Biologia Molecolare e Biologia cellulare - Appunti

DNA.

Prendevano i fagi, li trattavano con proflavina e vedevano se erano in grado di sopravvivere: distribuiscono

batteri su una capsula di Petri mettendoli a contatto con i fagi. Nella piastra ci sono un certo numero di

placche di lisi date dall’attacco ai batteri (che muoiono).

C’erano mutazioni + e mutazioni -, se si combinavano si ottenevano mutanti doppi in grado di produrre

progenie fagica.

Una tripletta con la mutazione doppia cambia, ma a valle il senso del messaggio rimane. Se si combinano 3

mutazioni + o 3 - parte del messaggio rimane comunque.

Basandosi sull’osservazione che i fenotipi wild type venivano mantenuti in presenza dell’aggiunta o perdita

di 3 coppie di basi ma non di 2 o una base dedussero che i nucleotidi sono letti a gruppi di tre.

Molti dei tripli mutanti erano vitali, quindi delle 64 possibili triplette molte dovevano specificare per

amminoacidi.

Infine la disposizione delle triplette non è sovrapposta perché se il codice fosse sovrapposto una lettera

verrebbe letta 3 volte e quindi la modificazione per inserzione o selezione di un nucleotide non avrebbe

cambiato il significato di tutta la proteina a valle. Si cambiano 3 codoni ma a valle rimane uguale. Invece con

la lettura in sequenza l’avanzamento è sempre a 3 a 3 e quindi un’inserzione o selezione non di multipli di 3

cambia la cornice di lettura e quindi tutto il messaggio a valle. 49

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Si sapeva che per tradurre le proteine era importante l’RNA. Si potevano fare estratti acellulari da E. coli a

cui erano aggiunti aminoacidi radioattivi e misurando nell’estratto la radioattività cresceva (venivano

incorporati nelle proteine) mentre la quantità di mRNA calava. Se aggiungo RNA riottengo un picco di

produzione di proteine con lo stesso andamento.

Si descrisse il codice genetico tramite la capacità di sintetizzare omopolimeri di nucleotidi aggiungendoli

all’estratto acellulare in presenza di uno solo degli aminoacidi radiomarcati. Quando veniva incorporato si

dimostrava che l’omopolimero codificava per un certo aminoacido.

Le 64 triplette sono tutte codificanti tranne 3 non senso: UAA, UGA, UAG.

Tutte le altre sono sensate, alcune corrispondono a un amminoacido solo (Metionina AUG, triptofano UGG).

I codoni con lo stesso significato sono detti codoni sinonimi.

In situazioni particolari nel messaggero a valle del codone UGA si forma una struttura secondaria detta secis

che fa sì che il codone venga usato come se fosse un codone senso per far inserire la selenocisteina o la

pirrolisina. Per questo si può dire che gli amminoacidi sono 22 e non 20.

Le proprietà del codice genetico:

1. A triplette

2. Degenerato (più codoni specificano per lo stesso aminoacido)

3. Non sovrapposto

4. Privo di interpunzione

5. Non ambiguo (ciascun codone ha un solo significato, ovvero codifica per un solo amminoacido)

6. Universale (con qualche eccezione ad esempio il DNA mitocondriale)

La degenerazione non è indice di malfunzionamento, è utile perché se non fosse degenerato avremmo solo

20 triplette senso e 44 non senso che interrompono la traduzione. Molte mutazioni nelle sequenze codificanti

produrrebbero una di queste 44 triplette non senso e quindi le mutazioni causerebbero frequentemente una

troncatura della proteina. Tutta la struttura del codice genetico risponde all’esigenza di minimizzare l’effetto

deleterio delle mutazioni.

Molte sostituzioni cambiano l’amminoacido in uno simile per funzioni: la proteina può non venire disattivata

ma solo cambiare minimamente.

Gli amminoacidi codificati da due triplette alla terza base presentano o l’una o l’altra pirimidina/purina,

siccome è più frequente il passaggio per mutazione fra purina e purina o pirimidina e pirimidina. Questo

minimizza l’effetto delle mutazioni più frequenti.

L’ipotesi del tentennamento wobble formulata nel 1966 da Francis Crick per spiegare:

- L’esistenza di soli 48 tRNA nell’uomo (31 in E. coli) rispetto alle 61 possibili triplette senso

- Il fatto che la maggio parte delle degenerazioni coinvolge la terza base del codone

Essa stabilisce che la base all'estremità 5’ dell'anticodone non subisce restrizioni spaziali come le altre due il

che le permette di formare legami a idrogeno con diverse delle possibili basi posizionate all’estremità 3’ del

codone (non tutte le combinazioni sono però possibili).

La base che bacilla è la terza del codone che corrisponde alla prima dell’anticodone. La tripletta AGA e la

AGC possono essere riconosciute dallo stesso tRNA.

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Sintesi proteica

Fase ATP-dipendente: attivazione degli amminoacidi.

• Fase GTP-dipendente

•

L’attivazione consiste nel legame di ciascun amminoacido al corrispondente transfer RNA (caricamento dei

tRNA). È una reazione di acilazione fra il terminale carbossilico dell’amminoacido e il gruppo ossidrile

2’OH o 3’OH dell’adenosina terminale dello stelo accettore del tRNA.

