Biologia molecolare

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LEZIONE 1 corro

di

Siamo l’esecuzione di un programma genetico scritto nello zigote, tutti deriviamo da un’unica cellula in cui sono scritte delle istruzioni

L’esecuzione di queste informazioni da risultati variabili: il programma determina la divisione della cellula in due, quattro, fino a diventare morula, poi blastocisti fino a

diventare ciò che siamo ora

Il nostro programma è lungo un metro e composto da 4 lettere, circa 3 miliardi di basi

Questo librone è diverso per ognuno di noi e comprendere ciò che ci differenzia è importante

Un individuo differisce da un altro per una base ogni 1000, in totale si hanno 6 milioni di differenze: alcune sono innocue, altre possono generare fenotipi patologici

(malattie genetiche)

È possibile identificare il proprietario di una traccia di materiale biologico?

Si, è possibile identificare una persona a partire da un capello o saliva, ma la polizia non riesce a distinguere nei casi di gemelli monozigoti poichè possiede strumenti non

molto accurati covis

Test messo a punto dall’FBI chiamato che funziona e individua la persona cui appartiene quel frammento, con questo però non si possono distinguere i gemelli; il

sequenziamento invece si

Questo test richiede molti minuti, a volte anche ore

Con questo si può anche fare il test di DNA per sapere di chi si è figli

Per il prezzo di sequenziamento, questo varia da quanti geni si vuole sequenziare e da che strumenti si utilizzano (va dai 1000 ai 10.000 euro)

Non c’è bisogno di sequenziare tutto il genoma se usiamo una sequenza specifica per distinguere tutti, di questa si va a guardare ciò che cambia

—> sequenziare solo un frammento del genoma ha senso perchè

- per alcune analisi non serve tutta la sequenza del DNA

- un genoma completo letto non dice nulla

—> la sequenza del genoma deve anche essere interpretata

Oggi il genoma viene sequenziato, ma non base per base a seconda degli scopi con cui lo si fa fare (trovare parenti sparsi per il mondo, info per la salute della persona,

fattori di rischio genetici, predisposizione a malattie…)

Il nostro programma genetico determina come siamo e come rispondiamo ai farmaci

farmacogenomica

—> —> area della scienza in espansione, basta una goccia di saliva alle ditte per sequenziare il DNA

medicina di precisione

Grazie a questi sequenziamento si parla di (=approcciare il paziente sulla base del suo profilo genetico che si ottiene da sue cellule normali o

patologiche come i tumori)

Metodo di selezione in provetta

Potenziali embrioni in stato di morula già stati analizzati geneticamente per vedere che problemi potrebbero sviluppare nel corso della vita

In Italia la legge dice che l’embrione è sacro e non si può preferire uno all’altro ma grazie al pronunciamento di due corti in Italia si può fare

diagnosi pre-impianto

La tecnologia usata è la che può essere usata per le malattie genetiche mendeliane: si preleva una cellula da un embrione e si analizzano le parti

che ci interessano con appositi strumenti

—> si può svegliare di impiantare un embrione sano

Manipolazioni del DNA

Dalla lettura del DNA si possono ricavare moltissime informazioni rilevanti per la medicina e per organizzare la propria vita, ma il gioco si fa interessante quando si capisce

riscrivere

che si può anche un genoma

—> Le informazioni scritte nel genoma si possono riscrivere

Sono state già corrette delle sequenze OGM.

La riscrittura del genoma è utile in numerosi ambiti: dalla produzione di farmaci alla correzione di geni implicati nelle malattie, fino agli

Manipolare il DNA è utile per chi studia la biologia:

Esempio: topi verdi quando illuminati da una lampada UV perchè esprimono una proteina che normalmente non è presente nei topi, ma è stata aggiunta artificialmente.

Se questi topi modificati crescendo sviluppassero un tumore, le cellule tumorali sarebbero facilmente rintracciabili e perseguibili

Per riscrivere un intero genoma, basta anche cambiare una lettera a un genoma, le modifiche quindi sono di varia natura e dimensione

Il biologo Craig Venter ha creato una cellula artificiale sintetizzando da zero un genoma con più di un milione di basi

biologia sintetica

—> che per ora si può applicare solo sui microorganismi

Maldini e De Luca hanno realizzato dei protocolli di terapia genica che hanno curato gravi malattie —> è possibile curare malattie tramite tecnologie di terapia cellulare e

ingegnerizzazione del genoma delle cellule

Tecnologia CRISPR/CAS9 usata in due gemelle cinesi che hanno subito una modificazione del genoma

—> ha vinto il Nobel questa tecnologia

La scienza è diversa perchè i risultati non sono mai definitivi, ma sempre provvisori

Che cos’è un gene?

