Chimica farmaceutica - penicilline

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI “MAGNA GRÆCIA“ DI CATANZARO

FACOLTÀ DI FARMACIA

Scuola di Specializzazione in Farmacia Ospedaliera

TESINA DI CHIMICA FARMACEUTICA 1

Penicillin-Binding-Proteins

Miriam Ciriaco

Matr. 90589

ANNO ACCADEMICO 2005-2006

INDICE

CAPITOLO 1:

1.1. Introduzione pag. 3

1.2. Differenze nella parete batterica di Gram + e Gram - pag. 5

1.3. Sintesi di peptidoglicano pag. 6

CAPITOLO 2:

2.1. PBPs pag. 10

2.2. Alcuni studi pag. 11

CAPITOLO 3:

3.1. Penicilline pag. 14

3.2. Meccanismo d’azione pag. 15

3.3. Uno studio pag. 16

3.4. Spettro d’azione delle penicilline pag. 17

CAPITOLO 4:

4.1. Resistenza batterica pag. 19

4.2. Studi conformazionali pag. 20

4.3. Inibitori delle beta lattamasi pag. 22

CAPITOLO 5:

5.1. Infezioni nosocomiali per antibiotico resistenza pag. 25

CAPITOLO 6:

6.1. Conclusioni pag. 26

CAPITOLO 7:

Bibliografia e Webgrafia pag. 27 2

CAPITOLO 1

1.1. Introduzione

Un chemioterapico ideale è, riprendendo il concetto espresso da Paul Ehrlich padre della

moderna chemioterapia, una sorta di “magico proiettile”, capace di distruggere l’agente invasivo

senza ledere l’ospite. Questo concetto di tossicità selettiva si adatta bene agli antibiotici beta-

lattamici [1].

Gli agenti chemioterapici diretti contro qualsiasi stadio della sintesi, del trasporto,

dell’assemblaggio e della formazione dei ponti trasversali del peptidoglicano provocano

un’inibizione della crescita batterica e, nella maggior parte dei casi, la morte cellulare.

β

Gli antibiotici lattamici (penicilline, cefalosporine, carbapenemi e monobattami), caratterizzati

β

dalla presenza di un anello lattamico a quattro atomi, impediscono la formazione dei legami

crociati dello scheletro glicolipidico (transpeptidazione).

La transpeptidasi ed altri enzimi simili coinvolti in questa reazione vengono chiamati proteine

leganti la penicillina (penicillin-binding-proteins, PBP) poiché contengono siti attivi in grado di

legare gli antibiotici beta lattamici [2].

La parete protegge i batteri dalla rottura cellulare legata alla differenza di osmolarità tra l’interno

della cellula, fortemente iperosmolare (fino a 20 atm) e i tessuti dell’ospite, generalmente

isosmolari o iposmolari. La struttura che conferisce alla parete rigidità e resistenza alla lisi

osmotica è il peptidoglicano, che forma attorno al batterio un involucro contenente legami

covalenti.

Il peptidoglicano è composto da uno scheletro di due aminozuccheri che si alternano: N-

β1→

acetilglucosamina (NAG) e acido N-acetilmuramico (NAM) uniti, mediante legame

glucosidico, ad una catena di quattro aminoacidi, inoltre, un peptide a ponte collega le catene

peptidiche (Fig. 1). 3

Figura 1: Peptidoglicano

Le subunità che aggregate formano il peptidoglicano (uno zucchero legato a cinque aminoacidi)

vengono assemblate nel citoplasma e poi trasportate, attraverso la membrana citoplasmatica,

verso la superficie cellulare. Il successivo legame tra le subunità si realizza attraverso il clivaggio

dell’aminoacido terminale del ramo peptidico (Fig. 2).

Disaccaride+ peptide Ponti di pentaglicina

Figura 2: Legami tra le diverse catene 4

1.2. Differenze nella parete batterica

Tramite la colorazione di Gram è stato possibile distinguere le due tipologie batteriche in

funzione delle differenze di composizione proprio della membrana esterna: nei batteri Gram

positivi il peptidoglicano è l’unico strato esterno alla membrana cellulare e il suo spessore va dai

20 agli 80 nm, inoltre sono presenti proteine ed acidi tecoici (glicerina e ribitolo alternati con

acido fosforico); nei batteri Gram negativi è presente una membrana esterna di lipopolisaccaride

(LPS) che ricopre uno strato molto sottile (1 nm) di peptidoglicano [3] (Fig. 3).

