Biologia molecolare (seconda parte-trascrizione e cellula tumorale)

METILAZIONE DEL DNA

Si tratta di epigenetica dove il DNA è metilato non c'è trascrizione. La CITOSINA è la base più metilata, in corrispondenza della CpG islands la C rimane molto spesso metilata, poi C è metilata dall'enzima DNMT (transferasi che trasferisce un gruppo metilico a livello del DNA sulle CG). La C metilata potrebbe anche essere deaminata → diventa T → mutazione perché la C metilata viene sostituita da una T.

CpG islands: zone dove la densità delle C e G è 10 volte maggiore, hanno contenuto metilico del 60% di C e G, occupano regioni di DNA di 10 2 pb, sono soprattutto al 5’ di un promotore per regolare la trascrizione. Le CpG islands sono tante metilate → il promotore del gene è inattivo c'è la repressione dell'espressione genica.

La metilazione del DNA è un evento epigenetico che serve a rimarcare uno dei due alleli (alcune malattie si esprimono a seconda se è il cromosoma X o). AZACITLINA: composto che impedisce la metilazione e si attiva l'espressione di geni. Non è metilabile.

DMNT: enzima che metila il DNA. Esistono le DNMT3a e DNMT3b, essi sono responsabili della metilazione de novo. Invece la DNMT 1 è enzima di mantenimento → quello che quando la cellula duplica deve mantenere nelle cellule figlie lo stesso tipo di metilazione.

Può anche capitare che la DNMT entri nel complesso con la HP1, che ha un dominio che permette alla proteina di legare istoni metilati. La HP1 lega la proteina che lega gli istoni, ma metila anche il DNA (a esempio il complesso proteico di repressione trascrizionale), dove sintetizzano proteine che metilano DNA ed istoni.

METILAZIONE DEL DNA

Si tratta di epigenetica dove il DNA è metilato non c'è trascrizione. La CITOSINA è la base più metilata, in corrispondenza della CpG islands la C rimibe molto spesso metilata, poi C è metilata dall'enzima DNMT (transferasi che trasferisce un gruppo metilico a livello del DNA sulle CG). La C metilata potrebbe anche essere deaminata - diventa T → mutazione perché la C metilata viene sostituita da una T.

CpG islands: zone dove la densità delle C e G è 10 volte maggiore, hanno contenuto medio del 60% di CG.

Originano regioni di DNA di 10 2 pb, sono soprattutto al 5' di un promotore per regolare la trascrizione le C sono tante metilate → il promotore del gene è inattivo e si ha depressione dell'espressione genica.

La metilazione del DNA è un evento epigenetico che serve a inattivare uno dei due alleli → alcune malattie epigenetiche attivate si conoscono con a.

AZACICLINA: composto che inibisce la metilazione e si attiva l'espressione di geni. Non è mutabile.

DNMT è un’enzima che metila il DNA. Esistono le DNMT3a e DNMT3b, queste sono responsabili della metilazione de novo. Invece la DNMT1 è la metil-transferasi di mantenimento e quella che quando la elica duplica deve ripristinare nelle cellule figlie lo stesso tipo di metilazione.

Può anche capitare che la DNMT titolare nel complesso con la HP1 du ha un sotto-dominio che permette alla proteina di legare istoni coinvolti. La HP1 lega la proteina che lega gli istoni, ma metila anche il DNA esempio di complesso proteico di repressione trascrizionale, dove interagiscono proteine che metilano DNA ed istoni.

REPRESSORI TRASCRIZIONALI: il DNA metilato può reclutare proteine che legano altri repressori di trascrizione.

MECUP (Methyl-CpG-binding-protein-2): è una proteina che lega il DNA metilato, quando lo lega recluta altre proteine con funzione repressoria come la HDAC (de-acetilasi) e non vi è trascrizione genica.

TRASCRIZIONE

MELAZIONE

DI DNMT

DEACETILAZIONE DA HDAC

ISTONI

DNA DEMENTOLATO

DEMETALAZIONE SULLA LISINA 9

RET SYNDROME:

IMPRINTING EPIGENETICO

ISOLATORI: bloccano l’attività di un enhancer, sono seq. di DNA, che, se metilate, possono modificare la loro attività di blocco della trascrizione e del promotore.