Non c’è una definizione di gene

cellulare discreto

Gene=fattore in grado di determinare alcuni caratteri manifesti (fenotipo) —> definizione di Mendel che non prende in considerazione le molecole —>

definizione universalmente valida

Mendel introduce un aspetto quantitativo, conta il numero di fiori ottenuti dai vari incroci

Le informazioni sono contenute nel nucleo, queste si dividono durante mitosi o meiosi

La prova che i geni risiedessero nel cromosoma la diede Morgan che analizzando la trasmissione dei cromosomi, riuscì a correlarle la trasmissione di alcuni caratteri con la

trasmissione del sesso

Morgan e Darwin inizialmente non credevano a Mendel

Funzionamento dei geni

Garrod scopre che alterazioni geniche possono alterare le funzioni biologiche

—> scoperta fatta mentre studiava l’alcaptonuria

La biologia molecolare è nata analizzando una grande quantità di organismi scorrelati, ognuno dei quali ha fornito informazioni.

- neurospora —> un gene codifica per un enzima

- drosophila —> le mutazioni possono essere indotte da agenti chimico-fisici

geni sono capaci d influenzare il metabolismo attraverso la codifica di enzimi (=proteine) —> i biologi ritenevano che i geni fossero fatti da proteine perchè sono molecole

*i

complesse (20 lettere contro le 4 del DNA) nucleina

- Miescher analizzando il pus delle bende dei malati (ricco di linfociti) scoprì che nel nucleo c’erano le proteine e la (comporta da DNA)

non era ancora chiaro che il materiale genetico fosse il DNA, si pensava fosse solo un materiale di supporto per le proteine che contenevano

l’informazione genetica

DNA viene scoperto da Miescher analizzando il pus dalle bende dei malati (ricche di eritrociti dai quali si può purificare il nucleo), il DNA

—>Il era legato a proteine e si pensava che queste portassero le info

TEORIE EVOLUTIVE teorie evolutive

Un altro caposaldo della biologia molecolare sono le che influenzano tutta la biologia

In biologia nulla accade per uno scopo, i cambiamenti precedono la loro espressione

Lamark—> gli organismi si adattano all’ambiente (cercano di cambiare la loro struttura) e trasmettono i propri cambiamenti ai figli

prima cambiamento e poi trasmissione

Darwin —> modificazioni che generano diversità si producono prima e dopo agiva la selezione naturale

riproduttivo

per lui le varianti (=cambiamenti) derivavano dall’isolamento

elabora questa teoria pensando agli allevamenti degli animali di razza —> per ottenere una nuova varietà canina si prende un numero

piccolo di individui con le caratteristiche che vogliamo e li facciamo riprodurre tra di loro

sbagliato perchè non conosceva Mendel poichè dall’incrocio di due invidi possono comparire delle varianti recessive, dominanti…

—> l’isolamento riproduttivo generava più fenotipi diversi perchè era più alta la probabilità che comparissero fenotipi recessivi

Nell’evoluzione ci sono due motori

- uno che genera i cambiamenti

- uno che seleziona i cambiamenti

I geni sono responsabili di questo e devono essere compatibili con questa teoria neo-darwiniana: le varianti sono prodotte casualmente o quasi perche ci sono delle condizioni

che accelerano la comparsa delle mutazioni

Teoria neo-darwiniana: gli organismi si adattano ai cambiamenti dell’ambiente attraverso la selezione di varianti geniche precedentemente prodotte

Barriera di Weissman —> concetto che fa abbandonare la teoria di Lamarck

2 compartimenti: somatico e germinale, due linee: somatica e germinale

—> non tutte le cellule dell’organismo danno origine a una nuova generazione

Se il soma si adatta ai cambiamenti ambientali ma non c’è una variazione simile nella linea germinale, gli adattamenti non possono essere trasmessi alle generazioni future

Si pensa che ci possa essere un superamento di questa barriera grazie all’epigenetica

—> teorie scientifiche considerate provvisorie (=valide fino a quando non vengono smentite)

La teoria neo-darwiniana può essere considerata valida, alcuni aspetti possono essere perfezionati, ma non stravolti

