Chimica organica applicata alle biotecnologie

Chimica organica applicata alle biotecnologie

Introduzione

È di fondamentale importanza per un biotecnologo industriale perché la maggior parte delle produzioni industriali coinvolgono processi biologici, in alcuni casi per ottenere reazioni altrimenti impossibili per via chimica, in altri per rendere l’intero processo più sostenibile a livello ambientale. Ad esempio, il PET (PoliEtileneTereftalato) è un polimero ottenuto dall’esterificazione dell’acido tereftalico e del MonoEtilenGlicole (MEG). In origine entrambi questi composti venivano ottenuti da risorse non rinnovabili, diverse aziende unite hanno sviluppato un processo attraverso il quale il MEG viene ottenuto da biomassa, partendo dall’etanolo.

Perché?

Innanzitutto per ridurre l’uso di risorse fossili, inoltre rispetto alla sintesi chimica, usando processi biologici, operiamo a T e P ambiente e di conseguenza anche il fabbisogno energetico è inferiore.

Bioeconomia

Rendere processi industriali più sostenibili per l’ambiente. Uno dei settori prioritari secondo l'UE, questo porterà in futuro a un notevole aumento di fatturato e posti di lavoro (si pensa che il mercato raggiungerà i 50 miliardi nel 2030, contro i 28 del 2013), coinvolgendo tutti i settori industriali. Le biotecnologie possono essere applicate trasversalmente in ogni settore, dalla produzione di beni di consumo (farmaci, molecole in generale, biocarburanti, polimeri) motivo per il quale se ne occupano molte industrie chimiche.

Novità

Carlsberg e Paboco hanno sviluppato una bottiglia a base di carta riciclata per la distribuzione di birra e bibite gassate in generale. Hanno sostituito il PET con il PEF, anziché di usare l’acido tereftalico si usa l’acido 2,5-furanodicarbossilico il quale ha anch’esso i due gruppi carbossilici da esterificare ma al posto dell’anello benzenico abbiamo un anello furanico. Già dal 2004 si è visto che può essere ottenuto per disidratazione e successiva ossidazione degli zuccheri, al momento però non esiste un processo biotecnologico per produrlo. Inoltre, il PEF sembra aver caratteristiche migliori del PET (ad esempio, minor permeabilità all’O₂). Queste bottiglie possono essere inoltre riciclate completamente in quanto il PEF può essere facilmente separato dalla parte cellulosica.

Chimica organica e biotrasformazioni

Nella tabella di destra abbiamo un’indicazione di quanto i processi biotecnologici siano usati da moltissimo tempo, partendo dalla produzione di vino, pane e formaggi (sebbene non si fosse a conoscenza dei processi di fermentazione coinvolti), fino ad arrivare ai giorni nostri con l’uso razionale di enzimi come catalizzatori di reazioni. Di seguito alcuni esempi rilevanti:

• Invertasi: idrolisi saccarosio a dare glucosio e fruttosio
• Bio-conversione di steroidi: importante per cortisone e suoi derivati, dagli anni 50 in poi grazie alla scoperta di enzimi in grado di convertire i fitosteroli a cortisone e derivati. Pillola anticoncezionale, scoperta per caso cercando di produrre cortisone.
• Idrolisi della penicillina: produzione di acido penicillanico, base per gli antibiotici derivati dalla penicillina
• Produzione di insulina umana: con l’uso di proteasi in grado di processare il precursore.

Le biotrasformazioni consentono di ottenere reazioni stereo, chemo e regio-selettive, a volte reazioni difficili (se non impossibili da ottenere usando la chimica classica. Molto utilizzate per la produzione di intermedi per l’industria farmaceutica (ma non solo), in un mercato in continua crescita.

Chimica verde: vantaggi e svantaggi

PH fisiologico (vantaggio in termini di smaltimento dei reflui. L’idrolisi di un’ammide richiede ambiente estremamente basico, trattamento pre-smaltimento) Costo dell’enzima e della sua produzione. Specificità di substrato (se l’enzima lavora sul suo substrato naturale, tramite ingegneria genetica lo possiamo modificare in modo che preferisca una molecola simile a quella per cui si è adattato) Stabilità delle condizioni operative (spesso in chimica organica si usano solventi, l’enzima potrebbe non funzionare).