FAMIGLIE GENICHE: Policomb → complessi proteici che mantengono lo stato di repressione della cromatina, intervengono nelle divisioni di destino cellulare durante lo sviluppo e il differenziamento cellulare. Questi proteici influiscono nell’espressione di altri geni importanti per lo sviluppo e il differenziamento, come i geni omeotici HOX che vengono repressi.

• Trithorax → mantengono l’espressione degli HOX.
• EZH1 → appartiene alla famiglia dei Policomb, è coinvolto nello sviluppo di alcuni tumori.

MODIFICAZIONI ISTONICHE: si studiano tramite la tecnica CHIP (Cromatine-Immunoprecipitazione).

• Bisogna lisare le cellule e frammentare la cromatina
• → si immunoprecipitano gli istoni con anticorpi anti-iston H3 oppure anti istina H4 → si attacca il DNA (legato agli istoni) → sequenziamento per vedere il gene che stavano regolando gli istoni.

EPIGENETICA: modificazioni fenotipiche ereditarie → conquiste molecolari. La identificazione di alcuni complessi che sono di repressione trascrizionale di modulazione trascrizionale hanno permesso di usare inibitori che interferiscono con proteine che rendono la cromatina anabile al dominio.

Nella LEUCEMIA: vi instaurano un complesso repressorio con HDAC e DNMT ed induce il DNA. Per la cura basta trovare un modo per permettere di risplorare la trascrizione dei geni e quindi portare un complesso attivatorio. Nella malattia c’è una traslocazione del gene PML e poi c’è il gene RAR (recettore per acido retinoico). Questi, traslocando formano il gene di fusione PMLRAR che recluta un complesso con HDAC. Vengono espressi i geni che servono a produrre globuli bianchi.

CONTINUA →

La terapia, è basata aggiungere acido retinoico per trasfosforilare il corepressore -

repressor in un complesso attivatorio con: HAT.

Ci sono farmaci che agiscono sulle modificazioni epigenetiche, come la -

gratuitica, che blocca - DNMT → non fa metilazione del: DNA.

Altri inibitori di interfacciarsi con l'epigenetica come l'acido valproico -

che inibisce la deacetilina: HDAC ed è usato per il trattamento di tumori.

25-OTTOBRE-2018

TRASCRIZIONE

Affinché la trascrizione di un gene avvenga negli eucarioti questo gene deve essere in una configurazione cromatinica accessibile. I promotori dei geni si possono trovare in due tipi di configurazione cromatinica: un gene inattivo con cromatina chiusa e un gene morto potenzialmente attivo con cromatina aperta, in persone attivare tutti i fattori di trascrizione generali che avviano la trascrizione.

FATTORI GENERALI:

i indicano con TFIEX sono generali perché sono in tutte le cellule dell'organismo. Rumo & Homaidalft RNA-pol di riconoscere siti promotori più avviare la trascrizione.

RNA-pol: ce ne sono di diversi tipi. La RNA-pol2 trascrive tutti i mRNA e la maggior parte degli RNA che contribuisce in trascrizione della cellula.

La RNA-pol1 è responsabile della trascrizione dei rRNA.

La RNA-pol3 trascrive i tRNA e altri rRNA.

La RNA-polimerasi è un complesso multiproteico e alcune subunità sono costituite da tutti i 3 tipi. Ha peso molecolare di 500 Kilodalton.

CTD:

La subunità maggiore della RNA-pol ha la dominia c-terminale che è sempre fosforilata, l'RNA-pol2 in attacco a fimina di trascrizione.

Quindi il CTD è la parte della proteina che funzion importante per la fasi della trascrizione, nella formulazione del complesso di inizio per la sintesi proteica.

L'RNA-pol deve trovare il PROMOTORE (sito di inizio della trascrizione), ma la regione a monte del punto di inizio può essere delle seq-multidentiche che regolirnno l'inizio di trascrizione uno di queste è il ENHANCER.

ENHANCER: Può trovarsi a monte del promotore ma anche del sito di inizio di trascrizione.

Poche centinaia di nucleotidi, primo ma anche a livello del sito di trascrizione è molto lontano dal sito di inizio. Favorise la trascrizione.

Poi si hanno andati altri seq che sono i SILENZIATORI e ISOLATORI che inibiscono sempre la trascrizione, legandosi a proteine.

