Biologia Molecolare Completo

Biologia molecolare e molecole informazionali

Nella biologia molecolare ci si occupa delle molecole informazionali a livello molecolare e di come permettono il funzionamento della cellula. Sia DNA che RNA si trovano sempre associati a delle proteine con la cui interazione riescono ad attuare le loro funzioni. Il DNA si deve tramandare a ogni divisione. Nel cromosoma il DNA è impacchettato con gli istoni a formare la struttura della cromatina. Tale impacchettamento diventa un ostacolo all'espressione dei geni. Anche l'RNA è sempre associato alle proteine. Tali interazioni avvengono a tutti i livelli.

Il pre-mRNA, primo step, è la trascrizione, uno stampo di RNA a partire da un tratto di DNA. Si tratta però di splicing, caratterizzato da sequenze introniche (non codificanti) che dovranno essere eliminate attraverso lo splicing. Gli RNA non sono solo quelli messaggeri, ma anche i transfer, i ribosomiali e i piccoli m-RNA vitali per lo splicing. Esistono inoltre altre grandi varietà di RNA. Si ha una discrepanza tra il numero di geni e il numero di proteine, questo è spiegabile attraverso il processo dello splicing alternativa con cui da uno stesso gene si possono ottenere proteine diverse. Quindi non si può parlare di un gene una proteina.

Esperimenti storici

• 1938: Dimostrazione dell'esistenza di un principio trasformante ereditabile. Viene indotta la polmonite nei topi. Si vede che la polmonite è caratterizzata da due tipi di pneumococco, liscio (S: smooth) e ruvido (R: rough). Unicamente il ceppo S è virulento ed in grado di uccidere il topo, mentre quello R no. Dopo che viene iniettato il ceppo S nel topo e questo è morto, si preleva sangue dal cuore e si vede la presenza di ceppo S al suo interno. Ciò ci dice che lo pneumococco si è riprodotto all'interno dell'organismo infettato. Successivamente, si uccide il ceppo S, riscaldandolo ad alte temperature ed esso non è più in grado di uccidere. Quando però si inietta il ceppo R, quello non mortale, che era stato mischiato prima col ceppo S (precedentemente morto per riscaldamento) l'ospite muore. Si rinviene ceppo S all'interno del cuore del topo, ciò indicò che doveva esserci una molecola che induceva la trasformazione del ceppo R in ceppo S. E tale trasformazione è inoltre ereditabile.
• 1944: Riproduce l'esperimento del '38, ma in vitro. Cioè si lisa la cellula e se ne estraggono i suoi componenti e se ne osserva il funzionamento in un ambiente con le stesse caratteristiche della cellula necessario al funzionamento e alla sopravvivenza delle componenti estratte. In questo modo, si cerca di estrarre il "principio trasformante". I batteri S recuperati dal sangue del topo morto, vengono messi in una beuta. Quando i batteri si sono moltiplicati, vengono centrifugati, si prendono le cellule e vengono rotte e se ne prende solo il contenuto. Molti degli enzimi continuano a funzionare anche all'interno della cellula. Si parla di estratto cellulare. Quindi, per vedere se erano le proteine o il DNA a essere coinvolte, si tratta l'estratto cellulare prima con proteasi e lo si inietta e poi con dnasi e lo si inietta al fine di avere un estratto con solo DNA o con sole proteine. E si osserva che il principio trasformante è assente se è assente il DNA.
• 1952: Viene utilizzato un batteriofago T2 (analogo dei virus negli eucarioti) e si vuole dimostrare se fosse il DNA o le proteine a portare l'informazione. Il batteriofago inietta nelle cellule il DNA e si duplica. A un certo punto, la cellula ospite scoppia (si lisa) e vengono liberati altri batteriofagi. Si parla di ciclo litico. Per attuare tale esperimento si attua la marcatura del DNA (andando a marcare l'atomo di fosforo usando un suo isotopo radioattivo) mentre nelle proteine si usa un isotopo dello zolfo (contenuto nella metionina e nella cisteina). La marcatura viene aggiunta nel terreno di coltura dei batteriofagi. Una volta che vengono marcati, vengono fatti infettare dei batteri e si usa il frullatore per far distaccare le capsule dei batteriofagi una volta avvenuta l'infezione. Si avrà così un sopranatante con le capsule e un pellet con le cellule. E si vede che a essere marcato è il DNA che lo si individua nelle cellule infettate.

