicoconiugati; KDO ha 8C ed è un componente fondamentale della parete batterica) e della stereochimica (D e L). In generale, il descrittore D o L si riferisce alla configurazione del C stereogenico più lontano dal C carbonilico e definisce la resie sterica. La nomenclatura IUPAC diventa molto difficile con l'aumentare degli stereocentri (bisogna definire la stereochimica di tutti i C stereogenici), si usa quindi la nomenclatura di Fischer. I carboidrati in soluzione ciclizzano e possono formare anelli a 5 termini (furanosidi) o a 6 termini (piranosidi), il glucosio ad esempio ciclizza in 4 strutture diverse, la più stabile.

èquella con l’anello a 6 termini in cui tutti gli OH sono in posizione equatoriale.

Aldolasi catalizzano una reazione di condensazione aldolica in cui due aldeidi reagiscono per formare un dimero (sfruttando le caratteristiche acide del protone in alfa al carbonile da un lato e l’elettropovertà del C dall’altra). Questa reazione, ottenuta per via chimica, porta alla formazione di due nuovi stereocentri e quindi 4 molecole diverse. Le aldolasi non sono ancora molto utilizzate a livello industriale perché la reazione catalizzata è in equilibrio ed è difficile spostarlo verso la sintesi. Sono state identificate