Biologia molecolare prof.re Di Cunto

Medicina personalizzata

La medicina personalizzata è medicina basata sulle analisi delle caratteristiche genetiche dell'individuo. Allineando diverse sequenze genomiche troviamo in media 1 differenza di basi ogni 1.000, anche allineando le sequenze degli autosomi ereditati dal padre e dalla madre. Siamo il prodotto di un programma genetico che deriva dalla combinazione di questi due genomi oltre che dall'interazione con l'ambiente. Differenze che dipendono dal DNA: statura, colore della pelle/capelli, predisposizione a malattie.

Influenza genetica e farmaci

Francis Collins (direttore del consorzio pubblico che ha sequenziato il genoma umano) ha detto "tutte le malattie, con l'eccezione forse dei traumi, ha una base genetica": ciò non riguarda solo il fatto di sviluppare o non sviluppare certe malattie, perché ci sono ad esempio degli individui che sono più suscettibili allo sviluppo di tumori e spesso ne è stata definita la base genetica. Questo riguarda anche l'interazione tra il nostro organismo e i farmaci. La maggior parte dei farmaci che usiamo sono veleni somministrati ad una dose tale da avere effetti benefici. Tuttavia, per alcuni pazienti questi farmaci possono dare intolleranza e anche questo dipende dalla base genetica.

Obiettivi della medicina personalizzata

Gli obiettivi della medicina personalizzata includono la lettura della sequenza genomica, l'individuazione delle differenze e, partendo da queste, capire a quali malattie le persone sono più predisposte (quindi quali screening si dovranno fare). Inoltre, si cerca di determinare se si può dare o meno un determinato farmaco ad un paziente. Una differenza ogni 1.000 basi comporta 3 milioni di differenze sull'intero genoma (composto da 3 miliardi di basi totali). La maggior parte di queste differenze non hanno rilevanza; la difficoltà sta nel capire quali hanno rilevanza e quali no: si può fare solo per mezzo della bioinformatica, strettamente correlata alla biologia molecolare, perché per studiare una molecola, si studiano ed elaborano informazioni che devono essere filtrate e si può fare solo usando algoritmi matematici molto potenti.

Dobbiamo essere in grado di leggere la sequenza genomica e analizzarla. Per far ciò dobbiamo saper isolare e sequenziare tratti della sequenza genomica o sequenziare tutto o la parte più importante del genoma.

Organismi geneticamente modificati (OGM)

OGM: organismi geneticamente modificati. È "differente" dalla versione naturale. Oggi possiamo decidere che modifiche fare (prima si selezionavano delle caratteristiche e basta). Leggo col sequenziatore la sequenza delle basi, immagino che un determinato gene possa essere modificato in modo più conveniente e progetto una sequenza che potrebbe essere più conveniente per quel gene (è una modifica diretta, a differenza della semplice selezione che si faceva prima degli OGM). Ciò si può applicare anche ad animali e all'uomo (recentemente un gruppo cinese ha modificato geneticamente embrioni umani, usando tecnologie di ultima generazione; hanno modificato embrioni triploidi che quindi non potevano svilupparsi come esseri umani per introdurre molecole di interesse).

Etica e modificazioni genetiche

Oggi la frontiera/il limite delle modificazioni del genoma umano non è la tecnica bensì l'etica (anche se ci possono essere degli effetti collaterali). Ad esempio, topi verdi: topi ingegnerizzati, transgenici, nel cui genoma è stato inserito un gene di una proteina derivante da una medusa (GFP-green fluorescence protein) molto usata per tracciare molecole e cellule. Utile per studi in vivo ad esempio per studiare come le cellule tumorali colonizzano un organismo. La tecnica alla base sia dei topi verdi che delle piante OGM è la stessa e si basa su alcuni dei meccanismi fondamentali che la bio molecolare ha da sempre studiato.

Utilizzi delle tecniche genetiche

Altri utilizzi di queste tecniche: produrre proteine ("proteine ricombinanti" poiché prodotte da DNA ricombinante) a livello industriale grazie a modifiche di genomi batterici o di piante e animali (es. insulina prodotta da batteri).

Ingegneria genetica e tecniche del DNA ricombinante

Oggetto principale del corso: Ingegneria genetica e tecniche del DNA ricombinante. Come singole tecniche possono essere messe insieme per rispondere a domande più complesse. Comprendere un meccanismo molecolare richiede l'utilizzo di più tecniche, assemblandole.

