Biologia molecolare prof.re Di Cunto

IBRIDAZIONE IN SITU

 Questa metodica si basa sull'ibridazione di sonde di cRNA marcate direttamente su cellule o tessuti. Si

può ibridare su sezioni istologiche o su materiale non sezionato (in quest'ultimo caso si parla whole-

mount).

 È l'unica tecnica che permette di localizzare l'espressione di un dato mRNÀ a livello delle singole cellule.

 Ideale per studiare i geni espressi in un gruppo ristretto di cellule all'interno di un tessuto, o i geni la cui

espressione è modulata nel tempo e nello spazio (estremamente utilizzata negli studi di biologia dello

sviluppo).

È importante anche conoscere la localizzazione spaziale degli mRNA. Non sempre si misura l'espressione di

cells in coltura. Possiamo misura l'espressione di un gene in un intero organo. Nel fegato ci sono gli epatoci-

ti, le cellule dei vasi sanguigni, dei dotti biliari, ecc... Non è detto che tutte le regioni di un organo si compor-

tino allo stesso modo. Sapere quale cellula esprime un certo mRNA e quale cellula ne esprime di più e quale

di meno è estremamente importante.

Tutto questo si può analizzare con la tecnica che si chiama ibridazione in situ. Tecnica che abbiamo visto

per quanto riguardo il DNA. Ad esempio posso localizzare la posizione di un gene su un cromosoma andan-

do ad eseguire un'ibridazione in situ, lasciando il DNA dove si trova (vedi lezione della mappatura del ge-

noma umano). Posso fare questo anche per l'RNA per capire quali cells esprimono un certo RNA.

Anche in questo caso si tratta di una metodica di ibridazione tradizionale quindi la sonda è marcata ed è in

soluzione. Le sonde che si usano in questo caso sono di RNA complementare all'mRNA, quindi si tratta di

cRNA. Come si costruiscono queste sonde? 85

Vogliamo ad esempio studiare l'espressione del gene della beta-globina: ho bisogno di un plasmide in cui sia

stato clonato il cDNA della beta-globina. Nel plasmide c'è un promotore per una RNA polimerasi virale (tut-

to ciò avviene in vitro). Sto trascrivendo una molecola a doppio filamento. L'RNA polimerasi virale produce

una molecola di RNA (a singolo filamento) antisenso che sarà complementare all'mRNA (se la trascrizione

partisse dall'altro lato, cioè dal 5' invece che dal 3', otterrei una molecola di RNA senso, identica a quella

dell'mRNA). Se eseguo la reazione su un plasmide intero, come in questo caso, si può arrestare la RNA poli-

merasi virale grazie a dei segnali di terminazione oppure taglio il plasmide con EcoRI (e la polimerasi si fer-

merà per forza). Ottengo tante molecole di cRNA, che vengono sfruttate per un'ibridazione in situ.

Queste molecole sono complementari all'mRNA perché sono state prodotte in direzione antisenso. Come le

uso?

Problema: trattamento del tessuto. Per preparare delle sezioni istologiche, prendo un tessuto, lo fisso con

la formaldeide che uccide le cellule ma conserva le molecole biologiche e l'RNA. Poi il tessuto viene prepa-

rato per poter essere affettato in fettine sottilissime. Le cellule vengono permeabilizzate e possono essere

ibridizzate con la sonda. Le fettine sui vetrini sono un supporto solido, nelle cellule ci sono le molecole di

mRNA che possono così legare le sonde complementari. Questa tecnica non è tanto diversa dal Southern o

dal Northern Blot, si fa una pre-ibridazione, un'ibridazione, dei lavaggi (qui è più complicato perchè l'RNA è

molto appiccicoso quindi bisogna essere molto accurati nei lavaggi).

Essendo la sonda marcata (con radioattività o fluorescenza), alla fine dei lavaggi misuriamo il segnale.

Esempio (figura): sezione ibridizzata con una sonda radioattiva, dopo l'ibridazione e i lavaggi, la fettina vie-

ne trattata con un'emulsione fotografica.

Nell'emulsione fotografica se ci sono delle molecole radioattive, queste provocano lo sviluppo di granuli

d'argento. L'immagine è fatta con microscopia in campo oscuro, in questo caso la luce arriva lateralmente e

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l'obiettivo sta su. Il fascio di luce arriva a 90° rispetto all'obiettivo (invece di solito il microscopio illumina il

campione da sotto). La luce raggiunge l'obiettivo solo se viene riflessa dal campione, dai granuli d'argento,

che corrispondono all'espressione del gene perché la sonda si è legata solo in alcune regioni dell'embrione.

In questo caso il gene è espresso a strisce, abbiamo un pattern spaziale. Questo è un dettaglio che mi per-

dere facendo un "frullatino" dell'embrione con il Northern Blot; non sapremmo che il gene è espresso a

strisce.

Altro esempio: sezione di cervello embrionale, il segnale dell'espressione di un gene è in rosa (sempre gra-

nuli d'argento). Questa è la corteccia cerebrale che si sta sviluppando; so già che negli strati più profondi ci

sono cellule che proliferano, mentre negli strati più superficiali ci sono cellule che si differenziano in neuro-

ni. Vedo che il gene è più espresso nelle cellule che stanno proliferando.

Infine terza figura: in questo caso è stata usata la digossigenina e osservo il mesencefalo. Il gene è espresso

nel mesencefalo ma non nella parte dorsale sulla linea mediana. Espressione molto precisa dal punto di vi-

sta spaziale, infatti questa tecnica è usatissima in biologia dello sviluppo.