Struttura e funzioni del DNA

Non sempre è il DNA il materiale genetico, ad esempio esistono i retrovirus dove il carrier dell'informazione è rappresentato dall'RNA! L'RNA può fungere anche da catalizzatore, ossia funge da enzima. Si parla di autocatalitico quando gli introni sono in grado di rimuoversi da soli (mentre solitamente è lo splisosoma).

In seguito all'analisi di diffrazione ai raggi X delle fibre di DNA si dimostrò che:

• Il DNA ha una forma regolare ad elica
• Compie un giro completo su se stessa ogni 34 Å
• Ha un diametro di circa 20 Å
• La distanza tra due nucleotidi adiacenti è di 3,4 Å (10 residui per ogni giro d'elica)
• La densità del DNA suggerisce che esso debba contenere 2 catene polinucleotidiche
• Il diametro costante dell'elica si spiega supponendo che le basi su ciascuna catena siano affacciate verso l'interno con limitate possibilità di combinazione

Chargaff osservò che le basi sono presenti in quantità diverse nel DNA di specie diverse e ne derivò che l'informazione genica è veicolata dalla sequenza di basi. Secondo la regola di Chargaff, le basi Adenina-Timina e Guanina-Citosina si trovano sempre in un rapporto approssimativo all'uno a uno.

Generalità sulla struttura del DNA

• È strutturato in due catene polinucleotidiche antiparallele, ovvero orientate in direzione opposta
• Lo scheletro di zucchero-fosfato è situato all'esterno dell'elica e porta cariche negative sui gruppi fosfato
• Le basi sono orientate verso l'interno e le loro strutture piatte e organizzate in coppie giacciono su un piano perpendicolare all'asse dell'elica, sovrapposte l'una all'altra
• Basi complementari formano appaiamenti specifici mediante formazione di legami a H (2 legami tra A e T e 3 tra G e C)
• Le coppie di basi contribuiscono alla stabilità termodinamica della doppia elica mediante: l'energia che si libera con la formazione delle coppie, interazione tra coppie di basi adiacenti, l'impilamento tramite interazioni idrofobiche tra i sistemi di elettroni delle basi impilate (base stacking)
• Ogni coppia di basi è ruotata di circa 36° intorno all'asse dell'elica rispetto alla coppia successiva (360° in tutto)
• Il legame C-N forma un angolo di 45° con lo zucchero, si delineano così un solco minore (12 Å) e un solco maggiore (22 Å)
• La doppia elica è destrorsa

La doppia elica del DNA è in grado di subire delle piccole modificazioni della sua struttura perché il DNA è associato a proteine. I solchi possono costituire degli importanti siti di interazioni con le proteine.

Nucleotidi e legami nel DNA

I nucleotidi sono l'unità fondamentale degli acidi nucleici e sono costituiti da un pentoso, una base azotata e da un gruppo fosfato. I nucleotidi sono attaccati l'uno all'altro attraverso l'ossidrile in posizione 3' di un nucleotide e il fosfato attaccato al carbonio 5' dell'altro. Si parla di legame fosfodiesterico. Come abbiamo detto lo zucchero con una base forma il nucleoside, se poi si attacca il gruppo fosfato si parla di nucleotide. Si possono legare fino a 3 gruppi fosfato. Il legame tra il primo gruppo fosfato (ALPHA) e il secondo (BETA) e tra il secondo e il terzo (GAMMA), sono legami ad alta energia.

Il beta-D-2-Deossiribosio (perché il C-2 contiene 2 H mentre nell'RNA contiene un OH e un H). I carboni sono numerati da 1 a 5 e i numeri sono utili per dare la direzione al DNA in particolare il 3' e il 5' (si trova fuori dall'anello furanosico, fuori dal piano). La doppia elica di DNA è composta da due catene polinucleotidiche che sono allineate secondo un orientamento opposto. Le due catene possiedono la stessa geometria ma hanno orientamento diverso (una 5'-3' l'altra 3'-5'). Le due catene interagiscono tra di loro grazie all'appaiamento tra le basi. L'adenina di una catena è sempre appaiata con la timina dell'altra, così come la citosina è sempre appaiata con la guanina. L'adenina e la timina si accoppiano in moda tale da formare un legame idrogeno fra il gruppo amminico esociclico sul C6 dell'adenina e il gruppo carbonilico sul C4 della timina. Allo stesso modo il gruppo esociclico NH2 del C2 della guanina può formare un legame idrogeno con un gruppo carbonilico in posizione C2 della citosina. Ugualmente, un legame idrogeno si forma tra il N1 e l'N3 della citosina e tra il gruppo carbonilico in C6 della guanina con l'NH2 esociclico in C4 della citosina. Come si vede: guanina e citosina formano un legame idrogeno in più.

