Chimica analitica

METODO DELLE AGGIUNTE MULTIPLE

1. Vengono preparate aliquote identiche Vx del campione a concentrazione molare incognita Cx

2. Si aggiunge un volume variabile Vs della soluzione standard a concentrazione molare nota Cs a ciascuna aliquota incognita

3. Si diluisce ciascuna soluzione ad un egual volume Vt = Vx + Vs + Vsolvente

4. Si effettuano le misure strumentali su ciascun campione per ottenere le risposte strumentali (segnale) Stot = Sx + Ss

5. Si plotta Stot in funzione di Vs

6. Si ricava attraverso i minimi quadrati l'equazione della retta → Stot = mVs + q

VALIDAZIONE DEL MODELLO ANALITICO

ASSICURAZIONE DI QUALITÀ → Insieme delle procedure adottate per assicurare la risposta corretta per gli scopi che ci si propone (ovvero una sufficientemente precisa ed accurata)

VALIDAZIONE → Processo finale dello sviluppo di un metodo analitico e fa parte del sistema di assicurazione di qualità. Le procedure di validazione dimostrano se il metodo è adatto allo scopo e

rispetta tutti i requisiti per la misura di una specifica sostanza

• Validazione interna
• Validazione interlaboratorio

CRITERI PRIMARI

1. Precisione
2. Accuratezza
3. Limite di rivelabilità

CRITERI SECONDARI (hanno un effetto sui criteri primari)

1. Limite di quantificazione
2. Linearità
3. Rance
4. Selettività
5. Sensitività
6. Robustezza

GOLDEN RULES

• Validare l'intero metodo (a partire dalla parte preparatoria del campione)
• Validare il metodo su un intervallo di concentrazioni
• Validare il metodo su un insieme di matrici

PRECISIONE Rappresenta l'accordo tra misure ripetute della stessa grandezza (repliche) effettuate nelle stesse condizioni. È una misura delle dimensioni degli errori casuali. PRECISIONE STRUMENTALE è valutata quando la stessa quantità di campione viene ripetutamente introdotta in uno strumento. La variabilità può essere quindi dovuta a variazioni nelladi tempo breve. quantità introdotta ea variazioni nel responso strumentale. PRECISIONE INTRA-ANALISI → è valutata analizzando molte volte aliquote di un materiale omogeneo con lo stesso strumento, dallo stesso operatore nell'arco della stessa giornata. Ogni analisi è indipendente. PRECISIONE INTERMEDIA → è la riproducibilità osservata quando l'analisi viene eseguita nello stesso laboratorio da operatori differenti con strumenti diversi e in giorni diversi. PRECISIONE INTER-LABORATORIO → è la riproducibilità che si osserva quando le aliquote dello stesso campione vengono analizzate da persone diverse in tempi diversi e in laboratori diversi utilizzando strumenti e reagenti propri di ciascun laboratorio. RIPETIBILITÀ → è la precisione stimata con esperimenti indipendenti replicati sullo stesso campione, effettuati dallo stesso operatore, nello stesso laboratorio, con lo stesso strumento, in un intervallo di tempo breve.

temporale sufficientemente ristretto (si eliminano tutte le sorgenti di variazione controllabili). Si può stimare con diverse procedure, tipo effettuare misurazioni (6/8 repliche) e calcolare la deviazione standard. Il risultato è espresso come coefficiente di variazione. CV% = s/X · 100

DUE SINGOLE MISURE→ è il valore al di sotto del quale ci si aspetta di trovare la differenza in valore assoluto tra due singole misure ottenute con lo stesso metodo sullo stesso campione nelle stesse condizioni (stesso operatore, stesso strumento ecc.) con una probabilità del 95%

RIPRODUCIBILITÀ→ è la precisione stimata con esperimenti indipendenti replicati sullo stesso campione ma effettuati da operatori diversi e/o laboratori diversi e/o strumenti diversi.

DUE SINGOLE MISURE→ è il valore al di sotto del quale ci si aspetta di trovare la differenza in valore assoluto tra due singole misure ottenute con lo stesso metodo sullo stesso

Campione in condizioni differenti (differenti operatori, differenti strumenti ecc.) con una probabilità del 95%

I valori di ripetibilità e riproducibilità possono essere utilizzati per:

• Verificare la corretta applicazione di un metodo analitico da parte di un laboratorio
• Confrontare i risultati ottenuti da differenti laboratori sullo stesso materiale
• Confrontare i risultati ottenuti su un campione con le specifiche relative al lotto esaminato

Stima della precisione in condizioni di ripetibilità e riproducibilità

La media della varianza di p laboratori è chiamata ²varianza di ripetibilità Sr (varianza intra-laboratorio)

La varianza di inter-laboratorio S²

La varianza di riproducibilità S è definita come 17

I valori critici (limiti) di ripetibilità r e riproducibilità R sono definiti come

Il coefficiente sqr2 è dovuto

al fatto che r e R si riferiscono alladifferenza tra due singole repliche (misure in duplicato).Il fattore f è la t di Student assunta di norma uguale a 1.96 (confidenza al 95% circa)