Reazioni chemo-, regio- e stereoselettive: Chemoselettiva: nella molecola abbiamo gruppi funzionali diversi, una reazione chemoselettiva agisce solo su uno di questi. Esempio abbiamo in entrambi i casi legami acetalici, esterei e amminici. Voglio ottenere una saponificazione, usando un enzima posso idrolizzare selettivamente il legame estereo. Chimicamente non posso farlo perché in ambiente acido oltre al legame estereo ho l’idrolisi del legame acetalico. Analogamente le ammidasi idrolizzano selettivamente il legame ammidico e lasciano intatti gli altri.

Regioselettività: se in presenza di numerosi gruppi funzionali identici con identica reattività, riesco a modificarne solo uno in una posizione specifica della mia molecola. Sempre considerando i legami acetalici, in ambiente acido si idrolizzano tutti i legami di questo tipo, usando un enzima posso idrolizzarne uno specifico. Ad esempio, se uso una sialidasi taglia solo l’acido sialico dalla mia molecola. Analogamente una galattosidasi andrà a idrolizzare quello specifico legame che libera un galattosio.

Stereoselettività: una reazione è stereoselettiva se in presenza di più stereoisomeri la reazione avviene esclusivamente su uno di essi. Sono reazioni molto complesse da ottenere per via chimica. Ad esempio, cellobiosio e maltosio o in generale la digestione di amido e cellulosa. Nel settore tessile si possono usare enzimi per pulire il cotone da residui di amido lasciando la cellulosa intatta, oppure, per ottenere i jeans più morbidi posso usare delle cellulasi.

Uso trasversale delle biotrasformazioni

Come si può notare dai grafici le biotrasformazioni sono tutt’oggi utilizzate in modo trasversale in un’ampia gamma di settori industriali, principalmente quello farmaceutico proprio per le proprietà intrinseche degli enzimi, vedremo fra poco il caso dei derivati sintetici delle penicilline. Oltre a questo, gli enzimi, sono ampiamente impiegati nell’industria alimentare, vengono usate ad esempio amilasi, lipasi, proteasi e molte altre classi di enzimi. Le biotrasformazioni, proprio grazie alla versatilità delle reazioni catalizzate dagli enzimi vengono utilizzate per produrre numerose molecole e intermedi di reazione.

Nella maggioranza dei casi le applicazioni industriali sfruttano la selettività degli enzimi principalmente per:

• Risoluzione cinetica e dinamica: sfruttare la stereoselettività per separare due enantiomeri;
• Sintesi asimmetriche: ottenere uno specifico stereoisomero partendo da molecole non chirali;
• Produzione di enantiomeri puri da usare come precursori.

Tutto questo interesse è dovuto al fatto che la FDA richiede che, se un farmaco possiede stereoisomeri, il composto immesso sul mercato abbia una purezza enantiomerica superiore al 98%. Questo in seguito allo scandalo del Talidomide il quale fu inizialmente venduto in forma racemica, solo in seguito si è scoperto che la forma S della molecola ha effetti teratogeni. Si è quindi imposto lo studio dell’attività farmacologica degli stereoisomeri, si è scoperto che in condizioni fisiologiche la forma R del Talidomide racemizza a produrre la forma S della molecola:

• L’O carbonilico vicino all’azoto funge da base, protonandosi. La carica positiva richiama elettroni dal carbonio, si forma un carbocatione.
• Il carbonio adiacente per stabilizzare la molecola perde l’idrogeno e forma un doppio legame.
• L’OH, deprotonandosi, richiama elettroni rompendo il doppio legame appena formato.
• Il carbonio lega un H, questo può legarsi dal lato opposto rispetto all’origine dando origine alla forma S della molecola.

