Chimica farmaceutica - penicilline

Studi biochimici e chimico-conformazionali sugli enzimi

Nell'ultimo decennio, sono stati condotti molti studi di tipo biochimico e chimico-conformazionale per sapere di più su tali enzimi, per indagarne le funzioni e per scoprirne gli effetti in seguito a mutazioni (come sostituzioni aminoacidiche o delezioni), al fine di individuare target per lo sviluppo di nuovi farmaci antimicrobici che subentrino a quelli verso cui i batteri hanno ormai rivolto meccanismi di resistenza.

L'approccio di Drug Design Razionale, diretto o Receptor-based, è tra quelli fondamentali e maggiormente riusciti per le caratteristiche di razionalità nella ricerca e sviluppo, appunto, di molecole interagenti con un substrato la cui struttura ai raggi X è nota.

Alcuni studi hanno determinato le strutture tridimensionali di numerosi peptidi coinvolti in diversi processi cellulari attraverso tecniche spettroscopiche, NMR e raggi X. Tali strutture sono state catalogate e rese disponibili via web in una sorta di "banca".

dati" mediante la quale è possibilerisalire alla molecola d’interesse, trovarne i riferimenti in letteratura e tracciarne le caratteristichecome la sequenza aminoacidica in dettaglio, la misura degli angoli di legame ecc.

Inserendo “Penicillin-Binding-Proteins” per la ricerca su Protein Data Bank, le immaginicristallografiche fornite sono 128. I modelli riportati presentano diversi valori di risoluzione,mostrano strutture di peptidi non legati ad alcun substrato e strutture cocristallizzate nelle quali èpossibile riconoscere i siti di legame ed i gruppi funzionali interagenti e più interessanti da unpunto di vista di studio conformazionale.

Tra i numerosi studi effettuati negli ultimi anni quello di Nicholas e collaboratori [5] svela glieffetti di una mutazione indotta nella PBP-5.

La funzione della PBP-5 nell’Escherichia coli è D-alanina -carbossipeptidasica (CPase): scindela D-alanina dall’estremità C-terminale

dalla catena peptidoglicanica. Come tutte le PBPs, laPBP-5 forma un complesso acil-enzima con gli antibiotici beta lattamici, ma si distingue perl'elevato rapporto di deacilazione del complesso ( t 10 minuti circa).1/2Secondo questo studio una mutazione consistente in Gly105→Asp migliora sensibilmente ladeacilazione con minimi effetti sull'acilazione, inoltre abolisce l'attività carbossipeptidasica.

La struttura tridimensionale della forma solubile della PBP-5 originaria (non mutata) è stata determinata con una risoluzione di 1.8 A° (Fig. 7) e quella della forma mutata Gly105 con un valore di risoluzione di 1.9 A°.

Il confronto delle due strutture rivela che l'effetto principale della mutazione è un disordine nel tratto che comprende i residui 74-90 che si trovano a livello del sito attivo. Questi dati suggeriscono un ruolo diretto nella deacilazione e nella regolazione del complesso acil-enzima per il tratto 74-90.

Figura 7. 1NZO:

PBP5 nativa [5]

Il recentissimo studio condotto da Kishida [6] mostra la struttura cristallina della PBP-4 derivatada Escherichia coli. Questa possiede attività sia di DD-endopeptidasi, sia di DD-carbossipeptidasi. La PBP-4 è una delle 12 PBPs presenti nell'Escherichia coli che sono coinvolte nella sintesi e nel mantenimento della parete cellulare.

Il modello proposto contiene un dominio legante le penicilline che include una vasta inserzione con ripiegamenti nei domini(Fig. 8-9). Le strutture della proteina possono legare covalentemente fino a cinque diversi antibiotici con i residui dei siti attivi che restano immodificati nella α-eliche disposizione delle e nella superficie. La geometria dei residui del sito attivo confrontata con altre PBPs suggerisce una possibile causa della lenta acilazione delle PBP-4.

Figura 8. 2EX6: PBP-4 e ampicillina [6]

Figura 9. 2EX8: PBP-4 e penicillina G [6]

CAPITOLO 3

3.1. Penicilline

Le penicilline sono composti caratterizzati da

Un nucleo tiazolidinico o beta lattamico è ciò che rappresenta il requisito per l'attività battericida ed è quindi il gruppo farmacoforo. Tale requisito è condizionato, però, dalla presenza in posizione alfa dell'anello di un gruppo amminico sostituito da un radicale acilico (Fig. 10). Le penicilline sono N-acilderivati dell'acido 6-aminopenicillanico (6-APA), composto biciclico ottenuto per fusione di un anello a quattro termini beta lattamico con un anello tiazolidinico a cinque termini. Si distinguono penicilline naturali, ottenute da colture di Penicillium notatum o chrysogenum, e semisintetiche, ottenute dall'acilazione del 6-APA.

Figura 10. Classificazione delle penicilline

3.2. Meccanismo d'azione
Le beta lattamine si comportano da "substrati suicidi" in quanto acilano irreversibilmente gli enzimi bersaglio all'altezza dei siti attivi, rendendoli inattivi, e contemporaneamente

perdonol'integrità della propria struttura beta lattamica. La transpeptidasi viene acilata dalla penicillina sull'ossidrile del residuo di Serina con conseguente formazione di penicilloil-enzima inattivo e relativa scissione del legame –CO-NH-β-lattamico. dell'anello Figura 11. Acilazione β-lattamico L'anello dell'antibiotico forma con l'enzima transpeptidasi un legame acilico covalente ed irreversibile probabilmente per l'analogia sterica tra l'antibiotico ed il bersaglio dell'enzima, costituito dalle due D-alanine. A livello molecolare il meccanismo delle penicilline consiste in un attacco nucleofilo del gruppo ossidrilico della Serina presente nell'enzima transpeptidasi al carbonio del carbonile dell'anello betalattamico (Fig. 11). 153.3. Uno studio La struttura co-cristallizzata del complesso PBP-penicillina G è stata determinata con una risoluzione di 1.3 Å (Fig. 12) per studiarne gli

Aspetti del substrato specifico ed il meccanismo catalitico. Per l'analisi è stata generata una proteina inattiva, usata per produrre complessi enzima-substrato, provocando la mutazione di un residuo implicato nella stabilizzazione dell'intermedio tetraedrico che si forma durante la catalisi così da inattivare l'enzima senza prevenire il processo autocatalico o l'abilità di legare il substrato.

Il residuo dell'enzima mutato in Ala sull'-OH è Asn B241 ed ha un ruolo importante nel mantenere la geometria del sito attivo e nel legare del substrato. Le analisi di questa struttura mostrano una reazione che procede in maniera diretta attraverso un attacco nucleofilo della SerB1 sull'amide [7].

163.4. Spettro d'azione delle penicilline. Tutte le penicilline (ad eccezione degli agenti antistafilococcici semisintetici penicillasi-resistenti) vengono idrolizzate dalle beta lattamasi e sono

quindi inefficaci contro ceppi che producono questi enzimi. La penicillina G ha uno spettro che comprende le spirochete (Treponema pallidum, Borrelia e Leptospira), gli streptococchi (di gruppo A e B, viridanti e Streptococcus pneumoniae), gli enterococchi, la maggior parte delle neisserie e pochi stafilococchi, molti batteri del cavo orale di difficile coltura (Porphyromonas e Prevotella spp., streptococchi, Actinomices e Fusobacterium), Clostridium spp. (eccetto C. difficile). Tuttavia la resistenza alla penicillina G è molto diffusa tra gli stafilococchi, sta aumentando tra i gonococchi, gli enterococchi, i pneumococchi e sta emergendo tra i meningococchi. La penicillina G è un farmaco di scelta per la sifilide, la framboesia, la leptospirosi, le infezioni da stafilococchi di gruppo A e B, l'actinomicosi, le infezioni orali e periodontali, la meningite meningococcica, l'endocardite da streptococco viridante, il tetano, il carbonchio, la febbre da morso di ratto.spettro dell'ampicillina si estende ad alcuni batteri Gram negativi; è attiva contro alcuni ceppi di Escherichia coli, Proteus mirabilis, Salmonella, Shigella, H. influenzae ed è uno dei farmaci di scelta per i microrganismi sensibili ai beta lattamici che causano infezioni urinarie, per la salmonellosi, la meningite e la laringite da H. influenzae e per la meningite da Listeria monocytogenes. Il frequente sviluppo di una resistenza a questo antibiotico ne ha ridotto il valore terapeutico in alcune situazioni. Per esempio più dell'80% dei ceppi di E. coli e P. mirabilis risulta resistente in alcuni ospedali, così come dal 10 al 30% dei ceppi di H. influenzae. Le penicilline penicillasi-resistenti vengono usate solamente per il trattamento delle infezioni stafilococciche e sono farmaci di scelta nelle infezioni sistemiche o profonde da germi sensibili. Sfortunatamente, in media circa il 30% dei ceppi di S. aureus e più del 60% degli isolati.distafilococchi coagulasi negativi acquisiti negli ospedali statunitensi sono resistenti a questi agenti (cioè meticillino-resistenti). Lo spettro antibatterico di questi farmaci comprende anche la maggior parte dei batteri Gram positivi sensibili alla penicillina G. Lo spettro delle penicilline anti-Pseudomonas comprende i batteri sensibili all'ampicillina e altri bacilli Gram negativi enterici diversi da Pseudomonas. Per esempio, la piperacillina è attiva contro molti Proteus indolo positivi, Enterobacter, Providencia, Klebsiella e Serratia spp. Tuttavia, la sensibilità di queste penicilline alle beta lattamasi limita notevolmente la loro utilità come terapia empirica di fronte al sospetto di infezioni causate da microrganismi Gram negativi enterici. Il ruolo principale di questi composti è nel trattamento di infezioni, dimostrate o sospette, da P.aeruginosa e Acinetobacter, per i quali sono tra i farmaci di scelta. La loro attività relativa.

La sensibilità di Pseudomonas ai seguenti antibiotici è la seguente: piperacillina > mezlocillina > carbenicillina[8-9].

PENICILLINE SENSIBILI ALLE BETA LATTAMASI

• Penicillina G

SPETTRO LIMITATO

• Penicillina V
• Ampicillina

ATTIVE SUI BACILLI ENTERICI

• Amoxicillina
• Carbenicillina, ticarcillina, mazlocillina, azlocillina, piperacillina, Indanil-carbenicillina

PENICILLINE RESISTENTI ALLE BETA LATTAMASI

• Meticillina, oxacillina, nafcillina, Cloxacillina, dicloxacillina
• Ticarcillina e acidoclavulanico, ampicillina e sulbactam, piperacillina e tazobactam
• Amoxicillina e acidoclavulanico

CAPITOLO 44.1. Resistenza batterica

Batteri che sono normalmente suscettibili a certi agenti antibatterici possono acquisire resistenza. La resistenza acquisita rappresenta una delle principali limitazioni a un'efficace chemioterapia antibatterica. I batteri sviluppano resistenza agli antibiotici beta lattamici con vari meccanismi.

Il più comune è il grassetto.