Biologia molecolare (prima parte-introduzione, definizioni ed epigenetica)

2 - OTTOBRE 2018

FENOTIPO = MANIFESTAZIONE DEL GENOTIPO

DOGMA CENTRALE → impossibile passaggio delle proteine a DNA e RNA, ma si può

    → passare da RNA a DNA tramite trascrittasi inversa

IN LABORATORIO → usando una DNA polRNA dipendente si è in grado di copiare del

    → DNA dall'RNA, cioè cDNA

MICRO-RNA → RNA funzionali (t-RNA, r-RNA) non codificanti proteine

CELLULA → range tra i 5 - 50 micron

2001 → sequenziamento del genoma umano, grazie al metodo Sanger si inizio dell'era

    → post-genomica

2004 → genoma umano ha tra i 20.000 e 25.000 geni codificanti proteine

GENOMA → insieme dei geni

      → segmento di DNA che generalmente codifica una proteina e che ha

      → delle seq. croniche, introniche, una parte del 5', chiamata seq. leader e una

      → al 3' chiamata coda

GENE → segmento di DNA importante biologicamente che codifica per un RNA

      → o una proteina, anche se non sempre

      → la seq. completa del DNA di un organismo definisce con precisione la specie

POLIMORFISMI → diversità utili per distinguere i vari organismi, c'è l'ormai 0.1%

      → di diversità che si ha tra varie specie

GENOMICA COMPARATIVA → confronta trai genomi di specie differenti: si identificano

      → seq. simili in genomi diversi

FILOGENESI DEI GENOMI ASSEMBLATI → analisi comparata tra genomi di organismi

      → diversi per ricostruire le filogenie, misurare poi il grado

      → di omologia

ALBERO DELLA VITA → suddiviso in BATTERI, EUCARIOTI e ARCHEOBACTERI

ARCHEOBACTERI → RNA simile a quella eucariotica, proteine simili ad istoni, struttura del

      → promotore simile a quella eucariotica, sintesi proteica inizia con la

      → metionina e certi geni che codificano per tRNA e rRNA possono avere introni.

2-OTTOBRE 2018

FENOTIPO → MANIFESTAZIONE DEL GENOTIPO

DOGMA CENTRALE → impossibile passare dalla proteina al DNA e RNA, ma si può passare da RNA a DNA tramite trascrittasi inversa

IN LABORATORIO → usando una DNA-polRNA dipendente si è in grado di copiare del DNA dal RNA, cioè cDNA

MICRO-RNA → RNA funzionali (t-RNA r-RNA) non codificanti proteine

CELLULA → range tra i 5-50 micron

2001 → sequenziamento del genoma umano, grazie al metodo Sanger iniziò dell'era post genomica

2004 → genoma umano ha tra i 20.000 e 25.000 geni codificanti proteine

GENOMA → insieme dei geni

segmento di DNA che generalmente codifica una proteina e che ha: - delle seq cromiche intronsiche, una parte di 5' chiamata seq leader e una al 3' chiamata coda

GENE → segmento di DNA importante biologicamente che codifica per un RNA e una proteina dando un nome univoco

la seq completa del DNA di un organismo denina con precisione la specie

POLIMORFISMI → diversità utili per distinguere i vari organismi, c'è l'ermo 0,1%, di diversità ile tra varie specie

GENOMICA COMPARATIVA → confronto tra genomi di specie differenti in identificano seq. simili i genomi stessi

FILOGENESI DEI GENOMI ASSEMBLATI → analisi comparativa tra genomi di organismi diversi, la filogenesi misura poi il grado di omologia.

ALBERO DELLA VITA → suddiviso in BATTERI, EUCARIOTI E ARCHEOBATTERI

ARCHEOBATTERI → RNA simile a quella eucariotica, proteine simili ad istoni, struttura del promoter simile a quella eucariotica, sintesi proteica inizia con la metionina e certi geni che codificano per tRNA e rRNA possono avere introni.

