Biologia Molecolare Completo

EUCARIOTI

5'CAP-5'UTR-AUG-STOP-3'UTR-POLY-A

Negli eucarioti l'interazione con la subunità minore inizia dal cappuccio di 7-metilguanosina che si trova a una certa

distanza dall'AUG. Il ribosoma attua un meccanismo di screening ( si muove sull' RNA ). Il ribosoma-sub minore si

lega al cappuccio e si muove fino a che non trova AUG ( quella che contiene AUG è detto sequenza di Khozar ).

eIF-4

Una proteina, di quelle coinvolte nel riconoscimento, e affine al CAP e si chiama ( fatta di quattro subunità A,

E, G ). Le 5'-UTR possono variare la propria lunghezza, l'eIF4 è coinvolto nello screening.

Se il 5'-UTR è lungo, può formare degli stem loop che possono rallentare l'attività del ribosoma, per cui le IF4 A e B

hanno attività RNA-elicasica. IF4-G lega altre proteine coinvolte nell'inizio.

Il codice genetico mette in correlazione nucleotidi con amminoacidi. 1 smminoacido : 3 nucleotidi.

Sistema di traduzione cell-free ( vedi libro / appunti deborah )

Tripled Banding Assay

Si prendevano i ribosomi e i tRNA caricati con amminoacidi radioattivi ( ossia marcati con radioattivo ) e le triplette

( tutte le 64 possibili ), si mescolavano in tutte le possibili combinazioni. Si formavano dei complessi e venivano

filtrati su nitrocellulosa, questa tratteneva il complesso tRNA + ribosoma. Se si trovava della radioattività sulla

nitrocellulosa voleva dire che quel tRNA aveva formato il complesso e così si assegnò a ogni gene una specifica

tripletta.

Più codoni che specificano per lo stesso amminoacid differiscono solo per la terza base, gli amminoacidi " sinonimi

" sono il risultato di un'evoluzione per minimizzare gli effetti delle mutazioni. Molte volte un cambiamento della prima

base porta ad amminoacidi che hanno le stesse caratteristiche.

Esistono tRNA diversi, con anticodoni diversi, ma che specificano per lo stesso amminoacido e quindi sono detti

isoaccettori.

i tRNA accettori sono caricati dalla stessa amminoaciltransferasi.

Teoria del vacillamento ( Wobbling )

Un tRNA solo può riconoscore più codoni, la prima base dell'anticodone ossia quella in 5' è notevolmente " mobile "

rispetto alle altre e può quindi legarsi a codoni diversi. Nella prima porzione dell'anticodone può essere presente

anche una base modificata, variando così la possibilità di fare legami H.

Questo vacillamento , dunque , avviene nella posizione 5' dell'anticodone, dove c'è un'ansa con maggiore

possibilità di movimento mentre le altre sono maggiormente impilate e quindi più impossibilitate a muoversi.

4- taeuridina inosina

Esempi di basi modificate : ( un Uracile con S invece dello N ), poi l' che può appaiarasi con le

altre tre basi dell'anticodone.

Il codice genetico è uguale in tutti gli organismi, eisstono pochissime eccezioni ( soprattutto nel codice genetico dei

mitocondri ).

Ad esempio UGA nei mitocondri traduce per il triptofano invece di essere un codone di stop.

Ci sono anche codoni di inizio rari ( perchè non iniziano con AUG ), ad esempio nei procarioti GUG, UUG, AUU

( comunque traducono sempre per la metionina ).

Seleno Cisteina: detto anche il 21° amminoacido catalizza reazione di ossido-riduzione, viene inserito in

formato deidrogenasi .

corrispondenza di codoni di stop ( UGA ). E' stato studiato nella

selC-tRNA ( il cui anticodone è ACU , un codone di stop ), altri sel A, D, B codificano per enzimi per la sintesi di

Selenecisteina ( che deriva dalla serina ).

Vedi su libro/appunti come viene sintetizzata

Mutazioni

- mutazioni missenso

- mutazioni nonsenso

- mutazioni frameshift

Reversione : la stessa base viene modificata ( cerca miglio definizione su libro appunti )

Sopressione Intragenica: avviene un'altra mutazione nello stesso gene

Sopressione Intergenica: avviene una mutazione in un gene diverso ma che annulla la precedente mutazione

( spesso avviene sul gene per il tRNA ? )

Eventi Co/Post- Traduzionali ( vedi su appunti debora / appunti )

Si tratta della variazione dei livelli di espressione in relazione alle necessità della cellula.

Ci sono meccanismi di regolazione anche a livello dello splicing ( attraverso la variazione del tipo di splicing ).

Una parte della proteina , ad esempio, può essere fosforilata. La quantità di un certo mRNA dipende dall'equilibrio

tra sua produzione e sua degradazione.

I primi studi , riguardo la regolazione dell'espressione genetica, iniziano dal 61' a opera di Jacob e Noden, che

studiano E. Coli. In particolare, ne studiano il metabolismo ( la sua crescita in presenza di diversi zuccheri :

galattosio, maltosio ecc. ) Fecero degli esperimenti servendosi di mutanti ( ottenuti sottoponendo i batteri a riaggi

UV ), e studiarono la beta-galattosidasi in questi mutanti. Arrivarono a distinguere nel genoma di E. Coli, 2 tipi di

trans-agenti cis-agenti. geni strutturali geni regolatori.

sequenze che codificavano per prodotti e Poi , individuarono e

La regolazione avveniva per interazione tra proteine trans-agenti e sequenze cis-agenti.

Studiano l'utilizzo del lattosio da parte di E. Coli e sappiamo che i geni sono organizzati in tandem ( operoni );

codificano , cioè, per geni che hanno funzioni corrrelate tra di loro.

