Biotecnologie dei protisti

Protisti come bioindicatori dell'aria

Uno studio di 25 anni studiò le popolazioni di protisti ciliati nei muschi presenti a Pisa. I dati sono stati messi a confronto poi con la quantità di piombo presente nel muschio, concludendo che anche il traffico influenza le popolazioni di protozoi ciliati presenti nel muschio (anche essi danno quindi informazioni sulla qualità dell'aria).

Studiarono 5 zone diverse di Pisa e una fuori Pisa incontaminata come zona di controllo. Ogni mese, per 7 mesi, veniva prelevato il muschio in queste stazioni e ogni campione veniva portato in laboratorio e immerso in acqua dolce liberando i protozoi per poi poterli isolare e classificare in base alla morfologia. In seguito si contavano le cellule per ogni specie e per ogni campione di muschio si determinava la quantità di piombo utilizzando uno spettrometro ad assorbimento nucleare. Si classificarono 29 specie di ciliati nel muschio.

LEZIONE. 14/11/19 PROCESSI A FANGHI ATTIVI

Bioetici: relazione intra e interspecifiche (competizione, predazione). Considerando i protisti e i ciliati in particolare, troviamo una loro densità di 10.000 cellule/ml^2. I protozoi ciliati che ritroviamo si dividono in base al loro ruolo trofico in 2 gruppi:

1. CARNIVORI (si nutrono di altri protisti)
2. BATTERIOFAGI

Questi ultimi si dividono a loro volta, in base alla modalità di attività predatoria, in 3 gruppi:

1. Natanti - nuotano nella fase liquida dei liquami e si nutrono dei batteri che non sono aggregati. Rimangono in sospensione anche nella vasca di sedimentazione dove avviene la sedimentazione dei fiocchi di fango.
2. Mobili di fondo - si nutrono dei batteri che costituiscono i fiocchi di fango stessi e precipitano.
3. Sessili - sono attaccati grazie ad un peduncolo ai fiocchi di fango e anche essi precipitano nella vasca di sedimentazione. I natanti e i sessili competono tra loro per i batteri che sono liberi (non aggregati), creando

correnticiliari nel liquame, le quali incanalano i batteri verso la loro regione orale. I mobili di fondo invece si nutrono dei batteri che fanno parte del fiocco di fango, creando anche essi delle correnticiliari.

Andiamo a vedere la successione delle popolazione nei processi a fanghi attivi, distinguendo 3 fasi:

1. FASE DI COLONIZZAZIONE ==> caratterizzata da specie tipiche dai liquami ancora da trattare (specie pioniere). Queste sono costituite da protozoi flagellati natanti e compaiono indipendentemente dalla formazione dei fiocchi di fango.
2. FASE DI INNESCO ==> caratterizzata dalla formazione dei fiocchi di fango, i quali sono aggregati batterici misti a materiali organici. Si ha anche la diversificazione della struttura delle specie, la quale varia molto in base alla quantità dei fiocchi presenti. All'inizio della fase quando i fiocchi sono pochi abbiamo protozoi ciliati natanti e scompaiono i flagellati; man mano che si va avanti scompaiono i natanti e compaiono gli altri 2 tipi.

dibatteriofagi.3) FASE DI STABILIZZAZIONE ==> caratterizzata dalla presenza esclusiva dei sessili e dei mobili di fondo.

Un efficiente processo a fanghi attivi:

• Alla fine non dovrebbe avere piccoli flagellati e ciliati natanti (in tal caso c'è un problema di depurazione). La struttura in specie rappresenta un valido indicatore sullo stato di funzionalità di un impianto.
• Dovrebbe avere un'alta densità della microfauna (>= 1 milione di organismi/ L)
• La microfauna è composta principalmente da forme mobili di fondo e sessili, con flagellati assenti
• Comunità altamente diversificata, dove nessunSe queste caratteristiche non si verificano andiamo a vedere il gruppo maggiormente presente nell'impianto e da qui possiamo andare a capire le cause del malfunzionamento dell'impianto.

Il parametro che viene utilizzato per valutare la qualità biologica di un impianto è il cosiddetto "INDICE BIOTICO DEL FANGO" (SBI).

—> Sludge Biotic Index) ed è un valore numerico oggettivo. Questo indice si calcola facendo un’analisi microscopica della microfauna, cioè identificando le specie e stimando quanto numerose sono le specie. Per fare ciò bisogna completare l’analisi entro un tempo limitato dal campionamento (+-5 ore dal campionamento); un altro accorgimento è quello di utilizzare per l’identificazione dei piccoli volumi di liquame (50-100 uL); altro consiglio è di considerare le specie di cui sono stati visti almeno 2 cellule. Il conteggio degli individui deve essere suddiviso in 2 tipi:

- Stima delle densità esclusi flagellati: utilizzo volumi molto piccoli di liquame (25 uL); per evitare l’evaporazione del campione utilizzo coprioggetti; utilizzo un ingrandimento piccolo di 100x (10x e 10x) per avere un campo visivo più grande per contare. Per evitare errori suddivido idealmente il vetrino in fasce verticali e contando le cellule.

partendo da un'estremità all'altra seguendo un percorso a serpentina.