LIVELLO DI COMPLESSITÀ

numero di tipi cellulari distinti in un organismo,ovvero la molteplicità dei destini differenziativicomplessità delle funzioni, ovvero memoria-emozioni

(questi due fattori influiscono, ma non sono gli unici a spiegare la complessità)

la percentuale del genoma codificante ≠ nono, significa che + genoma si ha + si è complessi !

PERÒ esiste comunque una tendenza di aumento del genoma da un batterio di un organismo più complesso. Anchio il numero dei cromosomi non dipende dalla complessità di un organismo.

Quindi gli elementi che non determinano la complessità di un organismo sono la LUNGHEZZA del genoma e il numero dei CROMOSOMI.

Man mano la complessità cresca, raggiungono nuovi GENI con funzioni aggiuntive

• PERCENTUALI : 24% introni / 27% altre DNA intergenico / 31% ripetizioni
• 4% trasposomi / 1% DNA codificante proteine
• 14% genia che compiuti al genoma

TRASPOSOMI :

seg. Ripetute con LINE, SINE, LTR e le ripetizioni in tandem

FAMIGLIE GENICHE:

ne fanno parte geni con un certo grado di omologia.n° dei geni che appartiene a una Famiglia genica aumenta con l’aumentate della complessità dell’organismo.

I geni possono anche essere presenti in una unica copia (non appartengono a una Famiglia genica). I membri di una Famiglia genica possono essere organizzati in GLUTTASTI o la totalità di diverse, gli pseudogeni o geni non espressi.

I geni di famiglia multipistiche derivano un precursore ancestrale.

Ad esempio: TUBULINA tubulina _α ¹tubulina _β ¹tubulina _α ²tubulina _β ²

DUPLICAZIONE GENICA:

genera diversitarsi genomica

7 OTTOBRE 2018

Un altro fattore che influì sulla cellula di complessità è lo schema di espressione: cambia cioè che regione trascritta da tessuto a tessuto, da organismo a organismo. Ogni cellula trascrive e traduce solo una quota dei suoi geni.

GENI ORTOLOGHI: geni di, in organismi diversi, codificano per le stesse proteine. Per essere ortologhi due geni devono avere un’omologia pari o superiore al 80%.

GENI PARALOGHI: geni che derivano da un’antenato comune e subiscono un’evoluzione e individualizzazione nello stesso organismo.La duplicazione genica è un meccanismo che permette l’acquisizione di nuove funzioni in virtù di mutazioni. L’acquisizione di nuove funzioni di tessuto o di un organismo. Non tutti i geni sono formati solo da geni presenti.

Quando la mutazione e duplicazione genica interessano un fattore di trascrizione, una sequenza del DNA con funzione regolatoria sulla trascrizione, le conseguenze sono molto evidenti.

SCOPERTA DEL DNA: 1871 → nucleina: contenente, fosforo, azoto1928 → Griffith: ceppo R (avirulento) → (virulento) →

Il topo moriva e cerca un qualcosa che passava dal ceppo S al ceppo R, che diventa va patogeno. Si scoprì poi essere il DNA.

1943 → Bombai; Avery: per capire che il mutino trasfo mancato è il DNA. Liso, cellule di pneumococchi: lisato, poi vi ottenne proteine, zuccheri, acidi nucle dei lipidi. Si cercò di capire qual’era la macromolecola che trasformava i batteri R in batteri S.

TRASFORMAZIONE BATTERICA:

clonare il DNA in un plasmide inserito nei batteri che si replicano insieme al plasmide. Si lisano i batteri e ottengo DNA in grande quantitá. Solo i batteri con il DNA esogeno sopravvivono al terreno con l'ampicillina perchè hanno acquisito la ampicillina-resistenza. Si usano batteri di E. coli resi competenti (in grado di ricevere DNA).

ESPERIMENTO DI HERSHEY E CHASE:

dimostra che solo il DNA entra nella cellula batterica e quindi il DNA deve avere tutte le informazioni necessarie per la produzione della progenie fagica.