INNOVAZIONI CHE HANNO PERMESSO LA NASCITA DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE

batteri,

I biologi molecolari hanno scoperto qual è e come funziona il materiale genetico studiando i anche se sono diversi da noi

popolazioni clonali

Studiare batteri e virus permette di contare il numero di individui con determinate caratteristiche producendo le

coltivazione

—> metodo chiamato e offre la possibilità di ottenere organismi geneticamente identici (=cloni) partendo da una cellula

Poter analizzare questi organismi ha permesso lo sviluppo della biologia molecolare

Koch —> innovatore che è riuscito a sviluppare un nuovo metodo per poter isolare diverse specie di batteri

Con terreni di coltura è stato possibile isolare singole cellule batteriche e virali usate poi per creare cloni fluttuazione

Inizio della biologia molecolare dato da Luria e Delbruck —> la loro collaborazione ha portato all’esperimento di

Luria studiava l’effetto delle radiazioni sui batteri

Delbruck era un fisico

Nell’esperimento di fluttuazione dimostrano che i batteri avevano i geni (al loro tempo non era scontato)

—> batteri usati per esperimenti genetici visto che hanno i geni

Ciò che ha reso possibile l’esperimento è la resistenza ai virus da parte dei batteri —> se si infettano dei batteri con dei virus, alcuni sopravvivono, ma questa sopravvivenza è un

fenomeno casuale, a volte si formano tanti batteri resistenti e altre volte no e questo fenomeno casuale ha luogo prima dell’esposizione al virus —> virus e batteri hanno i geni —>

manco per i batteri vale Lamark

Schrodinger studiò la stabilità e la dimensione dei geni

—> va a studiare le mutazioni indotte dalle radiazioni

Geni piccolissimi —> detto da Delbruck, pochi atomi per un gene

Geni —> oggetti nell’ordine di grandezza della meccanica quantistica, ma i geni sono stabili, le mutazioni sono sono comuni

—> geni piccoli ma stabili, non si faceva a capire come il DNA fosse piccolo quanto stabile

—Z si pesava che avesse una str cristallina, oppure per il fatto che contenesse tantissima info che fosse in grado di cambiare moltissimo

cristallo aperiodico

Schroedinger definì il gene come un

Avery poi dimostrò che il materiale genetico era il DNA

Studiò infatti gli pneumococchi dove si potevano distinguere fenotipi diversi, nelle sue piastre c’erano colonie diverse che si comportavano diversamente anche a livello

patogenico

La caratteristiche patogeniche potevano essere trasferite da un batterio all’altro tramite un materiale che Avery isolò: il DNA

Avery non prende il Nobel

Chase e Hershey si —> dimostrarono che il DNA contiene informazioni

Utilizzano due tipi di un batteriofago:

- uno cresciuto in un ambiente con isotopo 35S

- l’altro cresciuto in ambiente con isotopo 32P

Mettendo a contatto i due batteriofagi con dei batteri

- i batteri infettati dal primo tipo di macrofago non avevano residui radioattivi all’interno

- i batteri infettati dal secondo tipo ne avevano cristallografia a raggi X

Watson e Crick ne individuano la struttura usando la

—> struttura regolare, paragonabile a un cristallo perchè le distanze tra le basi sono sempre uguali

—> da questa struttura si partì per capire il meccanismo di duplicazione 10112

LEZIONE culto

2 di

DOGMA CENTRALE DELLA BIOLOGIA

Crick è stato uno dei padri fondatori della biologia molecolare poichè capisce come funziona il flusso dell’informazione genetica

(=dogma centrale della biologia)

L’info genetica scorre da DNA a RNA a proteine

—> una volta che l’info arriva dalla proteina non può tornare indietro

Era una possibilità, all’epoca non si conosceva bene il ruolo dell’RNA, per quanto ne sapevano le proteine potevano essere

sintetizzate direttamente a partire dal DNA.

Cercavano di comprendere la funzione dell’RNA poichè alcuni organismi lo utilizzavano come materiale genetico

Frecce ricorsive (circolari) da DNA a DNA —> DNA può essere facilmente ricopiato, stessa cosa vale per l’RNA (—> osservato nei

virus a RNA come il SARS-cov-2

Crick ipotizza poi che l’info possa andare indietro da RNA a DNA —> non c’era ancora nessun riscontro chimico-fisico

trascrittasi inversa.