PROMOTORE

È un insieme affinché la RNA-pol possa trascrivere i geni. È una sequenza:

• nucleotidica posta a monte e a valle del sito di trascrizione, generalmente a monte. È di circa 60 px di distanza rispetto al sito di inizio della trascrizione
• zona del sito di riconoscimento per la RNA-pol.

Negli eubatteri La freccia indica il sito di inizio con un +1 (tripletta AUG), in eubatterici si inizia con un mRNA.

DCE indica un elemento a livello della solidarizzazione gene a gene, ha un core (elemento al centro) caratterizzato da un auto effetto di sequenze.

DPE: elemento down promoter (down-stream) che è presente in alcuni promotori.

A questi due elementi (DCE e DPE) è lega il TFIID.

BRE: elemento di riconoscimento TFIIB

TATA: elemento ricco in TA, vi lega una proteina TBP (protein-binding-tata). La TBP regola l'attività RNA-pol ed è molto conservato.

SEQUENZE CONSENSUS

Sono sequenze nei promotori che sono conservate in promotori diversi:

Nello schema c'è un gene che deve essere trascritto ad opera del RNA-pol 2, ha bisogno di fattori generali di trascrizioni che devono legare le sequenze specifiche nelle forme del promotore, in modo tale che l'RNA-pol si sieda sul promotore e inizi a trascrivere mRNA:

* vi deve associarci il fattore di trascrizione D che è fatto dalla subunità TAF.

* Da TAF la 2 bromodomini - quindi lega dimini istominia e acetilata - > posizionare dove la RNA-pol deve trascrivere.

Se hanno la TBP, D, A, B. La B si lega al solco minore/maggiore di DNA ed altri:

fattori a valle e monte della TATA-box e fornire la superficie che viene riconoscuta dalla RNA-polimerasi.

RIASSUNTO

La TATA box (+1) inizio di trascrizione - > TBP legala TATA-box - > arriva il TFIID

che porta TAF e si associ alla TBP. Poi arriva TFII che recluta TFIIb che:

l'insieme di vari sog consinus nel DNA si avvicinano la RNA-pol al terminato:

C-terminale viene reclutato il alto fattore F, poi E e H e H fosforila la coda:

C-terminale della RNA-pol e forma il complesso di inizio (PIC) della:

RNA-polimerasi 2.

TFIIC si stacca dal promotore per iniziare la fase di allungamento della catena di RNA.

Poi c’è la FOSFORILAZIONE della coda del RNA-pol = distacco della RNA-pol 2 e il

complesso di inizio della trascrizione e quindi l’inizio della fase di allungamento. La

fase di allungamento inizia il rilascio di tutti i TFIIC, tranne la TBP.

Una volta che il promotore è stato rilasciato e i fattori di inizio sono stati rilasciati c’è

la fase di allungamento, il complesso di trascrizione è fatto di RNA-pol 2, TF11E e

TF11H (Fattori di allungamento e da kinasi che rimane ligati alle C-terminale 2 2

della RNA-pol.

ENHANCE contribuiscono a reclutare gli attivatori della trascrizione al sito di inizio.

Il numero di enhance può attivare la trascrizione sia da un terzo di celle, o multe

di enhance del promotore. Legame proteine che chisiamano coregulatori della trascri-

piumano con 1e l’aumentare dime alcune sono attivatori, altro repressori. Decidono o no il

della concentricità _gene se deve essere trascritto o no.

del fenotipo

ATTIVATORI: Fattori che legano elementi specifici del DNA

• attivatori che agiscono reclutando enzimi che sono rimodellatori della

cromatina (HAT e HDAC)

• Fattori architettonici che portano vicino reg di DNA

Quando si parla di fattori di trascrizione si parla di una proteina con un dominio car-

pace di legare il DNA e uno di attivazione del DNA

ENHANCERSOMA contollora il DNA e l’attivatore. Ogni gene ha il suo enhancesosoma.

Alcuni TFIIC quelli ‘generale’ sono obbligatori (presenti comunque), altri invece sono

specifici (testato grafico) come AP1.

ISOLATORI seq di DNA a cui ligano delle seq specifiche che sfattenuano l’azione

degli’ enhancer. L’isolatore potrebbe legare una proteina che blocca d’azione dell’enhancer sul successivo gene e quindi l’isolatore può spe-

gnere l’attività di un gene o selle, e quindi il gene e morte e

acceso.