COMPOSIZIONE DNA:

polimero di nucleotidi. I nucleotidi possono portare il gruppo fosfato in posizione 3' o 5'. Legami fosfodiesterici nella catena polinucleotidica.

STRUTTURA DNA:

si conosce grazie agli esperimenti di Franklin. Invece, le regole di Chargaff dicono che A = T e G = C. La Franklin usò la cristallografia a raggi X: usó il DNA a posto del cristallo e ottenne un pattern di diffrazione dopo che aveva colpito il DNA con raggi X. Si creano delle macchie che rivelano la struttura del DNA poi elaborata da Watson e Crick.

• Periodo maggiore = 3,4 nm, periodo minore = 0,34 nm.
• Diametro = nm. L'alloproteina elicoidale destrorsa, compie un giro completo ogni 10 basi (34 Å = 3,4 nm).
• Solco minore = 1,2 nm, solco maggiore = 2,2 nm.

Interazioni idrofobiche (tra basi) e forze di Van der Waals (van der Wais) che stabilizzano il DNA, e interazioni elettrostatiche (tra gruppi fosfato) che destabilizzano.

Le Basi sono implicate, ma la sovrapposizione è solo parziale a causa dell'angolo twist (34°).

I parametri TWIST, ROLL e TILT descrivono il relativo posizionamento di due paia di basi adiacenti, quindi descrivono l’angolo che si forma a seconda di come avviene questo parziale impilamento tra le basi. TWIST: angolo di rotazione tra il piano di una coppia di basi e il piano della coppia di basi successivo. È pari a x 36°. ROLL: inclinazione di un angolo di 40°. TILT: determina un’inclinazione del piano di una coppia di basi rispetto al piano della coppia successiva. Si forma per repulsione rispetto all’asse zucchero-fosfato. STRUTTURE ALTERNATIVE: - la struttura ideale e più comune è la B - la struttura A forma un’elica più larga e si ottiene quando l’umidità è ridotta al 75%. - la struttura Z ha doppia elica sinistrosa, la linea che unisci i gruppi fosfato procede a zig-zag intorno all’elica. Ha unità ripetitiva che è un dinucleotide dove la X è una pirimidina e la Y una purina. È poco stabile perché ha le cariche negative di gruppi fosfati molto vicine.

Le parti del genoma con struttura Z sono meno trascrivibili, e quindi esistono proprio per regolare la trascrizione di alcuni geni contenuti in quella parte. Si potrebbe anche trovare, in alcune parti del genoma, una TRIPLA ELICA data dal ripiegamento del filamento in virtù delle interazioni di Hoogsteen. Possono esserci anche seq. ripetute e invertite, si parla di seq. PALINDROME. I filamenti si possono ripiegare per formare strutture CROCIIFORMI o strutture a Forcina che si formano all’interno di un filamento per appaiamento di basi complementari vicine.

9-OTTOBRE 2018

La CROMATINA è presente solo negli eucarioti.

EPIGENETICA: è una modificazione che si trasmette alle cellule figlie, ma

non è legata alla seq. del DNA. Le modificazioni epigenet.

che sono indotte dall’ambiente e da stimoli vari di stress che

producono queste modificazioni: a carico della cromatina o

a carico del DNA, che non ne cambiano la struttura, ma

che vengono trasmesso alle cellule figlie, cambiandosi.

TRASCRIZIONE EU/PRO: nei procarioti avviene su un filamento di DNA stampo

− ci sono i fattori e mole RNA-pol che

legge il DNA e si trovare il suo promotore.

− non c'è la cromatina e RNA-pol trova

subito il DNA che deve trascrivere.

negli eucarioti avviene su uno stampo di cromatina

− RNA-pol non legge il DNA − inizio della t.

si svolge della proteina che legano al

DNA. Nei nucleare sta RNA-pol

− l’RNA-pol trova il DNA sottopora di

cromatina.

CROMATINA: DNA + proteine. Due componenti proteica istonica serve per

condensare il DNA (deve stare in uno spazio di 10-15 micron, se no

non entra nel nucleo della cellula).

La cromatina, con microscopio elettronico, appare: come un filo di

perla e le perle sono multicoperitomi e il DNA.

Per separarla i nucleosomi ci son la DNAsi specifica (nucleasi

microscopica).

La cromatina: non accessibile e la eterocromatina non trascrive seni

invece la cromatina questa è accessibile euromatina.

ASSEMBLAGGIO DI UN NUCLEOSOMA

si forma il tetramero con gli istoni H4 e H3.

Il tetramero lega il DNA e recluta i 2 dimeri H2A e H2B per formare l'ottamero.

PROTEINE ISTONICHE

famiglia di gomiglobular conservate. La histone-fold serve per assemblare i dimeri con il tetramero per formare l'ottamero.

CODE ISTONICHE

• Motocioni che fuoriescono delle facile dei nucleosomi e tra i due volgimenti. Sono accessibili a modificazioni epigenetiche.
• possono essere modificate da proteine in grado di acetilare o metilare. Acetilazione e metilazione regolano la trascrizione dei geni.

METILAZIONE

avviene sulla lisina e arginina. La lisina può essere mono, di o tri metilata. La lisina 9 è un complesso di attivazione; quando è metilata la lisina 9, invece, inibisce la trascrizione.

ACETILAZIONE

→ la cromatina è deacetilato → gene è inattivo

se è acetilata → gene è attivo, cioè le code istociche.

DOMINI PROTEICI

• Chromo domini → ligano code istoniche metilate
• bromo domini → ligano sole istoniche acetalate
• HP1 (ethaothchromatin protein 1) → proteina dove c'è inclusione di modalità di interazione del proteina con traccizione che si lega a una quantità che non trascrivere, perchè la lisina è trimetilata dell'13.

H2A.X

è un'istonia che quando è nucleosoma ha capacità di ripara dismo al DNA che ha subito

LIVELLI DI CONDENSAZIONE

• le file di pule corrispondono a una fibra di 10m
• la dinucleosoma si incavarella → il livello meno condensato. la fibra è 30nm è il lika dipia che
• 2. file di nucleosoma avvolte in un colonoide.

E infelice l'ottamero → massimo livello di condensazione.

la metilazione del DNA è anche un meccanismo di inattivazione del cromosoma X.

Quando avviene la duplicazione del DNA la cromatina deve modificarsi: se no la doppia elica non può aprirsi e la DNA-pol non può duplicare e i due filamenti di DNA.

POSIZIONAMENTO ESTRINSECO una determinata seq. tende a catturare il ottamero in questa regione, e non in un'altra POSIZIONAMENTO INTRINSECO indotto da fattori, come la presenza di una prote ina legata a una seq. specifica del DNA che favorisce il posizionamento del nucleosoma in questa regione specifica.

I nucleosomi, oltre a formarsi nelle solane ragioni del DNA per i motivi indicati sopra, si formano di preferenza su DNA curva, le sq. A-T più inclini ad avvolgersi in un nucleosoma.

La replicazione separa filamenti di DNA e quindi porta alla distribuzione della cromatina/nucleosoma, che poi riformano una volta che il DNA è replicato.

Ottameri-storione si no mantenuti nella replicazione Tetrameri e dimeri sono mantenuti la aumentata velocissima, a riformarsi.

FACT: complesso proteico che disassembla il nucleosoma se il riassembla quando la RNA-pol è passata nel filamento la struttura della cromatina è stabile, ottameri scomposti e ricomposti Nucleosoma 200 kilodalton, e RNA-pol 500 kilodaiten.

RIMODELLAMENTO DELLA CROMATINAS processo che richiede ATP le disass. sembaggio e riassembaggio sono facilitati dai rimodellatori della cromatina, cioè proteine ATP-dipendenti. Quando l'ottamero istomico è mantenuto alta reciso e legano al DNA, rimodellatori hanno subunità ATPasi, e DNA-elicasi/acic e hanno nome dominio.