Fondamenti della biologia molecolare

Definizione di gene

Mendel diede la prima definizione di gene = fattore in grado di determinare alcuni caratteri discreti ereditari (fenotipi). Aveva intuito che alcune caratteristiche degli organismi viventi dipendevano da delle unità di informazione che si trasmettevano in maniera discreta da genitore a figlio. Questi fattori potevano determinare dei fenotipi. Fu introdotta per la prima volta una visione quantitativa della biologia: Mendel infatti trovò delle leggi precise e quantitative.

Teorie di Darwin e Lamarck

Darwin elaborò le leggi di Mendel e intuì che queste informazioni (geni) trasmesse da una generazione all'altra possono cambiare, proprio durante la trasmissione, quindi l'informazione non è immutabile e sulla base di questi cambiamenti avviene l'evoluzione delle specie. Secondo Darwin le specie moderne originano da specie più antiche attraverso due forze fondamentali:

• Il cambiamento casuale delle informazioni a causa di mutazioni;
• La selezione di questi cambiamenti da parte dell'ambiente.

Non tutti i cambiamenti sono favorevoli, ad esempio malattie genetiche. Altri cambiamenti possono essere invece favorevoli. Il vantaggio o svantaggio del cambiamento dipende anche dalle circostanze, ad esempio emoglobinopatie. In alcune zone geografiche c'è un'altissima incidenza di talassemia. I soggetti non curati non arrivano all'età riproduttiva, ma l'incidenza è alta perché l'ambiente è sfavorevole all'emoglobina sana a causa della presenza delle zanzare della malaria. Nella talassemia due copie mutate del gene dell'alfa- e beta-globina portano alla malattia e alla morte, ma i soggetti eterozigoti hanno un vantaggio selettivo ma solo nelle zone malariche.

Bisogna distinguere tra variante normale e variante patologica, cioè tra un semplice polimorfismo e un cambiamento che ha un effetto. Secondo Lamarck le informazioni non cambiano a caso, ma lo fanno perché c'è un'interazione con l'ambiente (l'ambiente non ha solo ruolo selettivo), nascita dell'epigenetica.

Concetto dell'intelligent design

Concetto dell'intelligent design, cioè la progettazione intelligente degli organismi viventi o creazionismo. Secondo i creazionisti ci sono più origini della vita, invece di derivare tutti da un'unica cellula ancestrale. Corollario delle teorie di Darwin: se andiamo a vedere le diverse specie, potremmo tracciare un albero della vita. Si è visto che molte specie in realtà hanno antenati in comune. Se guardo le somiglianze molecolari tra questi organismi, l’ipotesi più economica è che derivino da un’unica cell ancestrale.

Ipotesi alternative

Ipotesi alternativa: ci sono più origini della vita. Ad esempio, l'occhio umano e quello della Drosophila sono perfettamente funzionanti per quanto diversi, ciò che hanno in comune è che sia l'uomo che la Drosophila possono nascere senza occhi a causa di malattie, portate da geni che possono essere rintracciati. Posso sequenziare questi geni e queste proteine e confrontarne le sequenze. Se confronto il gene eyeless e la proteina codificata di Drosophila con la proteina Pax6 dell'uomo (codificata dal gene responsabile della malattia genetica) noto che sono quasi identiche, processo di evoluzione divergente di Darwin = la natura non butta mai via niente ma diversifica.

Teoria di Darwin e bioinformatica

Ciò fa capire anche quanto la teoria di Darwin sia importante per la bioinformatica poiché essa (con gli algoritmi) cerca somiglianze sulla base del confronto di sequenze e delle relazioni di proteine che sono il prodotto di un'evoluzione divergente e per questo conservano la loro funzione.

Teoria cromosomica dell'ereditarietà

Scoprire i geni nel DNA

Finora abbiamo trattato i geni come entità astratte, ma come si è arrivati a dire che i geni fossero fatti di DNA? Teoria cromosomica dell'eredità sviluppata da Boveri e Sutton: osservando le cellule si trovarono questi oggetti (i cromosomi). In divisione questi corpi si dividono in maniera più o meno uguale, ma non era ancora ovvio che i cromosomi contenessero l'informazione genetica. Videro che erano costituiti da DNA e proteine e ipotizzarono, erroneamente, che le proteine fossero depositarie dell'informazione genetica poiché queste, essendo complesse, dovevano essere codificate da un alfabeto più complesso come quello delle proteine (20 lettere invece che le 4 degli acidi nucleici).