Stima della densità dei piccoli flagellati: vengono contati a parte per le loro piccole dimensioni e perché sono numerose. Per contarli si utilizza una camera di Fuchs-Rosenthal: è un quadrato di 4 mm profonda 0.2 mm e costituita da 256 quadratini (16x16); si mettono 3,2 uL di campione al centro della camera e poi si vanno a contare le cellule che sono presenti nei 16 quadrati che costituiscono una delle 2 diagonali delle camera.

In seguito si calcola SBI, utilizzando una tabella fissa a 2 entrate: quella orizzontale è data inizialmente dal gruppo dominante; quella verticale è data dal numero totale delle specie e ha 4 ingressi. Più è grande il BSI maggiore è l'efficienza dell'impianto. Questo indice si divide in 4 classi, ad ognuna delle quali corrisponde un giudizio.

LEZ 19/11/2019

PRODOTTI NATURALI DA DUNALIELLA SALINAE è una microalga verde

unicellulare ed è un organismo fotosintetico alofilo, cioè è in grado di vivere in acque ad alte concentrazioni saline (come nel lago australiano della lezione precedente). Ha forma ellittico cilindrica con un apice anteriore acuto che si assottiglia e un apice posteriore arrotondato. È lunga circa 8-9 um e larga circa 6-7 um.

In condizioni ottimali si riproduce per via asessuale mediante divisioni binarie longitudinali. All'estremità anteriore possiede 2 flagelli con stessa lunghezza di 10-13 um deputati al movimento dell'organismo.

Dunaniella salina viene studiata e coltivata per la sua capacità di accumulare intracellularmente grandi quantità di molecole bioreattive, tra cui glicerolo e carotenoidi (in particolare Beta-carotene). Le vasche in cui viene coltivata sono all'aria aperta e presentano una caratteristica colorazione rossa. Il fatto di essere un microrganismo alofilo fa sì che le coltivazioni siano facilmente gestibili.

Permettendo la vita solo a questa microalga; inoltre le vasche sono libere da competitori per le condizioni estreme in cui l'alga vive. La coltivazione è molto diffusa in Australia, Israele e USA.

GLICEROLO: Viene utilizzato nel settore medico, alimentare e chimico compreso in quest'ultimo anche quello relativo alla produzione di materiale esplosivo. La sua produzione è aumentata durante le 2 guerre mondiali. Inizialmente il glicerolo era ottenuto dai lieviti e in maniera particolare da saccaromyces cerevisiae.

Qui possiamo vedere la via metabolica che porta al glicerolo:

Anche se le quantità erano basse la richiesta del mercato era alta, quindi era conveniente produrre il glicerolo. Attualmente la produzione tramite fermentazione alcolica è stata abbandonata perché non economica (era un prodotto secondario), quindi veniva effettuato un blocco metabolico, in particolare all'acetaldeide solforata all'etanolo impedendo il passaggio degli elettroni.

mandandoli all'altravia metabolica. Il blocco metabolico non era totale, quindi oltre a glicerolo si aveva anche etanolo, quindi il recupero del prodotto richiedeva dei costi aggiuntivi per eliminare l'etanolo in quanto indesiderato.

Alternativamente il glicerolo si può ottenere con D. Salina. Per produrre anche i carotenoidi da questa microalga si utilizza un processo israeliano. Questo processo si basa sul fatto che, essendo la microalga in grado di vivere ad alta concentrazione salina, questa produce il glicerolo come un soluto intracellulare in grado di bilanciare la pressione osmotica all'esterno (+ è salata l'acqua all'esterno e più si ha accumulo di glicerolo intracellularmente).

Le condizioni necessarie per il processo sono:

• Luce solare
• CO2
• Nitrato
• Fosfato
• pH tra 7-9
• T tra 10-40 °C (T ottimale di 30 °C)
• Concentrazione ottimale di NaCl: 1,5 M (se voglio uno sviluppo cellulare); 4 M

(sevoglio produzione di glicerolo). Spesso si usano sali commerciali o acqua di maresterilizzata. Questo processo è organizzato in 3 fasi:

1. Nella prima fase la coltura di D. Salina viene allestita in una vasca a cielo aperto profonda circa 30 cm. In questa vasca la concentrazione di NaCl è di 1,5 M che produce un rapido sviluppo cellulare. Il contenuto intracellulare di glicerolo è del 12%.

2. Nella seconda fase la coltura viene trasferita in un'altra vasca, ma con volume ridotto di 1/3 rispetto a quello della vasca precedente. In questa seconda vasca la concentrazione di NaCl viene portata a 4 M