Biologia molecolare (terza parte-non coding RNA, ciclo cellulare e apoptosi)

NON CODING RNA

→ housekeeping (costitutivi): t-RNA, rRNA, snRNA, snoRNA, gRNA (guida) e RNA Ai telomeri

regolatrici: miRNA e siRNA → si attaccano al mRNA target

SPEGNIMENTO GENICO

in C. Elegans si è scoperto che alcune di gene LIN-14 codificazioni

per 2 mir (due miRNA) che ag complementari alle seq

nel 3' utr del mRNA di LIN-14 → interazione antisenso

RNA-RNA → scopo è quello di ridurre l'espressione di LIN-14

MECCANISMI DI REGOLAZIONE

-inibiamo la traduzione del mRNA target

-degradiamo o

-inibiamo la trascrizione attraverso del promotore che dirige

l'espressione di mRNA target (meccanismo epigenetico)

SMALL-RNA: siRNA

(small-interfering-RNA) possono essere prodotti artificialmente

(tramite ectopi) oppure la cell e iniettato in vivo a partire

da double-stranded RNA (dsRNA) per proteggersi da RNA estranei

o virus. Non derivano da geni, sono esogeni

geni endogeni → miRNA (.micio-RNA) derivano da geni single-stranded-RNA

piRNA (Piwi-interacting-RNA) esperti nelle cellule germinali

MECCANISMO: nel NUCLEO

-sa parte da un gene da trascrive → miRNA con la pol 2

-> forma il primary-miRNA (pri-miRNA) possono essere

anche in geni

-enzima Drosha accorcia il pri-miRNA

-mi-miRNA diventa precursor miRNA (pre-miRNA)

*nel CITOSOL → pre-miRNA passa nel citosol, dove ci è Dicer

→ dicing dei double-RNA in miRNA del (siRNA/miRNA duplex)

-mir-guida si lega alle seq complementari alle start

del mRNA target; altro mir viene degradato →

rimane formando 5p e 3p

RISC: serve un portatore il piccolo RNA ad appaiarsi con la sequenza target nel mRNA target.

RNA-target: vengono degradati solo se vi è l'appaiamento perfetto con la seq. complementare nello small-RNA (avviene nei siRNA)

oppure vengono inibiti quando l'appaiamento non è perfetto, come nel caso dei miRNA.

Nel citosol vi è un priRNA che per i miRNA il Dicer è necessario

SEED REGION: sequenza di 7 nucleotidi ed è corrispondente alla seq. complementare tra miRNA e mRNA target. Solo le seq tra le pos 2 e 9 dei 22 nucleotidi del miRNA maturo.

I mir/cumi hanno due seed region diverse -> hanno geni bersaglio diversi.

REGOLEZIONE GENICA: i miRNA diversi possono regolare lo stesso gene primis, mentre

miRNA che regola tanti geni.

Ci sono famiglie di miRNA con lo stesso seq. seed e quindi hanno geni controllati in comune.

mir34 -> regula bcr2 importante nell'apoptosi

mir222 -> regula myc

miRNA NEI TUMORI: l'espressione dei miRNA è tumorospecifica si può risalire che nei tumori i livelli di alcuni miRNA vi alterano e vanno ad impattare nella trascrizione di geni de nova coinvolti nella formazione dei tumori.

I miRNA sono descritti come oncosopressore -> se è la loro espressione diminuita può aumentare i tumori

o come oncogeni -> se aumentano la loro espressione, portando il tumore, nuclei e loro target diventa un oncosopressore

RNAI: RNA interferenza inibiscono la funzione di un gene. La scoperta di RNAI ha permesso ai designer ds dsa è legato al 3’utr del mRNA di MYC che è introdotto nelle cellule e quindi l'espressione di MYC è spenta.

Si è scoperto in C. elegans, è introdotto l'RNAI in alcuni mammiferi.

CONTINUA

• Durante la fase S c’è duplicazione e sintesi degli istoni che portano alla duplicazione cromosomica. Ogni cromosoma si duplica e ha 2 cromatidi uniti nel centromero fino alla fase M.
• CARIOtipo: dato dalle morfologie e numero dei cromosomi.
• CITOFLUORIMETRO: misura il contenuto di DNA in una popolazione di cellule. Stimando con picco de coomassie alla percentuale di cell che si trovano nella varie fasi.
• L’ingresso dalla G0 alla G1 e il passaggio dalla G1 alla S richiede l’intervento di messaggi ambientali: sono i fattori di crescita.
• I messaggi più rilevanti per la coltura cellulare è farla crescere senza siero, cosi due rimangere in fase G0.

SISTEMA DI CONTROLLO: dipende da proteine Kinasi dipendenti da ciclina capaci di fosforilare proteina target. Sono le CDK (Ciclina Kinasi dipendenti) la in attività aumenta o diminuisce man mano che la cellula progresse nel ciclo. Quindi la Kinasi è un enzima che fosforila circalando altre proteina e la sua attività aumenta e diminuisce a secondo della fase del ciclo cellulare. Sono la ciclina 2 CDK e 4 inattiva.

• I livelli di CDK sono costanti in circo variaione la ciclina.
• Si forma un complesso ciclina-CDK (fiona) e ciascun complesso se fosforila una serie diversa di proteina substrato.
• Il complesso parzialmente attivo è fatto dalla ciclina e CDK fosforilata, l’attivazione completa avviene quando una Kinasi CDK fosforila in amminoacido tiroinc all’ingresso del sotto attivo della CDK, la CDK attiva fosforila la proteina bersaglio.
• Esiste un fosfato attivatore giunto alla Kinasi, sono inibitore.
• P27 regola negativamente il ciclo cellulare
• APC/c proteina che regola il passaggio tra metafora e antifase
  • regolazione negativa - ubiquitinazione della ciclina
• SCF un attore perché favorisce la poliuqbitinazione della
  • Kinasi-ciclina dipendente

Nel modello conservativo la prima elica in entrambi i filamenti originali è la seconda la filamenti di nuova sintesi.

Nel modello dispersivo si basa sugli studi precedenti, e spravfigurando una miscela.

Nel modello semiconservativo i filamenti sono ibridi.

La sintesi avviene in direzione 5' -> 3' e i due filamenti sono antiparalleli. Si inizia con l'attacco nucleofilo del fosfato e del desossiribonucleotidotripfostato in entrata. Si libera pirofosfato. Lo stampo ha estremità liberata 3' OH. Si dice che il nucleofido entrante ha 1 fosfato in 5'. Il pirofosfato è riliberato quando il nucleofido è legato a l'altro.

L'origine di replicazione è la regione dove inizia la sintesi di DNA. La forca replicativa è il sito della sintesi dove la doppia elica si separa (negli eucarioti ce ne sono tante da ognio cromosoma).

Esiste un frammento veloce e un frammento lento con i frammenti di OKAZAKI.

DNA-pol α - allunga RNA-primase

DNA-pol ε - sintetizza il filamenti guida

DNA-pol δ - sintetizza il filamento lento

DNA-pol γ - replica al DNA mitocondriale