Biologia molecolare - organismi transgenici

Come fa il nuovo DNA ad integrarsi stabilmente nel genoma?

Ricombinazione omologa

DNA esogeno

DNA genomico

Come fa il nuovo DNA ad integrarsi stabilmente nel genoma?

Inserzione casuale di DNA circolare

DNA plasmidico

DNA genomico

Come fa il nuovo DNA ad integrarsi stabilmente nel genoma?

Inserzione sito-specifica di DNA circolare

DNA plasmidico

DNA genomico

Trasfezione stabile = le cellule vengono trafettate e messe sotto selezione (arricchimento delle cellule che hanno incorporato stabilmente la modifica genetica)

Trasfezione transiente = le cellule vengono trafettate ma non vengono selezionate

PRODUZIONE DI VACCINO CONTRO EPATITE B IN LIEVITO

-VACCINI ATTENUATI SONO VIRUS ALTERATI IN MODO CHE NON POSSANO PIU' RIPRODURSI NELL'ORGANISMO IN CUI VENGONO INOCULATI

-QUESTI VACCINI SONO POTENZIALMENTE PERICOLOSI: POSSONO ESSERE CONTAMINATI CON VIRUS INFETTIVI

-TENTATIVI DI PRODURRE ANTIGENE DI SUPERFICIE DI VIRUS EPATITE B (HBsAg) IN E. Coli FALLIRONO

-IL GENE CODIFICANTE HBsAg E' STATO

CLONATO IN UN VETTORE DI ESPRESSIONE DI LIEVITO. - LIEVITO TRASFORMATO CON QUESTO VETTORE PRODUCE ELEVATE QUANTITÀ DI HBsAg - UTILIZZANDO FERMENTATORI È POSSIBILE OTTENERE 50-100 mg DI PROTEINA PER LITRO DI COLTURA

Produzione vaccino Ricombinante per Epatite B in lievito

ATTIVATORE PLASMINOGENO TISSUTALE (t-PA) e INTERFERON BETA-1a - IL PRIMO È UTILIZZATO NELLA TERAPIA DEGLI ATTACCHI CARDIACI (DISTRUGGE PICCOLI COAGULI DI SANGUE), IL SECONDO NELLA TERAPIA DELLA SCLEROSI MULTIPLA. - SONO PRODOTTI DA LINEE CELLULARI DI MAMMIFERO (CHO) IN COLTURA, NELLE GENOMA DELLE QUALI I VETTORI DI ESPRESSIONE SI INTEGRANO STABILMENTE A SEGUITO DELLA TRASFEZIONE.

Espressione in cellule di mammifero di t-PA e Interferon-β1a Vettori virali - Si ottengono inserendo il gene di interesse nel genoma di diversi tipi di virus, sotto il controllo di un promotore forte. In genere le modifiche vengono introdotte in modo da rendere il virus incapace di riprodursi autonomamente. Questo è importante per

• Il genoma viene ingegnerizzato con le tecniche del DNA ricombinante, e trasfettato in particolari linee cellulari capaci di produrre le particelle virali ricombinanti (linee di packaging). Queste complementano i difetti introdotti nel genoma.
• Il principale vantaggio consiste nell'elevata efficienza di trasduzione (fino al 100% delle cellule).

• Vettori retrovirali
• encapsidation cell line
• Virus difettivo integrato
• Gag Pol Env Psi -LTR Plasmide
• Gene Psi +LTR
• Virus difettivo integrato
• Gag Pol Env Psi - Particelle virali
• LTR ricombinanti
• Gene Psi +LTR

• encapsidation cell line
• Virus difettivo integrato
• Gag Pol Env Psi -LTR Plasmide
• Gene Psi +LTR
• Gag Pol Env Psi -LTR Particelle virali ricombinanti
• Gene Psi +LTR

Gli organismi transgenici possono essere ottenuti modificando cellule embrionali totipotenti.

Esempio: generazione di topi transgenici mediante...

microiniezionedi DNA nei pronuclei maschili

Iniezione di costrutti di espressionelineari, che si integrano sotto formadi concatameri a partire daiprimissimi stadi di sviluppo.

Promotore Introne CDS Poly-A1 2 3 4 5ATG *• Dopo la microiniezione gli embrioni vengono reimpiantati in femmine pseudogravide• Gli animali nati da questi esperimenti devono essere analizzati per mezzo di Southernblotting o PCR per valutare se il transgene si è integrato e in quante copie.•Gli animali transgenici (founders e/o loro discendenza) vengono successivamenteanalizzatati per valutare se il transgene si esprime in, ed eventualmente gli effettifenotipici della sua espressione

La stessa tecnica può essere applicata adaltri mammiferi più grandi: produzione dialpha-1-antitripsina e fattori dellacoagulazione dea pecore transgeniche

Produzione di topi geneticamente modificati mediantericombinazione omologa in cellule ES