Gram (+) Gram (-)

Tipo di batteri Peptidoglicano Peptidoglicano

Composizione Acidi tecoici Lipopolisaccaride

Aspetto dei

batteri al

microscopio

ottico

Aspetto della

parete

cellulare al

microscopio

elettronico Figura 3: Caratteristiche differenti nella parete batterica 5

Nei Gram negativi, tra le membrane esterna e quella citoplasmatica, si trova lo spazio

β-

periplasmico che è sede sia della parete del peptidoglicano sia degli enzimi lattamasici, come

penicillasi e cefalosporinasi, capaci di idrolizzare l’anello beta lattamico degli antibiotici.

L’organizzazione strutturale dei Gram negativi rende difficile l’attacco da parte degli antibiotici

beta lattamici poiché questi devono diffondere attraverso porine presenti sulla membrana esterna

per poter raggiungere le maglie di peptidoglicano e, quindi, la membrana citoplasmatica ove si

trovano i siti bersaglio: serinoproteasi, transpeptidasi, transglicolasi ecc., enzimi necessari alla

sintesi della parete batterica e proteine leganti le penicilline, le PBPs; qui le beta lattamine

devono avere la capacità di resistere alle beta lattamasi costitutive dei Gram negativi per poter

esplicare la loro azione.

1.3. Sintesi di peptidoglicano

Nella sintesi di peptidoglicano si distinguono tre stadi:

1) il ciclo dell’UDP avvia il processo biosintetico portando alla produzione, nel citoplasma, di

UDP-acetilglucosamina e UDP- muramil- pentapeptide.;

2) il ciclo del fosfolipide permette di ottenere l’unione ripetuta delle due unità base in modo da

formare un polimero lineare;

3) completa lo sviluppo di parete batterica il cross-linking fra le catene neoformate (Fig. 4).

La formazione di ponti crociati, legami trasversali, si ha mediante un legame peptidico tra il

carbossile dell’alanina in posizione 4 di uno dei pentapeptidi ed il gruppo amminico libero della

lisina in posizione 3 di un’altra catena pantapeptidica con perdita di una D- alanina terminale.

L’energia per il legame di un ponte peptidico da un ramo di una subunità ad un’ altra deriva dal

clivaggio di un residuo terminale di D-alanina dal ramo peptidico stesso. L’aminoacido a ponte

viene legato alla penultima D- alanina dall’enzima transpeptidasi. 6

Figura 4: Fase di cross-linking

McDonough e coll. [4] hanno ottenuto le prime strutture cristallografiche di intermedi cinetici

coinvolgendo una PBP, la D-alanil-D-alanina carbossipeptidasi/transpeptidasi del batterio

Streptomyces R61 ed un suo substrato specifico, un tetrapeptide che corrisponde ad una porzione

di peptidoglicano. È stato estrapolato il complesso enzima-substrato unito non covalentemente

(ES) e poi il complesso enzima-prodotti (EPs) (Fig. 5).

Nella figura E è l’enzima libero, S è il substrato, ES è il complesso non covalente, ES* è il

complesso covalente, EP è il complesso non covalente tra l’enzima e il peptide idrolizzato, e P

rappresenta il peptide libero prodotto.

Figura 5: Reazione carbossipeptidasica di R61 DD-peptidasi 7

Nel complesso ES (Fig. 6A) si può vedere l’ossigeno catalitico della Serina attiva S62

posizionato a 2.8 A° dal carbonio del carbonile del peptide legato. Numerose interazioni non

covalenti, tra il tetrapeptide substrato e l’enzima, dimostrano la straordinaria specificità di tale

substrato.

Figura 6A. Complesso ES. I residui del sito attivo sono in giallo, il tetrapeptide substrato è

arancione. I legami idrogeno sono raffigurati come linee tratteggiate grigie, le interazioni

idrofobiche gialle, e i cross-links come linee piene rosse.

Figura 6B. Il complesso EPs. Sia il tripeptide prodotto sia la D-alanina libera sono in

arancione. 8

Nel complesso EPs (Fig. 6B) si osservano cambiamenti conformazionali sia nel tripeptide

prodotto sia nei residui del sito attivo che provocano l’espulsione finale dei prodotti.

La D-alanina terminale ruota di 110 gradi rispetto al legame del carbonio alfa, disponendo il

gruppo carbonilico in una situazione di relativa idrofobicità, mentre il metile si muove sul piano

di un legame idrogeno che conserva un residuo di asparagina, terminando la reazione. Inoltre, la

catena di treonina 301 si trova in una conformazione molto tesa. 9

CAPITOLO 2

2.1. PBPs

Le Penicillin- Binding- Proteins sono enzimi con ruoli diversi ed essenziali all’interno della

cellula batterica e la cui mancanza o inibizione ha effetto battericida.

Le PBP – 1 sono transpeptidasi, come le serinotransferasi, necessarie all’integrità strutturale e la

cui i