Abbiamo, quindi, lo zucchero-fosfato (lo scheletro) all'esterno e le basi azotate all'interno (per ripararle dall'ambiente acquoso circostante). La DNA polimerasi catalizza l'aggiunta di un nucleotide alla catena in crescita in direzione 5'-3'. Riconosce un gruppo OH libero e catalizza la formazione del legame fosfodiesterico (staccando un pirofosfato che viene eliminato con la pirofosfatasi). I filamenti di DNA hanno un fosfato in posizione 5' e un OH al 3' (come già detto). Solo se i filamenti decorrono in modo anti-parallelo possono appaiarsi correttamente.

Le basi azotate

Le basi azotate sono caratterizzate da anelli aromatici eterociclici e planari. Solo le purine presentano due anelli aromatici. L'adenina è caratterizzata da un NH2 legato al C6, mentre la guanina in C6 presenta un O e NH2 in C2. Questi sono i gruppi responsabili della formazione di legami H (idrogeno) tra base e base. La citosina presenta un O in C2 e un NH2 in C4, mentre la timina presenta un O in C2 e un CH3 in C5. Questi possono fungere da accettori o donatori di legami H.

Fattori che stabilizzano la doppia elica di DNA

• Legami idrogeno fra basi complementari
• Energia di impilamento (stacking) che deriva da: forze di Van der Waals, interazioni idrofobiche
• Effetto delle cooperatività (influenza della sequenza di basi)

Le interazioni di Van der Waals si hanno tra le basi impilate l'una sull'altra. Le interazioni tra le loro nubi elettroniche contribuiscono alla stabilità dell'elica. Infatti, si creano dei dipoli indotti tra le nubi elettroniche. Questo tipo di interazione debole è nota come forza di Van der Waals. Tra una coppia di basi e l'altra, se non vi fosse la conformazione a elica, ci sarebbe spazio per far entrare acqua. Questo causerebbe gravi problemi di stabilità in quanto le basi sono idrofobiche! Le basi per questo sono ruotate di un angolo di circa 34.4°, noto anche come angolo di twist.

Le basi possono esistere in forme tautomeriche diverse. La forma chetonica: O doppio legame col C6 (adenina e guanina presentano maggiore stabilità in forma chetonica). A seconda della forma chetonica/enolica cambia la possibilità di formare un legame H con la base complementare. Se le basi si trovano in forma incorretta si possono verificare delle mutazioni, perché il nucleotide inserito presenta una forma tautomerica diversa. Gli atomi di Ossigeno si trovano nella maggior parte dei casi nella forma chetonica e raramente in quella enolica, allo stesso modo gli atomi di Azoto si trovano quasi sempre nella forma amminica e solo in alcuni casi in quella imminica.

La doppia elica e la sua flessibilità strutturale

• Rotazione attorno al legame fra gli atomi di carbonio 2' e 3' dello zucchero: "sugar pucker"
• Rotazione attorno al legame beta-N-glicosidico: conformazione syn o anti
• Base pair twist
• Base pair roll
• Base pair slide
• Propeller twist

Sugar Pucker: lo zucchero è un anello furanosico che per motivi sterici non ha una conformazione completamente planare. Visto che C1'-O4 sono fissi, si può avere che i carboni 2'-3' / 3'-4' si spostano verso l'alto o verso il basso fuori dal piano della molecola per motivi sterici. Lo spostamento fuori dal piano del 2' o 3' può avvenire nella stessa direzione del C5 e si parla di Endo-Pucker oppure avviene nella direzione opposta e si parla di Eso-Pucker. La prima è la conformazione più stabile. Questo spostamento ha come conseguenza la diversa disposizione dello scheletro zucchero-fosfato che vanno a trovarsi a diversa distanza tra loro. Se in una catena abbiamo fosfati più vicini o più lontani tra di loro, andranno a variare anche le interazioni tra il DNA e le altre componenti. I fosfati hanno un ruolo chiave nelle interazioni del DNA. La rotazione intorno al legame beta-glicosidico può avere una configurazione syn oppure una configurazione anti. La citosina per motivi sterici può stare solo in anti.