Il legame acilico che si forma è ad alta energia e ha due funzioni:

1. Rende possibile il riconoscimento delìaminoacido da parte del codone dell’mRNA

2. Porta l’amminoacido ad un livello energetico tale per cui la formazione del legame peptidico è un

processo spontaneo

Se c’è un errore nella fase di attivazione ATP-dipendente, poi la traduzione sarà sbagliata. L’attivazione

avviene sempre con 2 reazioni accoppiate:

- Adenililazione: l’amminoacido viene legato all’adenosina monofosfato, si rompe il legame fra il fosfato

alfa e il beta e si forma l’amminoacil-adenilato. La rottura del legame anidridi fornisce l’energia

necessario e rimane il legame estereo ad alta energia

- Caricamento del tRNA: l’amminoacido viene trasferito dall’adenililato al tRNA. Il carbossile

dell’amminoacido reagisce con un dei due gruppi OH del terminale 3’ del tRNA. Si forma quindi

l’aminoacil-tRNA e si libera AMP.

Queste reazioni sono catalizzati da 20 enzimi detti amminoacil-tRNA sintetasi. Riconoscono 3 molecole:

Aminoacido specifico

• tRNA specifico

• ATP

•

Questi enzimi sono molto diversi in base all’amminoacido e sono molto specifici. Ci sono meno tRNA

rispetto alle triplette senso.

Esiste una sola aminoacil tRNA sintetasi per ogni amminoacido. Il riconoscimento dei tRNA isoaccettori

(cioè che recano lo stesso amminoacido) NON può quindi avvenire esclusivamente attraverso l’anticodone.

L’insieme dei determinanti che permettono alle sintetasi di discriminare i tRNA viene talvolta definito come

secondo codice genetico.

Le aminoacil tRNA sintetasi riconoscono altre regioni del tRNA specifiche e uguali in tutti i tRNA

isoaccettori.

Gli enzimi sono anche in grado di fare attività di correzione. Gli amminoacidi sono diversi, ma alcuni sono

molto simili. A volte potrebbe sbagliare, quindi c’è un meccanismo di controllo di qualità interno in un sito

di correzione in cui se l’amminoacido è quello sbagliato viene idrolizzato.

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Il sistema di sintesi delle proteine

• Portatore dell’informazione: mRNA

Macchinario: ribosomi (subunità maggiore e minore), fattori di inizio (IF nei procarioti e eIF negli

• eucarioti), fattori di allungamento, fattori di terminazione. Nei procarioti i fattori di inizio sono IF1-IF2-

IF3.

Reagenti: amminoacidi, ATP, tRNA, amminoacil-tRNA sintetasi → aminoacil-tRNA e GTP

•

La sintesi avviene in 3 fasi:

- Inizio: il punto di inizio è sempre un codone che specifica per la metionina, ATG. La prima tripletta viene

seguita dai successivi nucleotidi.

- Allungamento: il ribosoma percorre la rgione codificante del trascritto sintetizzando la proteina

- Terminazione: incontra un fattore di stop, vengono rilasciate le subunità che potranno poi riassemblarsi

Ciclo ribosomiale: la subunità minore si associa al messaggero e al tRNA iniziatore, si assembla l’unità

maggiore e poi inizia l’allungamento in cui tRNA entrano nel ribosoma, la catena in sintesi viene trasferita

da un tRNA al successivo. Il ribosoma avanza di una tripletta, entra un nuovo tRNA. Al codone di stop

nessun tRNA può appaiarsi, si associano dei fattori di rilascio che fanno staccare la catena polipeptidi e le

subunità.

Procarioti: è necessario che le subunità ribosomali riconoscano l’mRNA e che l’inizio sia corretto.

Adiacente all’AUG d’inizio c’è una sequenza conservata (di Shine Dalgarno) che trova una

complementarietà di basi con l’rRNA 16S della subunità minore del ribosoma. Il ribosoma si posiziona

quindi in modo che l’AUG d’inizio sia nel sito P della subunità minore. P sta per peptidico. Il sito A è il sito

amminoacidico. 51

Ribosoma:

Sito P

• Sito A

• Sito E: sito di uscita dei tRNA scarichi dell’amminoacido già

• aggiunto alla catena

Tunnel da cui esce la catena polipeptidi nascente

• Canale di passaggio dell’mRNA

• Centro di decodificazione: si posiziona lì la tripletta che deve

• essere letta

Centro della peptidiltransferasi, dove avviene la formazione del

• legame peptidico.

Il primo tRNA è l’unico in grado di entrare nel sito P, tutti gli altri

vanno nel sito A.

Fase di inizio: subunità 30S con emissivi P ed A associata a IF1 e IF3 che la mantengono non complessata in

un ribosoma.

IF3: impedisce il legame prematuro alla subunità 50S

IF1: impedisce il legame del tRNA al sito A

La sequenza di Shine Dalgarno fa posizionare la sequenza AUG nel sito P dove deve arrivare il primo

amminoacil-tRNA (ha piccole differenze di sequenze rispetto a uno normale). La prima metionina nei batteri

è diversa da tutte le altri ed è detto N-formilmetionina (il gruppo amminico è formilato). Le differenze del

tRNA iniziatore permette la formilazione della metionina e il legame al sito P.

Negli eucarioti invece la metionina iniziale non è modificata, ma il tRNA iniziatore è sempre diverso da

quello che porta la metionina interna.

Entra IF2 che aiuta l’ingresso del formi-tRNA nel ribosoma. Quando si associa al GTP e al tRNA iniziatore

favorisce l’ingresso nel sito P del tRNA.

La subunità maggiore 50S si completa, IF2 idrolizza il fosfato e diventa legato al GDP, quindi perde affinità

per il tRNA e si stacca.

Negli eucarioti ci sono molti più fattori di inizio. La differenza importante è che mentre nei procarioti il

ribosoma si lega a una sequenza interna, negli eucarioti lega sempre il cap e poi scorre in direzione 5’—> 3’

finchè localizza il codone di inizio. Al momento dell’estremità 5&