Biologia molecolare prof.re Di Cunto

L’ATP

- non è un problema per la polimerasi che usa dATP.

- Si fa passare il reattivo a cicli; ad ogni ciclo si da un desossi diverso. Ogni volta leggo la luce emessa

dalla cella e dopo ogni passaggio lavo.

emissione L’emissione di

- Due GG consecutive più intensa della cella. luce è direttamente propor-

zionale al n° di basi inserita dalla polimerasi.

Devo normalizzare i pozzetti: in alcune biglie potrei avere più molecole ed in altre meno.

È il metodo che, dopo Sanger, ci permette di avere le sequenze più lunghe. Ha una % di errore

abbastanza elevato però.

Nella miscela dobbiamo aggiungere anche AMP per ottenere luciferina.

Quindi, all’inizio, il DNA da sequenziare a singola elica viene amplificato con PCR e incubato con gli

DNA Polimerasi, ATP Solforilasi, Luciferasi, Apirasi e con i substrati Adenosina 5’ FosfoSolfato

enzimi e luciferina.

(APS)

Il DNA genomico viene isolato, frammentato con la nebulizzazione, legato ad adattatori e separato in sin-

gole eliche. dal rilascio di pirofosfato (PPi) in quantità equimolare a

Ogni evento di incorporazione è accompagnato

quella del nucleotide incorporato.

–

Ion Torrent (torrente di ioni) sequenziamento mediante semiconduttori

[vedi video nella slide per capire meglio]

Il PPi acidifica il mezzo perché vengono prodotti protoni nella soluzione.

Sotto il sistema di pozzetti, c’è uno strato sensibile agli ioni e un sensore di ioni. Si legge quanti protoni ci

sono nel pozzetto (la variazione di pH). 3

454 Life sciences, 2005

Nel 2005 la 454 Life sciences (Roche) ha inventato un sistema di pirosequenziamento parallelo su larga scala che

non richiede elettroforesi: 454 sequencing. Utilizza la PCR in emulsione per amplificare il DNA e un substrato

in fibre ottiche con micropozzetti larghi 44 µm e profondi 55 µm per sequenziare il DNA con un protocollo di

pirosequenziamento ottimizzato per il supporto solido e i volumi nell’ordine dei picolitri.

È in grado di sequenziare 25 milioni bp/run (con il 99% di accuratezza) quindi con un aumento di 100 volte

rispetto al sequenziamento di Sanger con elettroforesi capillare. Consiste in 3 fasi:

1. Preparazione della libreria di DNA: il DNA genomico viene isolato, frammentato con la nebulizzazione,

legato ad adattatori e separato in singole eliche: 4

2. PCR in emulsione: i frammenti vengono legati a beads in condizioni che favoriscono un frammento per

bead. I beads in emulsione e i reagenti per la PCR vengono "catturati" da goccioline di acqua in olio. In

ognuna delle goccioline, che funzionano da microreattori, i frammenti vengono amplificati, con il

risultato che ad ogni bead saranno legati decine di milioni di copie dello stesso frammento:

3. Sequenziamento: l’olio viene eliminato dall’emulsione e le eliche di DNA vengono denaturate; i beads

1 bead

con legati i frammenti a singola elica vengono deposti nei micropozzetti del PicoTiter Plate device:

per ogni micropozzetto. Beads più piccoli con immobilizzati gli enzimi richiesti per il

pirosequenziamento sono deposti in ogni micropozzetto:

Ad ogni ciclo vengono aggiunti i 4 nucleotidi TACG 1 per volta in sequenza; quando un nucleotide

complementare allo stampo viene aggiunto la DNA Polimerasi lo incorpora rilasciando pirofosfato che

l’ATP Solforilasi converte ad ATP permettendo alla Luciferasi la conversione di luciferina ad

ossiluciferina con produzione di un segnale luminoso che viene registrato dalla camera CCD.

Dopo ogni ciclo i micropozzetti del PicoTiter Plate device vengono lavati con un buffer contenente

Apirasi, che degrada i dNTPs non incorporati e l’ATP in eccesso. 5

24-11-15 METODO ‘ILLUMINA’: bridge PCR e terminatori reversibili

https://www.youtube.com/watch?v=77r5p8IBwJk

https://www.youtube.com/watch?v=womKfikWlxM

https://www.youtube.com/watch?v=HMyCqWhwB8E

Affrontiamo uno dei metodi maggiormente usati tutt’ora: il metodo ILLUMINA.

Si parte anche qui da una frammentazione della molecola di DNA (qui vengono usati gli ultrasuoni,

per ottenere molecole dal peso molecolare corretto).

Successivamente vengono legati degli adattatori e poi, su questo gel, viene fatta una selezione dei fram-

menti in questa miscela; in questo modo decidiamo noi la misura dei frammenti da sequenziare.

Questo non è obbligatorio, soprattutto se abbiamo poco materiale. Aumenta la resa.

Gli adattatori contengono 2 sequenze: P5 e P7 che vengono usati per fare una prima amplificazione.

Abbiamo un primer che ha una parte complementare agli adattatori e che viene usato per estendere la mo-

lecola.

Produciamo una popolazione omogenea di molecole che occupano uno spazio limitato sulle quali possia-

mo poi fare dell’imaging. Per l’amplificazione viene usato il sistema

bridge-PCR.

Le molecole vengono quindi tutte modificate

in modo da avere sia P5 che P7.

P5 e P7 legano la cella a flusso laminare.

Gli adattatori sono essenziali per potere lega-

re le altre sequenze.

Sarebbe possibile, in teoria, legare inizial-

mente i due primer. Tuttavia avremmo il pro-

blema di selezionare molecole che hanno un

primer da una parte e uno dall’altra parte.

