Chimica farmaceutica - farmaci antimicobatterici

Antimicobatterici

diffusa che colpisce 2 miliardi di persone, vale a dire 1/3 della popolazione mondiale, ed uccide ogni

anno 2 milioni di persone. L’Organizzazione Mondiale della Sanità (WHO) ha stimato che l’infezione

cresce annualmente dell’1% e che per il 2020 ci saranno 1 miliardo di nuovi casi di infezione, 200

milioni di persone svilupperanno la malattia in forma attiva e 35 milioni di queste moriranno di

tubercolosi.

La tubercolosi è una malattia particolarmente frustrante da curare per una varietà di fattori

concomitanti. Uno degli aspetti più paradossali è che la maggior parte dei farmaci usati per trattare la

tubercolosi sono ancora molto efficaci. Tuttavia, perché la terapia abbia successo, si richiede l’uso di

una combinazione di più farmaci per almeno sei mesi. La maggior parte (95%) dei casi di tubercolosi si

manifesta nei Paesi in via di sviluppo, dove i costi relativamente alti della terapia, la limitata

disponibilità di farmaci e le carenze dell’organizzazione sanitaria fanno sì che la terapia sia poco

gradita e non completamente seguita dal paziente, con conseguente selezione di ceppi di M.

tuberculosis resistenti ai farmaci utilizzati. Infine va ricordato che 2/3 delle persone colpite non hanno

accesso ad una terapia efficace. Ma anche quando la terapia è accessibile e adeguatamente utilizzata

può risultare parzialmente inefficace contro ceppi multiresistenti di tubercolosi (multi-drug resistant

tuberculosis, MDR-TB). Nel 2000 è stato calcolato che il 3,2% dei nuovi casi di tubercolosi (da

185.000 a 414.000) erano multiresistenti. Stime attendibili collocano i costi per il trattamento di MDR-

TB intorno a 250.000-750.000 $ per paziente.

Come conseguenza di quanto detto, si è avuto a partire dalla metà degli anni ’90 un risveglio di

interesse per lo sviluppo di nuovi farmaci antitubercolari ed in particolare per

• farmaci capaci di trattare efficacemente la forma attiva della malattia in un periodo di tempo più

breve e/o con una somministrazione meno frequente e non continuativa

• farmaci in grado di curare la MDR-TB

• farmaci utili a prevenire l’insorgenza della malattia in soggetti a rischio di MDR-TB.

Occorrono anche farmaci meno costosi e compatibili con una concomitante terapia antiretrovirale per

l’HIV, a causa del crescente problema rappresentato dalla coinfezione da tubercolosi e HIV: 1/3 dei 39

milioni di persone infettate da HIV sono anche infettate dalla tubercolosi, soprattutto nell’Africa sub-

Sahariana. I malati di AIDS sono particolarmente vulnerabili alla tubercolosi per via del loro sistema

immunitario indebolito, che li rende più suscettibili di attacco da parte del micobatterio ed anche

permette ad infezioni tubercolari contratte in precedenza, ma fino ad allora soppresse o contenute dal

sistema immunitario, di diventare attive. La tubercolosi è una delle principali cause di morte dei

soggetti che contraggono un’infezione da HIV, ma la terapia simultanea di entrambe le malattie è

difficile: molti medicamenti antitubercolari di prima linea, come la rifampicina, provocano effetti

collaterali dovuti ad interazioni tra farmaci se somministrati insieme a farmaci antiretrovirali, perché

utilizzano entrambi la stessa via metabolica a livello epatico. 3

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Sebbene siano passati più di 40 anni dalla scoperta dell’ultimo nuovo farmaco antitubercolare

(rifampicina), molti nuovi composti sono in sviluppo, alcuni dei quali già in fase clinica.

La chemioterapia antitubercolare, che all’inizio si muoveva in parallelo con quella antileprotica, ha

acquistato una propria fisionomia con la scoperta nel 1944 della streptomicina, il primo antibiotico ad

essere usato nella cura della tubercolosi, e con il successivo avvento nel 1952 della isoniazide, che

hanno fatto cadere in disuso il DDS come antitubercolare. A partire dal 1955, l’associazione di

streptomicina, acido p-aminosalicilico e isoniazide è stata adottata come trattamento standard nei Paesi

occidentali.

Non sarà mai enfatizzato abbastanza che, ai fini di una cura adeguata, il completo rispetto del regime

terapeutico è almeno altrettanto importante del livello di efficacia dei farmaci somministrati. Ancora

peggio, il mancato rispetto della terapia prescritta è probabilmente la causa principale dell’insorgenza e

della diffusione di ceppi di M. tuberculosis multiresistenti.

Antitubercolari di scelta primaria (first-line drugs)

Un posto preminente occupano in questo gruppo l’isoniazide, la rifampicina e la pirazinamide, seguiti

subito dopo dall’etambutolo e dalla streptomicina.

Isoniazide (INI)

L’isoniazide o idrazide dell’acido isonicotinico (INI), scoperta casualmente nel corso di indagini su

tiosemicarbazoni di aldeidi aromatiche eterocicliche correlati con il tiacetazone, è oggi uno dei più

importanti chemioterapici antitubercolari. E’ molto attiva e pochissimo tossica (effetti collaterali sono

cefalea, vertigini e neurotossicità), ma ha lo svantaggio di presentare il fenomeno della

chemioresistenza. Infatti con il tempo, essendo la tubercolosi una malattia cronica a lungo decorso che

richiede lunghi tempi di cure, si formano ceppi di micobatterio tubercolare capaci di resistere all’azione

dell’INI. A questo inconveniente, più o meno tipico di tutti i chemioterapici antitubercolari (e non solo

antitubercolari) si ovvia con la somministrazione di altri antitubercolari di scelta primaria o con l’uso di

associazioni di INI con altri antitubercolari di scelta primaria o secondaria.

L’INI viene somministrata generalmente per via orale in compresse da 50 mg o come sciroppo e

talvolta per via parenterale o rettale.

E’ in realtà un profarmaco il cui meccanismo di azione è stato completamente chiarito solo molto

recentemente (seconda metà degli anni ’90). Per azione di una catalasi-perossidasi (KatG) l’isoniazide

dà origine ad una specie radicalica altamente instabile che blocca l’NADH e di conseguenza l’enzima

InhA (reduttasi NADH-dipendente), la cui attività è necessaria per operare la riduzione di acidi grassi

insaturi in acidi grassi saturi che andranno a formare gli acidi micolici, costituenti essenziali e specifici

della parete cellulare del micobatterio (vedi Figura 16 nel capitolo 5.4 Profarmaci). 4

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Si ottiene sinteticamente a partire dalla piridina (Tavola 2). Questa per trattamento con zinco in

presenza di anidride acetica subisce una dimerizzazione riduttiva a dipiridilderivato, che per

riscaldamento perde piridina per dare una diacetildiidropiridina. Per riduzione di questo con zinco ed

acido cloridrico (riduzione di Clemmensen) si ottiene la 4-etilpiridina, che viene a sua volta ossidata

sulla catena laterale ad acido 4-piridincarbossilico o acido isonicotinico. Da questo per esterificazione e

successivo trattamento con idrazina si perviene all’INI. L’acido isonicotinico necessario per la sintesi

dell’isoniazide si può ottenere alternativamente dall’acido citrico, che per parziale esterificazione con

etanolo in presenza di acido p-toluensolfonico fornisce un diestere che sottoposto a reazione con

ammoniaca sotto pressione ed alla temperatura di 130 °C porta all’acido 2,6-diidrossipiridin-4-

carbossilico. Questo per clorurazione e successiva riduzione fornisce l’acido isonicotinico.

Oltre che da sola e nelle associazioni, l’INI trova applicazione in terapia sotto forma di sali e di derivati

alla funzione idrazidica. Questi derivati sono chemioterapici antitubercolari meno tossici e meglio

tollerati dell’isoniazide, per cui vengono talora preferiti al farmaco madre. Sembra comunque accertato

che la loro attività sia dovuta alla messa in libertà in vivo di INI ad opera di enzimi idrolitici, pur

essendo loro stessi risultati attivi in vitro. Si tratta per lo più di composti di derivatizzazione (idrazoni)

dell’INI con aldeidi aromatiche ed eterocicliche.

Rifamicine

La rifamicina B (Tavola 3), un antibiotico naturale isolato dai terreni di coltura dello Streptomyces

mediterranei (successivamente riclassificato come Nocardia mediterranea ed infine come

Amycolatopsis mediterranea), ed i derivati semisintetici rifamicina SV, rifamide e rifampicina

appartengono alla classe degli antibiotici. Posseggono una struttura piuttosto complessa caratterizzata

da una catena di natura alifatica, biogeneticamente derivante da unità propionato, i cui estremi sono

collegati ad un gruppo cromoforo naftoidrochinonico variamente sostituito. Questo tipo di struttura è

detto ad “ansa” e gli antibiotici che la contengono (rifamicine, tolipomicine, streptovaricine,

geldamicina e maitansina) vengono chiamati “ansamicine”.

Le rifamicine sono attive in vitro contro germi Gram-positivi, incluso il bacillo di Koch, ed in misura

minore contro batteri Gram-negativi. Tuttavia le rifamicine, in particolare la rifamicina SV, non sono

attive per via orale e l’uso clinico di questi antibiotici era limitato alla somministrazione parenterale.

La scoperta della rifampicina a metà degli anni sessanta ha risolto i problemi associati allo scarso

assorbimento orale di questi antibiotici. Le rifamicine hanno una spiccata affinità per il tessuto epatico,

dove vengono concentrate, metabolizzate ed eliminate con la bile, effettuando in seguito, per

riassorbimento intestinale, un circolo entero-epatico. La rifampicina, oltre che in tisiologia, è utilizzata

nelle infezioni epato-biliari, in otorinolaringoiatria ed in dermatologia; può provocare disturbi

gastrointestinali ed eruzioni cutanee. Oltre che da sola la rifampicina è usata in associazione con altri

chemioterapici antitubercolari onde evitare l’insorgere di chemioresistenza. 5

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Per quanto riguarda il meccanismo di azione, la rifampicina inibisce la sintesi dell’RNA batterico

legandosi alla subunità beta della RNA polimerasi DNA-dipendente del batterio. E’ interessante

osservare che le rifamicine solo la sola classe di antibiotici di uso clinico con questo meccanismo di

azione.

Mentre le modifiche sperimentate sul ponte alifatico della rifamicina causano generalmente riduzione

dell’attività e non vengono perciò di solito attuate, le modifiche strutturali alle posizioni C3/C4 del

nucleo naftalenico continuano a produrre derivati provvisti di potente attività e somministrabili per os.

Per esempio il KRM-1648, un nuovo derivato rifamicinico con un raggruppamento 5-

piperazinilbenzossazinico alle posizioni C3/C4 è risultato sia in vitro che in vivo molto più attivo della

e MIC contro 30 isolati clinici di M. tuberculosis pari a 0.016

rifampicina, mostrando valori di MIC

50 90

e 2 µg/ml, rispettivamente. Questi valori sono molto più bassi di quelli mostrati dalla rifampicina, che

sono rispettivamente di 4 e >128 µg/ml. KRM-1648 presenta anche notevole attività verso il M. leprae,

con una MIC in vitro pari a 0.05 µg/ml, risultando così 6 volte più attivo della rifampicina. In

combinazione con oflossacina, a concentrazioni rispettivamente di 0.006 µg/ml e 0.375 µg/ml, si è

avuta completa inibizione della crescita del bacillo di Hansen, grazie al sinergismo di azione tra i due

farmaci ed all’effetto battericida dell’associazione. KRM-1648 presenta elevata semivita plasmatica e

raggiunge livelli tissutali molto alti, aspetti questi che contribuiscono positivamente alla sua eccellente

efficacia in vivo. La sua potente azione antimicobatterica è in gran parte dovuta alla sua notevole

lipofilia, che determina una maggiore capacità di penetrare la parete cellulare dei micobatteri.

La pirazinamide (Tavola 4) fu introdotta in terapia nel 1949 e dal 1985 è diventato il terzo farmaco

antitubercolare in ordine di importanza. Il meccanismo d’azione della pirazinamide è sconosciuto, ma

recentemente (1995) i ricercatori hanno ipotizzato che possa funzionare da profarmaco dell’acido

pirazinoico in quanto verrebbe convertita in questo dalle amidasi del micobatterio. Sulla base di questa

ipotesi sono stati sintetizzati e valutati come antitubercolari svariati esteri dell’acido pirazinoico, che

potrebbero ugualmente liberare acido pirazinoico per azione delle esterasi batteriche, e molti di questi,

in particolare quelli più lipofili (estere n-decilico, n-pentadecilico ed altri esteri sostituiti con un atomo

di cloro alla posizione 5 della pirazina) sono effettivamente risultati molto attivi in vitro.

Il fatto che a sessanta anni dall’ingresso in terapia si studi ancora la pirazinamide ed i suoi derivati

dimostra le enormi difficoltà in cui ancora si muove la ricerca antitubercolare all’inizio del terzo

millennio.

Etambutolo

L’etambutolo o dicloridrato della (+)-N,N-di-(1-idrossimetilpropil)etilendiamina è un tubercolostatico

attivo sui micobatteri resistenti alla isoniazide ed alla streptomicina ed in ciò consiste il suo particolare

valore clinico. Mostra però una certa tossicità, in quanto può provocare disturbi visivi reversibili e

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neurite del nervo ottico, per cui non trova largo impiego da solo, anche perché è meno attivo dell’INI,

ma acquista particolare significato nelle associazioni e specie nei casi di chemioresistenza ad altri

antitubercolari.

Il suo meccanismo di azione non è stato ancora del tutto delucidato, ma sembra che questo farmaco

provochi alterazioni della parete del batterio, tanto da renderlo sensibile anche ad antibiotici

(claritromicina) che normalmente sono inefficaci su M. tuberculosis.

Si prepara per sintesi, per reazione tra l’1,2-dicloroetano ed il (+)-2-aminobutanolo (Tavola 5).

Presenta due centri stereogenici, ma per la simmetria della sua struttura possono esistere solo tre

stereoisomeri: di questi solo la forma destrogira è utilizzata in terapia, mentre l’enantiomero levogiro e

la forma meso non hanno interesse in tal senso.

Per la streptomicina e derivati si rimanda alle lezioni sugli antibiotici aminoglucosidici.

Antitubercolari di scelta secondaria (second-line drugs)

Tra i numerosi composti che vengono annoverati in questo gruppo (PAS, cicloserina, etionamide,

tiacetazone, per citarne solo alcuni), tratteremo brevemente il PAS.

Il PAS o acido p-aminosalicilico è senz’altro tra i farmaci di scelta secondaria quello più conosciuto e

studiato.

E’ un analogo dell’acido p-aminobenzoico (PAB), nei confronti del quale esercita azione competitiva

nella biosintesi dell’acido folico. In effetti la constatazione che la crescita del bacillo di Koch era

influenzata positivamente dalla presenza degli acidi benzoico o salicilico e la scoperta dell’esistenza di

un antagonismo competitivo tra sostanze strutturalmente simili come il PAB e la sulfanilamide

indussero i ricercatori a sintetizzare derivati dell’acido salicilico simili al PAB per usarli come

antimetaboliti nei riguardi del micobatterio tubercolare. Dei vari derivati sintetizzati il PAS risultò il

più attivo e venne introdotto in terapia. Tuttavia l’esatto meccanismo d’azione del PAS è ancora

oggetto di studio.

L’insorgere della chemioresistenza limita l’uso del PAS alle sole associazioni con altri antitubercolari.

Il PAS trova scarso uso come tale anche per la sua instabilità all’aria ed alla luce. I sali più usati sono

quelli di sodio e di calcio.

Sia il PAS che i suoi sali possono contenere come impurezza il m-aminofenolo, proveniente dalla

sintesi del PAS o dalla sua decomposizione all’aria ed alla luce.

Il PAS ed i suoi sali possono dare fenomeni di intolleranza gastrointestinale, tenuto conto della elevata

dose massima giornaliera (15 g) somministrata per via orale per lunghi periodi di tempo. Per questo

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motivo si preferiscono alcuni suoi derivati meglio tollerati dal tratto gastroenterico, quale il fenamisale

(estere fenilico del PAS) e l’N-benzoil-PAS calcico.

La sintesi del PAS (Tavola 6) si realizza a partire dal nitrobenzene, da cui per solfonazione, riduzione e

successiva fusione alcalina si perviene al m-aminofenolo. Da questo per carbossilazione con anidride

carbonica sotto pressione (sintesi di Kolbe) si ottiene il PAS.

