Biologia molecolare

SITUAZIONE MODERNA

Riprendiamo il progetto

Avevamo sequenziato un pezzetto della proteina e da questo avevamo dovuto fare una serie di operazioni che consistevano in una sonda degenerata e nello screening dilibrary per ottenere dei cloni BAC.

Per maneggiare il DNA più agevolmente sono state sviluppate delle library con vettori più capienti come che sono vettori in grado di contenere fino a 300.000 paia dibasi, ma il processo rimaneva sempre quello dello walking -> processo che richiedeva mesi e anni di lavori.

Se oggi identificassimo una proteina e volessimo sapere il gene?

C'è uno strumento che ci permette di guardare alla sequenza dell'intero genoma umano (dato che è disponibile sia il genoma, che i cDNA che sono stati allineati con il DNAgenomico), è depositato in banche dati e può essere analizzato usando i genome browsers.

Si possono trovare altri genomi oltre a quello umano.

Si inserisce una sequenza di nucleotidi nella barra.

di ricerca e si ottengono tutte le sequenze che contengono quel frammento

Esempio: gene del fattore VIII della coagulazione

la sequenza inserita rispetto al gene è minuscola, non si vede più

il gene occupa circa 188.000 basi e si possono recuperare informazioni riguardo alla sequenza e sapere anche la sequenza della proteina

si può vedere anche l'mRNA allineato con la sequenza

Nelle varie cornici di lettura, solitamente negli umani solo una traduzione/6 è quella giusta, nei batteri/virus invece no, vengono prodotte più proteine usando cornici di lettura diverse, sfruttano infatti l'informazione in modo compatto

VARIANTI GENICHE: POLIMORFISMI, MUTAZIONI, METODI PER EVIDENZIARLI E MUTAZIONI

Se individuiamo il gene responsabile della patologia, abbiamo trovato la sequenza del gene umano normale, ma a questo punto bisogna andare a cercare le diverse mutazioni.

Come facciamo a diagnosticare quale sia stato il problema nel paziente?

Si potrebbero

Ipotesi: patologia dovuta alla perdita di una proteina

Cosa potrebbe essere successo?

1. mutazione non-sense —> mutazione di un nucleotide che sostituisce un codone con uno di stop
2. mutazione frame shift —> fanno perdere la cornice di lettura

Entrambe queste mutazioni fanno avere una sequenza che dopo poco si interrompe a causa di un codone di stop

mutazioni troncanti—> queste due mutazioni sono definite perchè troncano la proteina e la riducono a zero

3) mutazioni missenso —> cambia un amminoacido, la proteina c’è ma il cambio è avvenuto su un amminoacido funzionale che potrebbe inattivare la proteina

4) delezione—> le perdite di materiale sono le mutazioni più frequenti

Come facciamo a diagnosticare una di queste situazioni nel paziente se abbiamo una sequenza normale?

Si

Faceva un clonaggio di DNA del paziente usando come sonda pezzi del genoma umano —> si ottenevano pezzi dei geni del paziente che si possono sequenziare per cercare la mutazione—> metodica lunga; consisteva nel creare e screenare delle library dei pazienti usando come sonda il DNA normale, poi si sequenziavano cloni del paziente

Esempio di 3 sequenze ottenute da pezzi di uno stesso gene di un soggetto normale

Diagramma 2: sorella del soggetto

Questa è una patologia X-linked recessiva —> tutti i maschi hanno una sola copia del gene, normale o mutata

Dal confronto vediamo che in questa posizione nei soggetti normali trovo sempre una A (codone GAA), invece nel paziente c'è una G (codone GAG)

La sorella del paziente invece ha due picchi. La situazione non può essere un rumore di fondo perché vediamo indistintamente due picchi, verde e nero —> perché è eterozigote e presenta entrambe le varianti, sia quella normale

Questa altra casistica abbiamo un elettroferogramma wild-type, uno eterozigote e uno mutante.

Si osservano i primi due: nell'eterozigote dopo il punto della delezione i picchi sono tutti doppi, infatti in questo abbiamo sia l'allele mutato che quello sano; quando andremo a fare la sequenza avremo la stessa sequenza, ma dopo questo punto mutante sarà con una base più corta. Tutti i frammenti successivi saranno di un nucleotide più corto -> somma delle due frequenze -> doppi picchi.

Ecco perché è importante individuare un unico punto di inizio di lettura, altrimenti le sequenze si mescolerebbero. Questo tipo di mutazione si capisce già solo guardando l'elettroferogramma, è un frame-shift, usando poi l'allineamento capiremo dove è stata la delezione.

Conosco la sequenza e ho degli strumenti che mi permettono di analizzare se questa sequenza è uguale a un'altra sequenza normale o no.

VARIANTI

problemaDNA SATELLITEÈ stato identificato con degli esperimenti dei gradienti fatti con il cloruro di Cesio

Si frantuma il genoma umano e lo si mette in un gradiente di CeCl, gradiente di densità—> si vedono tante bande sottili e poi una spessa

Le bande sottili vengono chiamate bande satelliti

Le molecole di DNA si dispongono secondo la loro densità —> nel genoma umano ci sono sequenze con una certa densità che dipende dalla composizione (basiazotate) del frammento

Le bande satelliti hanno una densità particolare, derivano da sequenze ripetitive che si posizionano a una determinata densità

Le bande satelliti costituiscono dunque una manifestazione del DNA ripetitivo

Si è iniziato a capire quanto fossero grandi queste sequenze ripetute e da che basi erano fatte

Si sono introdotti anche i concetti di microsatelliti e minisatelliti

Il vero DNA satellite che costituisce queste bande è costituito da segmenti molto lunghi

ripetuti fino a centinaia di kb (regioni di centromeri o telomeri)

MINISATELLITI E MICROSATELLITI

Per parlare di DNA ripetitivo bisogna specificare quanto è grande

Minisatelliti: fino a 5bp che si ripetono fino a 25kb

Microsatelliti: da 2 a 4 nucleotidi e i segmenti non sono lunghi, ripetizioni lunghe qualche decina di basi

locus: sequenza

alleli: dipendono dal n di ripetizioni

Anche queste due tipologie di DNA satellite possono avere un valore patologico

Il sequenziamento ci permette di identificare queste sequenze, ma sono state sviluppate altre tecniche

Il southern blot è stato il primo a individuare differenze tra individui, anche di singoli nucleotidi grazie agli enzimi di restrizione (e non all'ibridazione)

Esempio: locus derivante da un cromosoma materno e uno paterno

In quello paterno una mutazione ha fatto perdere uno dei siti di restrizione —> al momento del taglio si crea un unico frammento grande quanto la somma dei due frammenti del materno

Digerendo il

DNA si ottengono i frammenti di lunghezza diversa. Avendo una sonda molecolare è possibile evidenziare la differenza tra i due. Frammento A tagliato tre volte. Frammento B tagliato due volte. Se usiamo una sonda, ciò che verrà fuori dipenderà dal genotipo:

• si vede una banda: si ha un unico allele -> omozigote
• due bande: si hanno i due alleli -> eterozigote

Situazione polimorfica: individui diversi mostrano una situazione differente in cui la digestione con enzimi di restrizione genera frammenti di lunghezza diversa (RFLP).

Situazione chiamata non necessariamente devo conoscere il polimorfismo. Quando ho un frammento di DNA clonato posso chiedermi se questo contiene polimorfismi, per avere una risposta combino una digestione e una sonda e vedo se ottengo le stesse bande o più bande diverse. Se io invece conosco a posteriori la situazione posso pensare di sfruttarla. Il southern blot può quindi essere usato per

studiare le differenze tra individui

se nelle analisi il maschio malato non presenta il segnale, abbiamo perso un pezzo grosso di DNA

Oltre alla presenza/assenza di un sito di restrizione ci possono essere altri fenomeni che danno un RFLP

Esempio: duplicazione di una seqeunza—> frammento di restrizione che sarà più lungo

Nel Southern ciò che determina il peso molecolare delle diverse bande è la corsa elettroforetica, la sonda ci permette solo di vedere le diverse bande; si tratta sempre dello stesso pezzo di DNA che non corrisponde interamente alla molecola

Riusciamo quindi a vedere la differenza tra tutte le molecole e le vediamo come differenze della lunghezza dei frammenti di restrizione

Esempio: nel gene c’è una mutazione che mi fa sparire un sito di restrizione

Analizziamo il gene in una famiglia: c’è una differenza nella regione che fa sparire il sito —> l’allele mutato ha un sito in meno—> posso