Gradi di libertà delle basi

Si vanno a considerare una coppia di basi come un singolo oggetto. Si può descrivere la sua posizione in base a sei variabili o gradi di libertà (3 rotazioni e 3 traslazioni). Nel DNA sono possibili solo 3 gradi di libertà: base pair twist, base pair roll, base pair slide. L'entità di questi spostamenti dipende dalle basi.

• Base pair Twist: una coppia di basi ruota rispetto a quella adiacente lungo l'asse dell'elica. L'angolo di twist può variare in base alla sequenza da 20° a 50°. Una determinata molecola di DNA non è mai perfettamente e planare, l'angolo di svolgimento dell'elica dipende dalle specifiche basi nucleotidiche presenti e riflette le differenti sovrapposizioni di ciascuna base nucleotidica.
• Base pair Roll: rotazione lungo l'asse longitudinale della coppia di basi rispetto all'asse dell'elica. Porta le basi a non essere perfettamente parallele, ma ognuna ruota rispetto all'altra (l'angolo può variare da +20° a -10°).
• Base pair Slide: traslazione o scivolamento di una coppia di basi rispetto a quella adiacente (lo slide può variare da +3Å a -2Å).
• Propeller Twist: le due basi di una coppia non sempre giacciono sullo stesso piano, ma possono mostrare una rotazione dell'una rispetto all'altra attorno all'asse trasversale della coppia di basi, rendendo il tutto una struttura dinamica. Le basi tendono a ridurre al minimo il contatto con l'acqua. Ruotano in direzione opposta, aumentando la superficie di sovrapposizione. Gli angoli di twist variano a seconda della sequenza di basi. Le coppie A-T hanno un angolo di propeller twist maggiore perché possono formare un legame H con la T della coppia di base adiacenti (nonostante le coppie A-T siano quelle più facili da rompere perché hanno un legame H in meno rispetto alla coppia C-G).

La configurazione definitiva della doppia elica è data dalla somma di tutti questi momenti. Le proteine possono favorire o sfavorire l'acquisizione di una particolare struttura. Le sequenze A-T sono le più mobili, possono anche piegare il DNA (bending). Ci sono fattori di trascrizione che riconoscono questo bending.

Diversi tipi di eliche

Abbiamo anche diversi tipi di eliche: A, B, Z. La Z presenta una forma più allungata ed è sinistrorsa, mentre il A è più schiacciato, mentre il B è quello che si trova più comunemente. La forma B si trova in condizioni di alta umidità con un solco maggiore ampio, e un solco minore piccolo. E ha 10 basi per giro. La forma A, si osserva in soluzioni con minore contenuto di acqua, ha 11 coppie di basi per giro, il suo solco maggiore risulta essere più stretto, mentre quello minore più largo. Variano anche il passo dell'elica, il diametro e l'angolo di twist.

Il DNA-Z è costituito unicamente da sequenze di C-G alternate, tale forma è causata non solo dal tasso di umidità ma anche dalla concentrazione di ioni monovalenti. Se è presente ad esempio NaCl, questo interagirà con le cariche negative dei fosfati. Come abbiamo detto prima, la C può avere solo la configurazione anti, mentre la G alterna conformazione syn con quella anti. Variando la conformazione, varierà anche la distanza dei fosfati. C e G tendono a ruotare di 180° per avere una configurazione syn, ma poiché C non può andare in syn viene attuato lo sugar pucker per mantenere la configurazione anti. Ciò causerà un avvolgimento levogiro. È proprio questa alternanza di configurazioni Syn-Anti a causare l'andamento a zig zag o Z dell'elica di DNA. I sali si legano ai fosfati per neutralizzarne la carica e evitare effetti repulsivi. Esistono proteine in grado di riconoscere il DNA Z. Esistono sequenze cruciformi.

RNA e differenze con il DNA

L'RNA rappresenta il materiale genetico di molti virus. L'RNA nasce e rimane come un singolo filamento, esso in realtà non rimane lineare ma, per motivi di stabilità, cercherà il più possibile di ripiegarsi su se stesso. L'RNA, dunque, differisce dal DNA perché è costituito da ribosio e non da 2-deossiribosio in quanto ha un ossidrile in 2', poi invece della timina è presente l'uracile, e infine esso è una singola catena polinucleotidica. L'RNA nonostante sia un singolo filamento, presenta diversi tratti a doppia elica; questo perché molto spesso si ripiega per formare coppie di basi fra sequenze complementari.