Anni dopo si scoprirono i retrovirus dove effettivamente ciò accade grazie alla

Escludeva però che le proteine potessero duplicarsi o che dalle proteine si potesse arrivare a RNA e a DNA —> ipotesi mai

smentita quindi la sua ipotesi rimane in piedi

GENOMI E GENI

Dopo aver individuato la forma e il flusso, bisogna saper leggere le sequenze delle basi e comprenderla

DNA—> molecola regolare, caratterizzata da ripetizioni di gradini costituiti da coppie di basi e capace di immagazzinare informazioni in maniera illimitata

Informazioni immagazzinate nella sequenza delle basi —> cambiando i nucleotidi si cambia informazione

—> per leggere l’informazione bisogna leggere la sequenza

Leggere le informazioni genetiche di un organismo significa determinare la sequenza del suo genoma

Genoma= insieme si tutte le informazioni genetiche di un organismo

nel caso del genoma umano ci sono 3 miliardi di basi

nell’escherichia coli ce ne sono 4,6 mln

Gene= unità di informazione genetica

sono molecole di acidi nucleici —> si voleva leggere l’informazione contenuta al loro interno

Foto del nucleo di una cellula, con il microscopio elettronico si possono vedere le molecole di DNA che sono una matassa di fili intrecciati, cercare di leggere i nucleotidi

cercando di ingrandire questa immagine è impossibile perche le informazioni sono ingarbugliate

—> complicato leggere l’info direttamente

—> si può usare la biochimica e la genetica per tentare di leggere

Bisognerebbe isolare dei piccoli frammenti di DNA per renderlo più maneggevole

I fili di DNA soni molto lunghi e sottili —> rischio che si rompano cromatina

—> la cellula ha ricorso a dei metodi che ordinando la matassa —> il DNA nelle cellule si trova sottoforma di (=avvolto intorno agli istoni) che si compatta al momento

della duplicazione e divisione eucromatina

I geni inattivi della cellula tendono ad essere associati alla membrana cellulare nella eterocromatina (compatta —> scura), le zone più chiare sono di

Nella parte centrale c’è il nucleolo, formato per la maggior parte da RNA e da DNA che è anche molto compatto

STRUMENTI CHE CI HANNO PERMESSO DI LAVORARE CON I GENI

COLTURE BATTERICHE

1)

Robert Koch è stato uno dei precursori della biologia molecolare perchè ha studiato e isolato il microbatterio della tubercolosi, grazie a lui abbiamo imparato a lavorare con i

batteri

Le piastre batteriologiche sono anche usate nella clinica

Esempio: esame delle urine

si fa la conta batterica delle urine —> urinocoltura —> seminazione di un piccolo campione di urina su queste piastre e osservare lo sviluppo di queste colonie

Le piastre contengono nutrimenti, un gel (agar, polisaccaride)

Quando abbiamo a che fare con i batteri usiamo la piastra batterica che contiene gel di agar e agarosio (polisaccaride) e proteine

Per formare il gel bisogna farlo scaldare e raffreddare

Inizialmente le catene del gel sono tenute insieme da legami a H (dovuti agli OH dei carboidrati) che sono deboli, ma se ne formano molti la risultante è forte—> struttura stabile e

ordinata (reticolo) —> l’acqua non riesce ad inserirsi

Se alziamo la temperatura si riesce a far entrare l’acqua nelle catene perchè i polimeri si separano—> i polimeri vengono idratati —> danno luogo a una rete di polimeri con buchi

pieni di acqua

L’acqua non si disperde perchè intrattiene moltissimi legami con i polimeri —> qualsiasi cosa intrappolata in queste reti ha difficoltà a muoversi

I nutrienti vengono sciolti nell’ agar per formare il gel

popolazioni clonali

Per ottenere bisogna seminare una piccola quantità di batteri

Le colonie si formano a partire da una singola cellula batterica che è stata seminata —> colonia visibile perchè i batteri faticano a muoversi, rimangono fermi e in superficie

formano mucchetti visibili (non si una l’amido perchè i batteri lo userebbero come nutriente)

clone

La colonia viene chiamata (=popolazione clonale)

Ogni colonia è una popolazione clonale

Cloni = organismi geneticamente identici derivanti da un’unica cellula iniziale

Queste popolazioni clonali permettono a Koch di distinguere diversi batteri

Dopo aver sparso per esempio l’urina, dopo qualche ora si evidenziano colonie, ogni colonia (mucchietto bianco), deriva da una molecola di urina

I batteri che proliferano non si muovono perchè sono intrappolati nella rete di polimero

Luria scopre che i batteri avevano dei geni —> ci sono caratteristiche che si possono evidenziare e trasmettere da un batterio all&rsqu