Si arrivò a capire che il depositario dell'informazione genetica fosse il DNA grazie ad alcuni esperimenti su organismi che apparentemente non c'entravano niente con i mammiferi: batteri e virus. Non c'era garanzia del fatto che le scoperte fatte, attraverso questi esperimenti, valessero anche per l'uomo, se non la nostra somiglianza molecolare.

Esperimenti chiave nella genetica

Vennero usati come organismi modello degli organismi molto semplici (la cui coltura in laboratorio è molto più semplice rispetto alla coltura in vitro di cellule umane), solo sulla base della presenza di DNA e proteine sia nel genoma dell'uomo, che in quello di virus e batteri. Havery e Chase Esperimento di Havery, Havery fu il primo a dire che il DNA conteneva l'informazione genetica. Studiava lo pneumococco ed identificò due fenotipi: un ceppo formava una colonia piccola rugosa e l'altro una colonia grande liscia, per cui la patogenicità era diversa: - colonia rugosa topo muore; - colonia liscia il topo vive. Dai batteri patogeni posso prendere "qualcosa" che riesce a trasformare quelli non patogeni. Individuò grazie al suo esperimento che l'elemento trasformante era il DNA. Questo elemento poteva passare da un batterio all'altro. È il concetto della trasformazione.

Chase e batteriofagi

L’esperimento di Chase con i batteriofagi e i virus, fu la prova formale più forte e assoluta: marcando un tipo di virus nelle proteine e un altro virus nel DNA, ci accorgiamo che l'informazione genetica (responsabile del fatto che il virus riesca a replicarsi) non viene trasmessa insieme alle proteine, bensì con il DNA. Questi batteriofagi attualmente sono usati molto in ingegneria genetica. Il DNA è la base, il collante, di tutti gli organismi.

Modelli sperimentali

Per capire fenomeni biologici è necessario avere un modello, sia per motivi etici che di difficoltà (sarebbe troppo difficile farlo sull'uomo, troppo complesso). Il modello sperimentale quindi non può essere l'uomo ma deve essere individuato il modello migliore per quel particolare studio e quella caratteristica (Premi Nobel attribuiti a chi ha individuato modelli) e nello stesso tempo dev'essere "facile". Una volta che si è definito un meccanismo modello è molto più facile andare a confrontare nell’uomo (prima controllo sequenze poi confronto). Se faccio esprimere il gene eye nella zampa, si formerà un occhio nella zampa.

Robert Koch e la batteriologia

Un altro dei padri della biologia molecolare è Robert Koch (padre soprattutto della batteriologia) la cui rivoluzione fu quella di aver ideato un modo per separare i batteri, creare popolazioni pure di batteri. Voleva riuscire a isolare i batteri causa di una certa patologia. Ma come si fa a isolare i batteri? Non c’erano ancora gli Ab. Ho un paziente infetto da una certa patologia (es. polmonite), so che il responsabile è un batterio che però è in mezzo a migliaia di altri batteri innocui e non patogeni, come fare a caratterizzarli?

Metodo di Koch

Un batterio non lo vedo ma se prendo tutti i discendenti di un unico batterio e riesco a metterli nello stesso posto, riesco. Le colonie date dal batterio A saranno diverse da quelle date dal batterio B. Definizione di clone: insieme di organismi geneticamente identici derivati da un unico organismo iniziale. Invece di usare un liquido Koch usò un budino (gel, materiale semisolido), un materiale con una consistenza tale da non sciogliersi (si formano maglie di polimeri e buchi dove l'acqua viene relegata). La popolazione di batteri si allargava ma rimaneva nel punto dove c'era il primo batterio. Si forma una popolazione clonale con individui verosimilmente identici tra loro e identici al primo batterio posto in quel punto del mezzo.

Riuscì così a separare popolazione di batteri con fenotipi diversi: es. colonia liscia/gialla/rugosa ecc, poi ne prendo una alla volta e le inietto nel topo e vedo quale è patogena.

Coltura di virus

Per i virus (es. batteriofago lambda molto usato) invece la coltura deve essere diversa, il virus ha bisogno di un batterio da infettare per riprodursi. Quindi, se prendo i virus e li piastro su una piastra come quelle di Koch, non succede nulla. Il terreno, in questo caso, deve essere fatto di un’unica specie batterica suscettibile. Se il mezzo fosse liquido, i virus potrebbero andare in giro e infettare qualunque batterio in qualunque punto della coltura. Invece nel budino non possono e quindi infettano solo i batteri vicini. C'è un'ondata di lisi dei batteri e sulla piastra da una superficie opaca si passa ad una traslucida e posso vedere dove i batteri sono stati uccisi ottengo i cloni di virus. Accorgimento: non devo seminare troppi batteri sulla piastra perché le colonie si confonderebbero e non sarebbero ben distinte.