Gli adattatori che vengono legati nella prima

reazione ligasica non sono diversi ma sono la

stessa sequenza.

avendo la stessa sequenza, poi voglio met-

tere due estremità diverse. Solo le molecole

con estremità diverse potranno infatti essere

sequenziate in entrambe le direzioni.

Userò due primer specifici per queste due se-

quenze.

Nel singolo filamento ho quindi le due se-

alle estremità; ho però un 5’ e u

quenze uguali

3’.

Prima si fa appaiare un primer alla sequenza

che ho legato. Questo primer contiene P7 e una sequenza complementare all’adattatore che è stato utiliz-

zato. Se ho un’estensione di questo frammento, arrivo fino all’altra estremità.

Alla seconda estremità si lega l’altra molecola.

C’è un sistema che ci permette di selezionare i frammenti della prima reazione. Questi inizieranno tutti

con P7 e saranno complementari all’altra. l’altro primer.

Sul nuovo filamento sintetizzato possiamo attaccare

Alla fine vogliamo una molecola a doppio filamento. 6

Nella reazione successiva, le molecole vengono denaturate e poi fatte appaiare con la superficie della cel-

lula.

C’è un “prato” di oligont legati covalentem. alla cellula.

Il 3’ di questi oligont sporge e va ad ibridizzare con gli adattatori che abbiamo alle estremità.

A questo punto faccio una reazione di estensione. Viene esteso il primer legato al supporto solido e viene

così prodotta una molecola che è complementare a quella utilizzata ma che è vincolata al supporto solido.

Su questa molecola procediamo.

Su questo “prato” avremo una sequenza complementare a P5 e una a P7.

Se l’ibridazione iniziale fosse avvenuta per ibridazione con P5, all’altra estremità del filamento avrò P7.

Su questa cell avrò una miscela di amplificazione.

Per una PCR ci serve uno stampo (che abbiamo).

P5 e P7, i nostri primer, sono legati al supporto solido.

Mettiamo la polimerasi nella miscela, i nucleotidi e la Taq polimerasi.

il singolo filamento. Lo stampo originale se n’è andato e non ce

Denaturazione; a 90° otteniamo

l’abbiamo più. Abbiamo solo una molecola copia attaccata in maniera irreversibile alla superficie solida.

L’estremità 3’ sintetizzata va ad ibridizzare con uno degli altri primer.

l’estensione produrremo un doppio filamento.

Durante

Procedendo così, aumenterà il n° di molecole e saranno molto vicine perché vincolate al supporto.

Bridge quindi perché le molecole singolo filamento fanno un ponte con gli oligont che permette

l’estensione.

questo modo arriviamo ad avere un’altissima densità di molecole.

In

Queste però non sono marcate (abbiamo usato nucleotidi normali).

Ora posso sequenziare.

Per legge le molecole ho bisogno di sintetizzare del DNA; questa metodica è la più vicina a Sanger.

Ho quindi bisogno di un primer che non può essere quello ancorato.

Scelgo quindi una sequenza più interna.

P5 e P7, in parte ibridizzano con gli oligont legati alla superficie e hanno una parte più interna che non

viena usata nel bridge. Questa parte viene usata per il sequenziamento; quella di P5 e diversa da quella di

posso

P7 fare 2 reazioni di sequenziamento.

Se ne faccio una con primer P5, userei metà delle molecole per stampo.

In questo modo ottengo la sequenza delle due estremità.

La sintesi procede utilizzando dei terminatori reversibili fluorescenti; è un gruppo che ha un fluoro-

cromo attaccato. Questo può essere incorporato dalla polimerasi. Si sono ingegnerizzate delle molecole

tali per cui posso idrolizzare questo legame. Posso quindi fare una reazione in cui il nt viene incorporato

 blocca la reazione e leggo il fluorocromo che è attaccato. Faccio una reazione in cui metto tutte e 4 le

basi bloccate al 3’ con un terminatore reversibile con colori diversi.

Qual è la prima base dopo il primer?

Metto la miscela con tutti e 4 e vedo cosa succede. Ho dei cicli di lettura. Ad ogni ciclo metto tutte e 4 le

basi. Ogni spot avrà un colore (fluorescenza) diverso che dipende dalla prima base dopo il primer.

Faccio ora idrolisi. Tolgo il gruppo e avrò una base+OH+primer.

Faccio il 2° ciclo con tutti e 4 i terminatori reversibili.

In ogni ciclo aggiungo una base alla volta su tutti gli spot.

Quindi tra un ciclo e l’altro c’è la rimozione del terminatore ed una nuova reazione.

imaging idrolisi  imaging idrolisi….

Reazione reazione

Limite: possiamo leggere 100 bp dopo il primer x 2 = le 2 estremità! 7

Le molecole sintetizzate che si allungano non sono legate covalentemente alle molecole legate alla cell.

METODO ABI SOLID

È il metodo più complesso. Produce sequenze più corte di tutte ma più accurate.

Come negli altri sistemi dob-

biamo amplificare il DNA ma

nel sequenziamento SOLID

l’enzima chiave non è la poli-

merasi ma la DNA ligasi. So-

no reazioni ligasi.

Il substrato sono delle beats

(biglie) con delle molecole di

di cui conosciamo un’estremità.

DNA attaccate

Hanno un adattatore: P1 adapter.

La cosa importante è generare una popolazione di molecole legate ad un supporto solido delle quali cono-

sciamo una estremità, il frammento P1.

Siamo in una camera che fa delle foto dei colori delle palline. Qui abbiamo un rapporto tra le basi e colori

non univoco.

Non parliamo più di una singola base ma di coppie di basi. Ad ogni coppia corrisponde semp