Fluorochinoloni

In virtù della loro potenza di azione ed ampiezza dello spettro antibatterico i fluorochinoloni sono

attualmente tra gli agenti antibatterici di sintesi più largamente impiegati in terapia. Vari membri di

questa classe hanno trovato significativa applicazione secondaria come agenti antimicobatterici attivi

per via orale, come ad esempio la ciproflossacina, la oflossacina, la levoflossacina (enantiomero S

dell’oflossacina) o i più recenti sparflossacina, gatiflossacina, moxiflossacina, e sitaflossacina (Tavola

7).

Dal momento che i fluorochinoloni oggi noti sono stati sviluppati come agenti antibatterici per uso

generale, non si vede perché debbano risultare di primo acchito gli antibatterici ideali per uno specifico

germe patogeno, quale il M. tuberculosis, ma esiste sicuramente la possibilità di migliorarli in questo

senso. Ad esempio, si vanno studiando fluorochinoloni che mantengano la loro potenza battericida

anche a valori di pH più acidi del normale, come quelli che si hanno all’interno dei fagolisosomi dei

macrofagi, l’ambiente preferito dai micobatteri. D’altra parte la scoperta che i fluorochinoloni più attivi

in generale contro i germi Gram-positivi e Gram-negativi sono anche i più attivi come antitubercolari

sta ad indicare che il meccanismo d’azione a livello molecolare dovrebbe essere sempre lo stesso:

inibizione duale di una DNA-girasi (topoisomerasi II) e (in molti batteri Gram-positivi) di una

topoisomerasi IV. Tuttavia l’effetto dei fluorochinoloni sul M. tuberculosis può essere dovuto

solamente all’inibizione di una topoisomerasi II, dal momento che in questo patogeno non è presente

alcuna topoisomerasi IV e le funzioni di questa sono svolte almeno in parte dalla DNA-girasi, che

risulta perciò un po’ diversa da quella degli altri batteri.

La terapia della tubercolosi prevede attualmente una prima fase della durata di due mesi in cui si

impiegano quattro farmaci

• isoniazide, rifampicina, pirazinamide e streptomicina oppure

• isoniazide, rifampicina, pirazinamide ed etambutolo

cui segue una fase della durata di quattro mesi con due farmaci, isoniazide e rifampicina.

Gli effetti collaterali tossici, soprattutto l’epatotossicità, rappresentano un problema che in certi casi

costringe all’interruzione del trattamento. I pazienti che seguono questo regime terapeutico diventano

non-infettivi dopo le prime settimane, ma i restanti mesi sono critici per eradicare la frazione a lenta

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crescita dei bacilli e per dare tempo al sistema immunitario dell’ospite di conseguire la guarigione

clinica.

Tuttavia la comparsa di ceppi multiresistenti di M. tuberculosis, resistenti per lo meno ad isoniazide e

rifampicina, costringe a ricorrere ad altri farmaci, anche si scelta secondaria, ma in questo caso le

indicazioni terapeutiche sono molto meno definite e complicate dagli effetti tossici dei farmaci e dalla

coinfezione con HIV-1. Per la terapia della MDR-TB è stato consigliato un regime terapeutico basato

sulla associazione di almeno cinque farmaci antitubercolari idonei, la cui scelta dipenderà dalle

caratteristiche di resistenza effettive o presunte dei ceppi di bacilli considerati. In ordine di preferenza

questi cinque farmaci possono essere scelti tra i seguenti:

1. In ogni caso i farmaci di scelta primaria che risultano ancora attivi sul paziente specifico:

isoniazide, rifampicina, pirazinamide ed etambutolo.

2. Poi si prendono in considerazione gli antibiotici iniettabili: streptomicina, kanamicina,

amikacina, capreomicina, ecc…

3. Uno tra i vari fluorochinoloni già citati in precedenza. I farmaci di questa classe si sono

dimostrati indispensabili per la terapia della MDR-TB. Inoltre alcuni di essi possono portare ad

una riduzione dei tempi di trattamento, anche se il loro uso in monochemioterapia può

selezionare ceppi resistenti.

4. Farmaci di scelta secondaria di provata efficacia clinica, nonostante i loro maggiori effetti

tossici, come PAS, etionamide, cicloserina…

5. Possono infine essere considerati anche altri farmaci, sebbene il loro impiego in tisiologia è

ancora oggetto di discussione: amossicillina/acido clavulanico; rifabutina, tiacetazone… 9