MEDIATORI: complesso che fa parte del complesso di pre-inizio delle trascrizione. È

fatto di 30 subunità e un olomioma, può fatto di tutte subunità pro-

teichiche. Reclutato dai TFIIC in modo ch il mediatore interagisca nel

complesso di pre-inizio.

PR. ARCHITETTONICHE: controllano la struttura del DNA e vengono definite DNA-binding-protein da ri- piegano il DNA permettendo l’assemblaggio delle altre proteine che servono a trascrivere.

TPIIH: è quello che ha più subunità. Ha anche una attività elicasica che apre il nucleosoma e fosforila la C-terminale distacca delle proteina

HMG: sono DNA-bending-protein con peso molecolare molto basso e permettono l’avvicinamento di elementi lontani nella seq. di DNA e quindi anche il posizionamento dell’ enhancosoma, ad esempio.

Sono le high-mobility-group e hanno alta mobilità.

6 NOVEMBRE 2018

FTXX: hanno dominio che lega il DNA e un dominio di attivazione → legano seq specifica del DNA Nel promotore e negli enhancers dei geni ci sono seq consensus riconosciute da diversi FTXX.

GRE: una seq consensus (nel gene MT di un criceto) e un elemento di risposta a glucocorticoidi. → il recettore di glucocorticoidi ⋯ un fattore di trascrizione che lega nel fcolci glucocorticoidi, traslocano nel nucleo e vanno a riconosce seq nei promoters dove sono presenti le seq GRE.

Alcuni sono ubique sistemati, altri invece sono presenti solo in alcuni tipi cellulari (come nei geni evocatori).Possono formare dimeri o eterodimeri (come MYC e FOS che possono lavorare come omo e eterodimeri).

Regolazione: alcuni, dopo la nascita, non vengono più sintetizzati - la fosforilazione li attiva (come per le MAP-Kinasi)- la defosforilazione li attiva - il legame al ligando li attiva (come per P65)- il legame al partner giusto li attiva (miosina D)- in attivano se si staccano da una membrana.

(NFKB) P65: è un fattore di trascrizione dimero, inattivo quando legato a IKb.quando Ikb è ubiquitinato, P65 si attiva, trasloca nel nucleo e lega le seq. coi promoters di geni responsivi a NFKB.

STAT: è un fattore di trascrizione attivato dalle citochine → viene fosfori-lato e trasloca nel nucleo per promuove la trascrizione.Ci sono gli elica-giro-elica → proteini monomeriche con e monocammino, dispongono seq omeobox nei mammalia e sono important durante lo sviluppo.

CONTINUA →

- elica-ansa-elica: alla N-terminale hanno residui basici → legano DNA

oppure no → non legano il DNA

MUSINA: ha residui basici che le permettono di legati

il DNA solo se forma un omodimero con

un altro monomero D. Se si complessa con id

imerica perde la capacita di legari il DNA

MYC: attivo come monomero solo quando associato le Max

Comerion di lusine: leucine costruiscono il noncleidso'ropico.

AP1: complesso trascrizionale dei componenti Jun e Fos →

Fos funziona solo se legata a Jun

Ras-MAP-K: map-Kinasi attiva (TFIX) traslocano nel nucleo

dove attivano elementi unsproarivi che portano

alla fosinasione dj geni (MYC, Jun, Fos ecc) che,

noqpiano la mcltiplicazione mltellare

Dieta da brcca: alfaelica che lega il DNA, che interagisce cm reco medicato

due istidine nei. Fattori che si legano le seq continue sin 3 basi.

Ne appartenogno tutti i recettori attivati da l’eganda (recettori un

diversi ormani)

RAR: nelle leucemia acuta pumieliooticha a ha traslocazione di

RAR (recettore per la tetvonivina A) fattoie di trascrizione atiò

cio ne legato alla tetvonivina A

si prendono est di van recettori attivanti peo steroidi, progester

nome, hanno dominio che lega il DNA e un dominio di

attivazione traecizionale o di ldgoma all’orm()ne

(usiona delle di sobanità del recettore di gleocorticoio' ric:

mone sul DNA in elementi di inaplota _GRE