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REPLICAZIONE DEL DNA
Il compito del DNA è di immagazzinare l'informazione genetica attraverso una sequenza di basi azotate. Questa informazione deve passare dalla cellula madre alla cellula figlia durante la duplicazione delle cellule. Questo passaggio di informazione prevede la duplicazione del DNA. In questo modo le cellule figlie sono geneticamente identiche alla cellula madre. Come avviene il processo di duplicazione del DNA? Il DNA è formato da una doppia elica, ogni filamento servirà da stampo per la produzione di una nuova catena. 1. Replicazione semiconservativa: il primo passaggio consiste nella separazione dei due filamenti del DNA parentale. Un filamento del DNA parentale viene conservato nella molecola figlia che lo riceve. La replicazione del DNA si svolge in due fasi: a. Degli enzimi specifici hanno il compito di rompere i legami H tra le coppie delle basi azotate: quindi i due filamenti si separano. b. Sintesi dei nuovi filamenti grazie all'enzima.DNA polimerasi che aggiunge nucleotidi all'estremità 3' di ogni filamento. La duplicazione del DNA prevede l'intervento di altri enzimi e proteine: - le proteine elicasi rompono i legami H tra i due filamenti e promuovono lo srotolamento del DNA. L'elicasi necessita di energia e questa arriva da una molecola di ATP - le proteine topoisomerasi lavorano insieme alle elicasi e sono coinvolte nello srotolamento del DNA - le proteine SSB hanno il compito di tenere separati i filamenti - l'RNA-primasi è un enzima con il compito di sintetizzare un piccolo filamento di RNA (primer) sullo stampo del DNA, necessario ad innescare la duplicazione (RNA perché è a singolo filamento e può appaiarsi) - la DNA-polimerasi è un enzima che permette la costruzione del filamento mancante aggiungendo nucleotidi all'estremità libera della catena. In che direzione avviene la sintesi della nuova catena? La catena complementare viene sempre sintetizzata.indirezione 5’→3’ (5’ =indica il C5 libero dailegami e il C3 cheporta il gruppofunzionale che vienelegato alla molecola).Replicazione da 5’ a 3’. Una volta creato il primer RNA, interviene l’enzima DNA polimerasi,→ che allunga la catena aggiungendo nucleotidi, a partire dal primer, in direzione 5’→3’. QuestaDNA polimerasi forma dei legami fosfodiesterici tra l’OH legato al C3 dell’ultimo nucleotide e ilgruppo fosfato legato al C5 (ricrea il polimero DNA).Il filamento prosegue in maniera continua. La DNApolimerasi non si dissocia dal filamento stampo ognivolta che aggiunge un nucleotide alla catena, maresta attaccata e scorre (come se fosse un binario).Replicazione da 3’ a 5’. Si sintetizza in manieradiscontinua e produce i frammenti di Okazaki. Questiframmenti devono poi essere uniti tra di loro performare il filamento continuo: questa operazione diunione dei frammenti è data
dall'enzima DNA ligasi. Alla fine della duplicazione si ottengono 2 molecole di DNA perfettamente identiche all'originale. Spesso durante questo processo la DNA polimerasi commette degli errori scambiando i nucleotidi, mettendone uno in più o saltandone uno. Questo dà vita a delle mutazioni, ma prima che si verifichi il processo di mutazione il sistema ha la capacità di correggere gli eventuali errori: è la stessa capacità della DNA polimerasi, chiamata proofreading (= correzione delle bozze). PCR Il processo di replicazione del DNA può essere usato in laboratorio per ottenere copie multiple di un gene. Un gene è un frammento di DNA. Per studiare un gene sono necessarie tante copie. Per ottenere le copie si ricrea in scala il processo di replicazione del DNA con una tecnica chiamata PCR o Reazione a catena della polimerasi. Usando dei cicli termici in una macchina si ricrea quello che succede nella replicazione del DNA. 1. il primo passaggioper fare tante copie è quello di aprire la doppia elica di DNA. In questo caso si apre con la temperatura (90-95°C), che va a denaturare il DNA.
A questo punto servono dei filamenti che fungono da primer per dare l'innesco; la DNA polimerasi e i nucleotidi che vengono aggiunti. Quindi insieme al campione dove c'è il DNA si aggiungono dei primer costruiti artificialmente, l'enzima e i nucleotidi.
Si abbassa la temperatura specifica perché il primer si attacchi alla sequenza complementare del filamento.
Poi si cambia la temperatura per facilitare la DNA polimerasi che deve sintetizzare il filamento mancante.
Si ottengono così 2 copie di DNA. Solitamente questi cicli si ripetono 30 volte.
Un altro tipo di PCR prende il nome di Reverse transcription. La differenza è che nella PCR classica si parte da DNA; in questa PCR si parte da cDNA (complementary DNA), in pratica si inizia a lavorare dall'RNA. Bisogna creare un filamento
corrispondente all'RNA per ottenere il DNA complementare e a questo punto si può iniziare a lavorare con la PCR.
Se si studia un gene a livello del DNA, è potenziale. Se si studia un gene a livello dell'RNA è certamente espresso.