Punti chiave per lo sviluppo di un processo di biotrasformazione

• Produzione di antibiotici betalattamici: derivati della penicillina, impossibile da produrre senza biotrasformazioni. Si è scoperto che andando a cambiare la catena laterale della penicillina si cambia lo spettro d’azione della molecola. Il problema è che la penicillina è impossibile da sintetizzare per via chimica a causa della presenza di 3 stereocentri. Vogliamo togliere il gruppo fenilico dalla catena laterale, esso è legato tramite un legame ammidico. Il problema deriva dal fatto che anche nell’anello del core della molecola è presente un legame ammidico e non lo vogliamo rompere, questo è impossibile da fare. Oltre a non poter rompere selettivamente un legame ammidico piuttosto che un altro, il primo legame amminico che si rompe è quello del core a causa della geometria elettronica del carbonio (abbiamo un carbonio ibridato sp² in un ciclo in cui gli angoli sono di 90° anziché a 120°, si rompe per primo perché si va a risolvere la tensione angolare dei legami della molecola).
• Penicillina acilasi: idrolizza selettivamente il legame ammidico esociclico lasciando intatto quello endociclico, lavora a basse T e in presenza di acqua (il legame ammidico endociclico si idrolizza molto facilmente a T ambiente, motivo per cui gli antibiotici derivati della penicillina solitamente vengono venduti in polvere e vanno conservati in frigo una volta solubilizzati).
• Aspartame: nato per caso in un lab degli USA mentre si cercavano piccoli peptidi da usare come farmaci. Si tratta di una reazione di condensazione fra acido aspartico che porta un gruppo CarboBenZilossi (cbz) legato al gruppo NH₂ e una fenilalanina metilestere (metilata sul COOH). Se volessimo farlo per via chimica dovremmo bloccare la reattività del gruppo carbossilico della catena laterale dell’acido aspartico per farlo reagire sul COOH legato al C_α. Il cbz è un gruppo protettivo che blocca la reattività del gruppo amminico dell’acido aspartico.
• Termolisina: catalizza la condensazione tra le due molecole. Il problema è che servono amminoacidi L, altrimenti le altre combinazioni enantiomeriche non sarebbero dolci. È possibile produrre l’acido l-aspartico dall’acido fumarico per via biotecnologica. La fenilalanina non siamo ancora in grado di produrla, si produce quindi il racemo. La termolisina usa solo la versione L.

La tossicità deriva dal fatto che il gruppo COOH della fenilalanina deve essere esterificato con un gruppo metilico per mantenere la sua dolcezza. Nella digestione le esterasi liberano metanolo, convertito in acetaldeide dall’alcoldeidrogenasi e successivamente ad acido formico che non può più essere convertito e si accumula nel sangue abbassando il pH. La formaldeide reagisce con qualsiasi cosa nell’organismo fungendo da nucleofilo.

Isomeria e stereoisomeria

Pasteur fu il primo scienziato a effettuare con successo la prima risoluzione di enantiomeri (separazione di enantiomeri) dell’acido tartarico. Quest’ultimo, presente in 2 forme enantiomeriche, cristallizza in modi diversi dando origine a cristalli speculari. A fine 800 fu ipotizzata la struttura tetraedrica del carbonio tetravalente e a inizio 900 Fischer propose un metodo sistematico per la rappresentazione grafica dei centri stereogenici e i primi descrittori di configurazione (D/L). A metà 900 si ha la determinazione della struttura del sale doppio di sodio e rubidio dell’acido tartarico grazie alla dispersione anomala dei raggi x. Solo nel 2016 si è osservata la presenza di molecole chirali nello spazio.

I sistemi biologici sono altamente discriminanti nei confronti delle strutture con cui interagiscono, un esempio molto diffuso è quello del talidomide, ma ce ne sono altri (ibuprofene, attivo solo nella forma S; limonene presente nelle arance in forma R mentre nei limoni in forma S). Un esempio curioso è quello dell’R-carvone presente nella menta e l’S-carvone presente nel cumino, differiscono per la configurazione spaziale di un carbonio stereogenico ma percepiamo odori diversi.

La forma delle molecole dipende dalla loro composizione (atomi e legami che formano), conformazione (rotazione intorno a legami singoli) e configurazione di elementi stereogenici (R/S o E/Z ecc.). Per isomeri si intendono due molecole che presentano la stessa composizione (formula bruta) ma che assumono conformazioni diverse. Una semplice rappresentazione la abbiamo nell’immagine a destra, valida per gli enantiomeri. Per capire in quale relazione si trovano due molecole rispondiamo a una serie logica di domande:

• Isomeri costituzionali: hanno la stessa formula bruta ma diversa connettività, avranno di conseguenza diverse proprietà chimico-fisiche diverse;
• Isomeri conformazionali: stessa connettività, interconvertibili fra loro per rotazione intorno ai legami semplici, le diverse conformazioni avranno un contenuto energetico differente. Esiste, perciò, una barriera energetica di interconversione tra le due forme. Diversi fattori contribuiscono all’energia intrinseca della conformazione della molecola, tra questi troviamo interazioni di non legame, energia torsionale, distorsione angolo di legame dal loro valore ottimale (gruppi che interagiscono e causano una variazione dell’angolo di legame come nel caso dell’anello penicillanico in cui il carbonio ibridato sp³ forma un angolo di 90° anziché di 109°, conformazione a sedia o a barca del cicloesano) e della lunghezza di legame. Un metodo semplice per la rappresentazione di queste proprietà è attraverso le proiezioni di Newman dell’etano. Molecola molto semplice, ci dà un’idea delle varie conformazioni che può assumere e l’energia associata a ciascuna di esse. La conformazione più stabile è quella sfalsata perché è quella che minimizza le interazioni di non legame fra gli H.
• Isomeri configurazionali: hanno stessa connettività ma non sono interconvertibili fra loro per rotazione intorno ai legami semplici. Dati dalla disposizione spaziale dei sostituenti intorno ad un elemento stereogenico, per passare da una forma all’altra è necessario rompere e riformare uno o più legami. Se sono sovrapponibili si definiscono omomeri (si tratta della stessa molecola rappresentata oppure osservata in modi diversi) altrimenti sono stereoisomeri. Questi ultimi si dividono in enantiomeri se uno è immagine speculare dell’altro e diastereoisomeri se non sono immagini speculari.

Proprietà degli stereoisomeri

Chiralità: proprietà pervasiva dell’intera molecola (non del singolo atomo o gruppo). Il C non è chirale, al limite è l’origine della chiralità della molecola, si parla quindi di carbonio stereogenico (o centro di chiralità). Sono chirali tutte molecole non sovrapponibili alla propria immagine speculare, pertanto tutti gli enantiomeri sono chirali, al contrario i diastereoisomeri non sono necessariamente chirali. Sono chirali tutti gli oggetti che non hanno un piano di simmetria, se individuo nella molecola un piano di simmetria (dalle proiezioni di Fischer si capisce bene).

Proprietà chimico fisiche: i diastereoisomeri si comportano sempre in modo diverso, gli enantiomeri invece hanno proprietà chimiche e fisiche scalari identiche (cambia tuttavia il modo in cui interagiscono con altre molecole chirali). Quando abbiamo a che fare con enantiomeri, le trasformazioni catalizzate da enzimi risultano spesso l’approccio migliore perché nella maggior parte dei casi sono stereoselettivi. Un esempio è dato dal polimero di acido lattico, presenta proprietà diverse se si usa solo l’enantiomero L o D, o una miscela dei due in varie proporzioni.

Ogni molecola chirale è otticamente attiva, ovvero è in grado di ruotare il piano della luce polarizzata, verso dx (destrogira, +) o sx (levogira, -), due enantiomeri ruotano la luce polarizzata in direzioni opposte. La luce è una proprietà fisica vettoriale. Il potere ottico rotatorio di una molecola si misura con il polarimetro. Generalmente si usa una lampada al sodio, la luce passa attraverso un filtro polarizzatore che lascia passare la luce solo quando è parallela alle sue fessure, la luce piano-polarizzata (oscilla solo lungo un piano in modo sinusoidale) passa attraverso il campione il quale interagendo con essa, ruota il piano di un certo grado (α). La rotazione dipende dalla concentrazione del campione, si definisce quindi il potere rotatorio specifico. La luce piano polarizzata E può essere scomposta in E_s e E_r, ciò che vediamo è la somma dei due vettori. Queste due componenti interagiscono in modo differente con il mio campione, se E_r interagisce di più rispetto a E_s, il risultato è un cambio di velocità di E_r. La luce ruoterà quindi lungo un piano diverso da quello su cui ruotava in origine. Quando abbiamo una miscela racemica, entrambi gli enantiomeri interagiscono in modo uguale ma opposto, l’effetto ottico si annulla.

La condizione necessaria e sufficiente per determinare l’esistenza o meno di stereoisomeri è la presenza di un elemento stereogenico. Vale a dire una struttura elementare costituita da un atomo o un gruppo di atomi interconnessi, fornita di leganti direzionati nello spazio e tale che una permutazione di due leganti produce uno stereoisomero del modello originario (ad esempio il C tetralegante, l’elica).