Una variante dell'ibridazione in situ è la Whole Mount. In questo caso i tessuti non sono stati affettati. In

figura abbiamo un intero embrione di topo e un intero embrione di Drosophila. Il tracciante per marcare le

molecole di RNA non è radioattivo; addirittura in Drosophila sono state usate due sonde (una marcata con

un tracciante che da colore blu e l'altra con tracciante che da colore marrone) sono due diversi enzimi che

sono stati attaccati alle molecole di RNA. In questo caso non vediamo solo che i geni sono espressi a strisce,

ma a strisce mutuamente esclusive, dove è espresso un gene, non si esprime l'altro e viceversa. È un detta-

glio che poteva sfuggire usando una singola sonda.

Nell'altra figura il segnale è blu (dove è blu c'è espressione del gene). Se non avessi fatto l'ibridazione in si-

tu, l'embrione sarebbe tutto bianco, invece il blu mi dà una mappa spaziale di espressione genica in questo

stadio dello sviluppo embrionale. Il gene è espresso nell'occhio; nel cervello dove ci sono zone di maggiore

o minore espressione; negli abbozzi degli arti, il midollo spinale. ecc).

Non so esattamente in quali cellule c'è espressione, si vedrebbe meglio nelle sezioni. Queste metodiche

possono essere utilizzate per studiare anche la localizzazione subcellulare degli mRNA; posso capire in una

cellula dove si trova l'mRNA. ARRAYS DI ACIDI NUCLEICI

Misurazione di più geni contemporaneamente (e non di un gene singolo).

Come mai è importante?

Il cancro è provocato da mutazioni. I tumori asportati in fase precoce vengono analizzati dall'anatomopato-

logo che fissa il materiale, lo include in paraffina, fa delle fettine e le osserva al microscopio per capire che

tipo di tumore è (maligno o invasivo o benigno, ecc). Se il tumore ha perso la specializzazione è molto mali-

gno. Possiamo prevedere, in fase precoce, se metastatizza o no? Una decisione che deve affrontare il medi-

co è capire se basta l'intervento chirurgico o se serva anche chemio/radioterapia.

Per far ciò si studia la diffusione del tumore (di solito oltre al tumore vengono asportati anche i linfonodi

per capire se c'è stata diffusione o meno nei linfonodi); come si fa a capire se c'è progressione o meno? Di-

pende dal corredo dei geni espressi.

Si osserva se c'è perdita della differenziazione cellulare, perdita di contatto con la membrana basale, quan-

tità di vasi richiamati, la capacità che le cells mostrano di invadere i vasi sanguigni, il numero di mitosi, anti-

geni espressi da cellule che si stanno dividendo che ci permettono di capire qual è la frazione di cellule pro-

liferanti, ecc. 87

Tuttavia non basta la morfologia perché ci sono dei tumori che non vengono trattati nel modo appropriato;

ci sono tumori che non erano così maligni che vengono trattati con una terapia molto pesante (cosa che

non vogliamo). Altro problema: ci sono alcuni tumori considerati di basso grado (poco invasivi) che in realtà

metastatizzano.

Domanda posta ai biologi molecolari, visto che il comportamento delle cells dipende dai geni che esprimo-

no, non ci potete dare uno strumento che ci consenta di essere più accurati (ed il trattamento adeguato)?

Si scatenò in un primo momento una caccia al gene del cancro; vado a cercare i geni la cui mutazione o

espressione correlano con la gravità e il fenotipo canceroso. Si trovavano ogni tanto geni over espressi in

tumori più maligni (marcatori). Quindi, una volta individuato un gene, si misurava l'espressione e si cercava

di capire quanto questa correlasse con il comportamento del tumore. Guardando singoli geni, era meglio la

valutazione del patologo.

Questo dipende dall'importanza della visione globale; il fenotipi canceroso dipende dal funzionamento di

tanti geni simultaneamente, ognuno dei quali correla con il fenomeno ma non è determinante di per sé. È

estremamente importante, per l'espressione genica, riuscire ad avere una visione globale. 88

14.12.15 Arrays di acidi nucleici

Come facciamo a misura simultaneamente l'espressione di tutti i geni di una cell?

Si può invertire la logica dell'ibridazione, usando un'ibri-

dazione inversa: possiamo far sì che la nostra sia non-

marcata e legata su un supporto solido. Per mezzo di

una sonda marcata, possiamo andare a catturare e isola-

re delle molecole all'interno di una popolazione com-

plessa di mRNA, o di molecole di DNA.

Il bello è che è un approccio altamente parallelizzabile. Possiamo usare diverse sonde; è la base che sta die-

tro agli array di acidi nucleici.

L'ibridazione inversa ci offre quindi la possibilità di fare misure in parallelo.

Un array non è nient'altro che una matrice di sonde.

Ho un supporto solido e la possibilità di immobilizzare su di esso delle molecole di DNA note.

A1 per esempio corrisponde al gene alfa. Il gene è predeterminato.

La matrice costituisce la sonda con cui si va ad interrogare la popolazione di molecole (il target che voglio

andare a misurare).

Devo marcare il target per far funzionare il sistema.

Per marcare il target posso fare in diversi modi. Per

l'mRNA il modo più facile è marcare direttamente il

cDNA. Per mezzo di trascrittasi inversa e nucleotidi

marcati, posso produrre un cDNA che sarà marcato;

le molecole di cDNA