SINTESI PROTEICA
Oltre a replicarsi il DNA trasferisce la sua informazione in una molecola di RNA, questo passaggio prende il nome di trascrizione.
A sua volta l'RNA passa l'informazione in una proteina, questo processo si chiama traduzione.
Trascrizione + traduzione = fanno parte della sintesi proteica, cioè quell'insieme di processi biochimici che permettono di sintetizzare (ottenere) una proteina partendo dall'informazione contenuta in un DNA.
Per questo se si lavora a livello del DNA si sanno le potenzialità dell'organismo; mentre se si lavora con l'RNA si vede esattamente cosa sta facendo il microrganismo (perché all'RNA viene passata solo l'informazione necessaria).
Dove avviene?
La sintesi proteica avviene nei ribosomi. Nelle cellule eucariote la trascrizione avviene all'interno del nucleo, dove è contenuto il DNA, poi l'RNA messaggero esce, va nei ribosomi e qui avviene la traduzione. Nelle cellule eucariote, una volta che le proteine sono state sintetizzate vengono inviate all'apparato di Golgi, dove poi vengono smistate a seconda delle necessità. Nella cellula procariote il DNA non è racchiuso in un nucleo e tutto avviene nel citoplasma.
Esistono 3 tipi di RNA coinvolti nella sintesi proteica, ognuno con un ruolo preciso:
- RNA messaggero (mRNA), formato da un singolo filamento di nucleotidi. Trasporta l'informazione dal nucleo ai ribosomi. Viene assemblato usando come stampo un segmento di DNA (il gene) in base all'accoppiamento delle basi azotate. Nell'RNA si trova l'uracile al posto della timina.
- RNA ribosomiale (rRNA), i ribosomi sono costituiti da RNA. I ribosomi sono formati da due subunità:
una maggiore e unaminore. L'RNA messaggero cheesce dal nucleo della cellulascorre tra le 2 subunità einsieme all'RNA transfertavviene la costruzione dellaproteina.
3. RNA di trasporto (tRNA), direttamente coinvolto, insieme airibosomi, nella formazione della proteina.Ha una struttura a trifoglio:
- un'estremità (in alto) a cui si lega l'amminoacidocorrispondente (l'estremità 3' presenta un sito diattacco a cui si lega l'amminoacido);
- un anticodone (parte bassa) è complementare allatripletta presente sul mRNA
Il codone è una sequenza di 3 basi che permette disintetizzare un amminoacido. Questo codice èdegenerato perché c'è più di un codone che codificaper la stessa proteina. Ci sono codoni che danno il viaalla sintesi, mentre altri dicono che la sintesi dellaproteina deve interrompersi perché la proteina è stataformata.
TRASCRIZIONE
Le molecole di mRNA vengono
- inizio: dà inizio alla trascrizione e richiede un promotore, cioè una speciale sequenza di DNA alla quale l'RNA polimerasi può legarsi. Per ogni gene c'è almeno un promotore. L'RNA si lega al ribosoma, le cui due parti si chiudono e si legano all'RNA.
- allungamento: inizia dopo che l'RNA polimerasi si è legata al promotore. La RNA polimerasi apre il DNA a circa 10 basi per volta e legge il filamento stampo in direzione 3' → 5'. Come la DNA polimerasi, anche la RNA polimerasi aggiunge i nuovi nucleotidi all'estremità 3' del filamento in crescita, ma a differenza non ha bisogno di un primer per dare inizio al processo. L'allungamento continua finché l'RNA polimerasi raggiunge un sito di terminazione.
- terminazione: si tratta di una sequenza nucleotidica che dice
all'RNA polimerasi dove fermarsi. In questo caso l'RNA polimerasi è in grado di sintetizzare solo un frammento di DNA, che corrisponderà al gene che codifica per una specifica proteina.
La traduzione dell'mRNA richiede una molecola che metta in relazione l'informazione contenuta nei codoni dell'mRNA con specifici amminoacidi delle proteine. Questa funzione è svolta dal tRNA.
Per garantire che la proteina fabbricata sia quella specificata dall'mRNA, il tRNA deve leggere correttamente i codoni dell'mRNA e fornire gli amminoacidi corrispondenti ai codoni letti.
La molecola di tRNA svolge 3 funzioni:
- si carica di un amminoacido
- si associa alle molecole di mRNA
- interagisce con i ribosomi
La struttura molecolare del tRNA è in rapporto con queste tre funzioni.
Per ognuno dei 20 amminoacidi c'è almeno un tipo specifico di molecola di tRNA. Ogni molecola contiene circa 75-80 nucleotidi e presenta una configurazione che
è mantenuta da legami H intramolecolari fra tratti dellasequenza contenenti basi complementari.
All’estremità 3’ di ogni molecola di tRNA si trova il suo sito di attacco perl’amminoacido: il punto in cui l’amminoacido specifico si lega in modo covalente.
Verso la metà della sequenza del tRNA c’è un gruppo di 3 basi, chiamato anticodone, che costituisce il sito di appaiamento tra basi complementari (con legami H) con l’mRNA.
Ciascun tipo di tRNA contiene un particolare anticodone, complementare al codone di mRNA corrispondente al proprio amminoacido.
- Nelle cellule procariote la trascrizione e la traduzionea