Operone Lac;

In particolare, lo studio riguarda l' i geni che ne fanno parte sono espressi tutti assieme, l'intero

operone costituisce una unità di trascrizione. Gli operoni sono organizzati come un'unica entità quindi c'è un unico

promotore e un unico terminatore; poi ogni gene ha una sua sequenza di riconoscimento dei ribosomi ( RBS ? ).

O operatore

E' presente una sequenza definita detta ( ossia i geni strutturali, che codificano per proteine

R geni regolatori

enzimatiche ). Poi una sequenza che sta per i che codificano per proteine che sono in grado di

Lac1

regolare l'espressione dell'operatore. Nel caso dell'operone Lac, ha funzione inibitrice. codifica per il

CAP LacZ LacY

repressore, seguito da un sito di legame ( ). Sull'operone sono in tandem ( beta-galattosidasi ),

LacA

( permeasi, fa entrare il lattosio ma anche altre molecole in quanto non è selettiva ), ( va a rimuovere alcuni

trigalattidi basici che entrano per errore insieme al lattosio, in quanto come detto la permeasi non è selettiva ).

Si studio, nelle cellule, la quantità di beta-galattosidasi e quelle del suo mRNA, si vide che la traduzione di essa non

avveniva sempre; infatti in presenza di glucosio o non avveniva la sua sintesi o era prodotto a un livello bassissimo

( livello basale ). Accadeva il contrario in caso della presenza di lattosio. Nel momento in cui veniva introdotto

lattosio , la beta-galattosidasi veniva prodotta ( tradotta ) a livelli più elevati. Quindi l'operone del lattosio veniva

"indotto " a funzionare.

L'operone del lattosio , normalmente, si trova in uno stato inespresso, lacI ( in presenza di glucosio ) bloccava

l'operatore, quando era presente il lattosio l'operatore veniva indotto.

Quello che si lega al repressore è l'alolattosio ( il suo legame è catalizzato dalla beta-galattosidasi stessa che

comunque viene prodotto a uno stato basale, sufficiente per attivare la permeasi e fare entrare il lattosio ).

Si aprla di regolazione negativa, perchè inizialmente ci si trova in uno stato represso.

Esperimenti

Trovarono mutanti con beta-galattosidasi costitutiva, che veniva sempre espressa anche in presenza di glucosio.

C'era dunque una qualche mutazione. Crearono cellule di E. COli parzialmente diploidi inserendo dei plasmidi

contenente l'operone Lac. C'erano alcuni mutanti in cui la B-Galattosidasi era mutata e altri in cui non lo era.

Quindi potevano esserci due possibili mutazioni : a livello dell'operatore o a livello del repressore.

Inserendo la copia di plasmide senza mutazioni, operatore e repressore funzionavano normalmente. cis-

I mutanti , nonostante avessero una copia normale, l'espressione costante rimaneva e quindi era detta

dominante questo per mutazioni a livello dell'operatore

( ).

Invece se manca il repressore, ma viene aggiunta una seconda copia del plasmide, quest'ultima può sintetizzare un

mutazione per complementazione (

repressore che possa agisre al posto di quello mutato. Si parla di o di cis

recessiva- trans-dominante ).

Regione regolativa dell'operone Lac

La sequenza del repressore si trova a cavallo della posizione +1. Sito operatore, due sequenze palindrome,

operatore Lac è formato da due metà-sito; quindi si legherà come un dimero. L'induzione: ( perchè il repressero non

regolazione allosterica

è più in gradi di legare il DNA, si parla di ), l'induttore ( l'alolattosio ) si lega nella parte centrale

del repressore modificandone i linker che legano i repressore al DNA: Si è visto, più avanti, che ci sono 3 operatori e

che il repressore può legare due operatori assieme attraverso una tetramerizzazione.

Il promotore che dirige la trascrizione è un promotore debole, quindi per avere una trascrizione efficiente c'è bisogno

CAP attivatore trascrizionale

del legame di una proteina ( ) che si lega alla omonima sequenza.

Se sono presenti glucosio e lattosia, c'è solo una piccola trascrizione di beta-galattosidasi ( prorprio perchè

promotore debole ), quando c'è solo il lattosio , si lega la proteina CAP alla seuquenza omonima e la RNA polimerasi

si lega attivando la trascrizione della beta-galattosidasi. La CAP può legare il DNA solo se manca glucosio e si lega

all'AMP-ciclico. Se c'è il glucosio l'adenilato ciclasi è inattivo, se non c'è si attiva e produce adenilato ciclasi che

produce cAMP.

La CAP, quindi contribusice a reclutare la RNA polimerasi.

L'attivazione può essere di due tipi:

( prima ricordiamo che il controllo di tipo negativo è tipico dei procarioti mentre quello positivo è tipico degli

eucarioti ).

- Attivazione per mezzo del reclutamento dell' RNA polimerasi, la proteina CAP si lega a ACP e costituisce

un'interazione sito di legame per l'RNA polimerasi.

- Attivazione allosterica in cui l'RNA polimerasi si lega al promotore ma non riesce a causare il passaggio da

compleasso chiuso a complesso aperto. In questo caso allorea c'è un'attivazione allosterica, l'attivazione provoca

un cambiamento conformazionale nella RNA polimerasi per far formare il passaggio da compelsso chiuso a

complesso aperto.

Attivazione allosterica

es. NtrC

cambiamento a causa della [ N ], una proteina è una proteina regolatrice per i geni coinvolti nel

metabolismo dell'azoto ( N ). NtrC in caso di bassa concentrazione di azoto viene fosforilato e si lega alla seque