Nel contesto della valutazione della precisione nel processo di validazione di un metodo è importantevalutare la presenza di DATI ANOMALI attraverso opportuni test statistici

DATO ANOMALO→ un risultato isolato che sembra essere esterno all’intervallo degli errori casuali forniti dauna procedura:

• Dati anomali sulla varianza o sulle differenze (test di Cochran)
• Dati anomali sulle medie o sulle singole misure (test di Dixon)

TEST DI COCHRAN

Lo scopo del test è di evidenziare il laboratorio le cui misure duplicate hanno differenze troppo alte, cioèidentificare possibili outers nella varianza delle ripetizioni delle misure effettuate da ciascun laboratorio.Questo test consente di evidenziare laboratori che operano al di fuori della precisione prevista dal

metodo.dove dmax è la differenza più grande tra tutte le misure duplicate, di la differenza delle repliche dell'i-esimo laboratorio, p il numero di laboratori. Il valore C viene confrontato con i valori critici al 1% e 5% delle tabelle di Cochran per un numero di GDL pari al numero di misure duplicate.

TEST Q DI DIXON

Lo scopo del test è determinare se una misura estrema (la più bassa o la più alta di un insieme di repliche) è significativamente diversa dalle altre (dato anomalo). Il test di Dixon può essere applicato ad un insieme di medie provenienti ad esempio da diversi laboratori che hanno analizzato lo stesso campione (circuito inter-laboratorio). Per effettuare il test le misure devono essere ordinate dalla più piccola alla più grande.

ACCURATEZZA

Rappresenta l'accordo tra il valore misurato (singolo o medio) e il valore "vero" (o accettato) della grandezza misurata. È una misura delle

dimensioni degli errori sistematici. L'accuratezza si può stimare: 1. Analizzando campioni di composizione accuratamente nota (materiali standard di riferimento certificati) 2. Analizzando campioni in bianco (che non contengono nessuno degli analiti) 3. Utilizzando un metodo analitico alternativo per misurare la stessa quantità La valutazione dell'accuratezza può essere effettuata in diversi scenari: - Intervallo di concentrazioni ristretto e possibilità di ricostruire la matrice del campione / disponibilità di un campione di riferimento (t di Student) - Intervallo di concentrazione esteso e disponibilità di un campione di riferimento (t di Student a più livelli di concentrazione) - Confronto di due metodi o due laboratori (t di Student sulle medie) - Confronto di più di due metodi o laboratori (ANOVA) TEST DI RECUPERO è il metodo più comune per valutare l'accuratezza quando non

è disponibile unmateriale di riferimento standard o la matrice del campione non è riproducibile. Permette di valutare lapresenza di effetti matrice (verifica se la risposta dell’analita è ridotta o aumentata da interferenti presentinel campione. →RECUPERO PERCENTUALE R% Se il valore di R% è compresonell’intervallo 95% - 105% si può affermare che non esistonoapprezzabili effetti matrice nell’intervallo di concentrazioneconsiderato.

LIMITE DI RILEVABILITÀ (LOD) E DI QUALIFICAZIONE (LOQ)Da misure ripetute del bianco si ottengono:y• Media del segnale biancoDeviazione standard del segnale s• biancoLIMITE DI RILEVABILITÀ LOD→ è la più piccola quantità dianalita che fornisce un segnale significativamentedifferente dal segnale bianco.Nella valutazione del limite di rilevabilità è possibile commettere diversi errori:• Si afferma la presenza dell’analita quando

esso è in realtà assente (errore di primo tipo α o falsopositivo)• Si afferma l'assenza dell'analita quando esso è in realtà presente (errore di secondo tipo β o falsonegativo)

LIMITE DI QUANTIFICAZIONE LOQ→ è la più piccola quantità di analita misurabile con accuratezza ragionevole.

ALTRI CRITERI SECONDARI

LINEARITÀ→ esprime il grado di linearità della relazione tra la risposta analitica e la concentrazione. Valutata con R2 (coeff di determinazione). Per la determinazione di un analita in un campione può essere richiesto un valore di R2 superiore a 0.995

RANGE (INTERVALLO)→ è l'intervallo di concentrazione in cui la linearità, accuratezza e precisione hanno valori accettabili.

SENSIBILITÀ→ la variazione del segnale (variabile dipendente y) per unità di variazione della concentrazione di analita (variabile indipendente x).

SENSIBILITÀ m DI CALIBRAZIONE → è la pendenza m della retta di calibrazione alla concentrazione di interesse.

SENSIBILITÀ ANALITICA γ è la pendenza della retta di calibrazione alla concentrazione di interesse divisa per la deviazione standard dei segnali ad una data concentrazione dell’analita.

SELETTIVITÀ → indica la capacità di un metodo analitico di non risentire della presenza di interferenti o di altri componenti diversi dall’analita in esame. Può essere espressa come rapporto delle sensibilità di due diversi analiti.

ROBUSTEZZA → capacità di un metodo analitico di non essere influenzato da variazioni (piccole e deliberate) nei parametri operativi.

ANALISI DELLA VARIANZA - ANOVA

Con i test statistici t confrontiamo le medie di due popolazioni, è possibile estendere il confronto a più medie mediante ANOVA (ANaly