Elettroforesi

L'analisi di proteine ed acidi nucleici, spesso richiede l'uso di gel (es. agarosio). Quello che caratterizza questi gel è la concentrazione del polimero. In base a questa caratteristica avremo maglie più o meno grandi.

Principio dell'elettroforesi

Elettroforesi è uno strumento di analisi molecolare usato per il DNA e per le proteine in gel. Il principio generale è avere particelle cariche che si muovono in un campo elettrico. La carica delle proteine, come del DNA, dipende da diversi fattori:

• Dalle proprietà di quella macromolecola (residui R nelle proteine e gruppi fosfato carichi negativamente nel DNA);
• Dal pH (se mettiamo una proteina a pH acido (ad esempio pH=3) succederà che avendo tanti cationi liberi, i carbossili saranno protonati quindi la proteina avrà una carica positiva, a pH alcalino invece sarà carica negativamente);
• Dalla forza ionica; se per es. aumento la concentrazione degli ioni Na nella soluzione, questi tenderanno a neutralizzare la carica elettrica.

Per analizzare il DNA si utilizza un pH alcalino (intorno a 8, quindi basico), a cui il DNA sarà carico negativamente e sarà stabile (a pH acido invece tende a degradarsi). Il DNA così caricato verrà inserito nel gel e messo in un campo elettrico: la molecola di DNA si muoverà dal polo negativo a quello positivo.

Fattori che influenzano la velocità di migrazione

La velocità di migrazione dipende da:

• Dimensione della molecola (n° delle basi);
• Dalla concentrazione del gel (più sono strette le maglie del gel, più sarà lento il movimento);
• Molecole più piccole saranno più veloci perché tendono ad essere ostacolate di meno.

Di solito il gel usato è gel di agarosio (se c'è bisogno di una risoluzione maggiore gel di acrilammide). Per rendere visibile il DNA lo si colora con dei coloranti fluorescenti (bromuro di etidio) che si intercalano tra le basi e sono visibili alla luce ultravioletta. Altro fattore importante è la forma della molecola. La conformazione di una proteina nativa è diversa da una proteina denaturata con un detergente per esempio.

Il DNA ottenuto dalle cellule non ha un forma lineare, neanche quando parliamo dei plasmidi. Questi sono molecole circolari, estratte dalle cellule che nel batterio assumono una forma distesa o una forma aggrovigliata (supercoiling), causata da enzimi che compattano il DNA anche nei batteri (come la cromatina per gli eucarioti). Riducono così lo spazio introducendo torsioni nell'elica del DNA. La forma ha una grande influenza sulla velocità della molecola; una forma che occupa più spazio sarà più lenta. Una forma lineare sarà più lenta di entrambe perché, non essendo il gel un canale dritto, sbatterà in tutte le posizioni del polimero. In base alla forma, al peso molecolare, al potere risolutivo del gel, a fine corsa, vedremo formarsi delle bande colorate che stanno a significare il numero di molecole tutte con la stessa velocità che sono migrate insieme.

L'elettroforesi è solitamente usata come strumento analitico per separare molecole con caratteristiche diverse. Di solito si cerca di separare molecole con peso molecolare differente ma può essere usata anche per separare molecole in base a criteri diversi come la forma o la carica o altre proprietà ancora. Il potere di separazione (potere risolutivo) di un gel varia a seconda delle maglie di quel tipo di gel, alcuni sono così potenti da poter separare uguali molecole di DNA con solo una base differente.

Sequenziamento del DNA

Scoperta della struttura del DNA

La scoperta della struttura del DNA è stata la seconda pietra miliare, dopo la scoperta che fosse il DNA e non le proteine a contenere le informazioni. Con la scoperta della struttura a doppia elica del DNA nel 1953 (Watson e Crick e Rosa Franklin) si è capito come l'informazione genetica poteva essere duplicata perché si è visto che entrambe le eliche contenevano la stessa informazione (separandole quindi potevano essere ricostruite). Successivamente vennero scoperti i meccanismi di sintesi del DNA. La percentuale di A era uguale a quella di T e quella di G era uguale a quella di C.

Importante è saper leggere la sequenza delle basi. Leggere la sequenza delle basi è complicato: