Biologia molecolare - cenni per passare lo scritto

PER RILASSARE IL DNA SUPERAVVOLTO USERò ENZIMI :

TOPOISOMERASI 1: che è caratterizzata dalla rottura di un filamento e

- variazione del numero di legame topologico di un unità per volta .

Lavorano con Dna sup – non usano energia (no atp) , mentre uno subisce

rottura l’altro dira intorno , catalizza anche la richiusura. REAZIONE DI

TRANSESTERIFICAZIONE in cui i legami fatti e rifatti sono di pari energia .

Meccanismo

-Rompe legame fosfodiestere tra 3’OH-> 5’P  Questo si lega

momentaneamente ad una tirosina dell’enzima la cui attività è della

nick–closing.

È un legame di tipo covalente

Possibili attività della classe 1 : - svolge il DNA

-svolge i nodi del DNA a singoli filamenti così da permettere la

formazione della doppia elica

- unisce due DNA a singolo filamento superavvolgimenti opposti .

Di solito si usa per mantere questa classe enzimatica è utilizzata per

ottenimento in vitro di DNA sup negativamente .

1) dna plasmidico (tratt con EtBr)  SUP +  tratto con topo 1  circolare

 sp –

-TOPOSOIMERASI II : agiscono introducendo rottura su entrambi i fila e

passando un elica sotto l’altra ; necessita di energia per funzionare ,

svolgono e riavvolgono il DNA , non sono dnasi perché sostituiscono il

legame che rompono con un nuovo legame, successivamente dopo una

fase di rilassamento , succ si va a riformare il legame fosfodiestere .

Meccanismo : dipende da ATP , tetramero di sub A (2) E B (2) . E’

costituita da due subunità A che creerà il legame tra p5’ e la tirosina

necessaria per creare l’intermedio , B legherà il dna da far passare sotto

così ds creare il NODO (sup) , rompe il filamento del DNA legato in A , fa

passare al di sotto il fil megato a B e richiude l’elica .

In laboratorio è usato per rompere la DS in due punti , è inibita dagli

antibiotici .

Si possono ulteriormente classificare in A E B . Nei batteri sono la forma A

il 5 ‘ P .

Negli eucarioti sono IA, IB , IIA, IIB , di cui IB è fondamentale sia in sup +

che - ,è essenziale nei processi di trascrizione e replicazione -> regola la

cromatina .

Le topoisomerasi poi possono concatenare o deconcatanare molecolare

circolari di DNA . Sono dette concatenate quando due molecole di DNA

circolare passano l’una dentro l’altra come due anelli di una catena. La

deconcatenare ovviamente è opera della topoisomerasi II . Negli eucarioti

poi vanno a svolgere le due molecole figlie l’una dall’altra così da

permettere la separazione dei cromosomi fratelli durante la mitosi che

altrimenti verrebbe bloccata .

DIMENSIONI GENOMA : Lo studio sulla lunghezza del DNA di quel dato

organismo è correlato alle cinetiche che possiamo ottenere tramite il

processo di denaturazione e rinaturazione del DNA di interesse.

Il tipo di denaturazione prediletta è quella a caldo, poiché è stato

dimostrato che la denaturazione a freddo crea dei cristalli sui due

filamenti , provocando rottura e perdita di essi. Il dna inizialmente sarà

frammentato in sequenze di massimo 400-500 bp tali da dare

cooperatività ; denaturando la molecola si otterrà per aumento

dell’effetto ipercromico aumento di assorbanza , rilevabile mediante lo

spettrofotometro . L’effetto ipercromico è dato da esposizione delle

componenti cromofore (le basi azotate) che farà aumentare di molto

l’assorbanza.

La temperatura di denaturazione sarà 100° , ma si farà scendere ad una

temperatura costante al di sotto del valore di Tm (tempo di melting ,

tempo al quale metà del dna sarà denaturato e metà no) , di circa 10-15

° .Il DNA sintetico denatura a circa 40-50° .

La cinetica sarà :

La Rinaturazione è la fase più delicata che dipenderà dal tempo e sarà

differente a seconda degli organismi. Può accadere che per necessità

biologiche alcuni organismi si rinaturino in tempo molto più breve in

quanto non hanno necessità di accuratezza di riappaiamento.

Tm = 69,3 ° C + 0,41°( %G+C)

(per molecole corte meno di 20 nucleotidi questo valore varierà non

essendoci cooperatività)

L’ordine di denaturazione sarà il seguente : AT+ , AT-, CG+.

La cinetica di rinaturazione è definita come

d C / dt =-kc2 .

La cinetica di un singolo filamento sarà sostanzialemnte –d C /c al 2.

Integrando t=0 e c=c0 sarà : C/C0=1/1+KCot .

Ma andremo a considerare il valore a metà reazione di C0T1/2= 1/K .

Se la cinetica K è > la velocità di rinaturazione sarà magg; se è < invece

la velocità di rinaturazione sarà minore.

La complessità: è definita come il valore minimo della sequenza ripetuta.

Solitamente la complessità dipende dalle dimensioni del genoma e posso

definirla come

C0T1/2 (DNA studiato)/C0T1/2 (dna e.coli)= compl(dna studiato /

4,2x10 alla 6.

Si usa come parametro E.coli ma esiste anche un altro paramento di

complessità che è X = AC0t1/2 dove A è una costante e vale 5x10 alla

6.

Nei procarioti la curva di denaturaizone è rinaturazione avrà un

andamento sigmoide . Grafico

y->ass a 280 OD ; x-> t(°c) .

Negli eucarioti invece la cinetica di rinaturazione è più complessa , in

quanto non è espressa da una singola sigmoide bensì da tre curve che

sono descritte da 3 cinetiche , e da 3 complessità differenti.

Avremo una cinetica legata alla componente veloce, una intermedia ed

una lenta .

La veloce è rappresentata da circa il 25% del genoma , l’inter dal 30% e

la vel dal 10 % .

Il grafico è fatto y -> frazione riassociata (1-c/c0)

x->C0t.

Se dobbiamo studiare la complessità di ogni sequenza ,dovremmo

considerare vari fattori:

Se è unica la complessità Nnr(non ripetuta) è uguale alla dimensione di

- quella frazione alfa del genoma

Nnr= alfa x G.

Se invece è una sequenza ripetuta dalla dimensione di quella frazione

- beta del genoma bisogna tener conto della frequenza di ripetizione della

frazione

Nr= beta x G/F.

Possiamo ricavare la complessità moltiplicando il C0t1/2 osservato per quella

sequenza, per la porzione di riassociazione di riferimento (coli) :

Nnr: alfa (C0t1/2 nr x 4,2 x 10 alla 6/C0t1/2 coli)

- Nr : beta( C0t1/2n x 4,2x10 alla 6 /C0t1/2)

-

Confrontando le due equazioni possiamo ricavare una formula per calcolare le

dimensioni genomiche del genoma G : G= C0t1/2 nr x 4,2 x 10 alla 6

/C0t1/2 coli-> vale 1000)

e possiamo anche calcolarci la frequenza di ripetizione

facendo : G/ F = C0t1/2 x 4x10 alla 6 /cot1/2 coli e se g è uguale a sopra

otterrò

F= C0t1/2 nr/C0t1/2 r.

Rapporto densità genica –complessità dell’org

PARADOSSO K -> N DI CROMOSOMI uomo 46 lisandra atl 250)

PARADOSSO N -> n DI GENI uomo 21000 riso 60000

PARADOSSO C -> quantità di DNA contenuto nel nucleo

Infine si è considerata la densità genica che è rappresentata dalla quantità di

geni in un megabase di dna genomico: se ad esempio un organismo avrà 5000

geni ed un genoma di 50 MB la densità sarà di 100 geni /mb .

Ma le densità geniche più elevate le ritroviamo proprio in organismi più

semplici come ad esempio virus ; mentre densità geniche più ridotte sono

riscontrate negli eucarioti. Addirittura tra gli eucarioti minore è questo

parametro maggiore sarà la complessità dell’organismo.

Nel dna eucariotico infatti oltre ai geni ci sono delle zone cosi dette non

codificanti “introni”, che successivamente verranno trascritti in pre-Rna ma poi

nel processo di maturazione che attiva il medesimo , verranno rimossi.

È stato dimostrato infatti che solo il 5% del DNA di un gene è rappresentativo

della parte codificante la proteina , il restante 95 % è costituito da introni.

Genoma umano : è costituito nel 60 % da geni mutati, frammenti di geni e

PSEUDOGENI(quest’ultimi provengono dall’integrazione di prodotti

retrotrascritti dell’mRna.

Altra caratteristica è la presenza di sequenze ripetute ; DNA microsatellite , è

formato da sequenze molto corte (<13 bp) ripetute in tandem (il più comune

CA rip in tandem) .

Satelliti , si trovano per lo più nei talomeri composti da 25 bp . Il cromosoma Y

è costituito quasi interamente da sequenze ripetute.

Nucleosoma : è costituito da un core di otto proteine istoniche e da dna avvolto

intorno a questo nucleo proteico. Gli istoni sono H2a , H2b, H3, H4 ,H1 e il dna

non avvolto che collega un nucleosoma all’altro è chiamato LINKER . Il

compattamento del DNA in nucleosomi è solo il primo step di compattazione.

Gli istoni H2A, H2B e H3, H4 costituiscono il core o anche detto ottamero

istonico , in quando H2A E H2B costituiscono dimeri e stop , e H3-H4 formano

eterodimeri e danno un tetramero .

H1 invece ha funzione di legame del DNA linker , è ricco di K , ed è

rappresentato tra le prot tot al 50 % , è fosforilato 4 volte nelle mitosi e

defosforilato in fase G1. Oltre a questa funzione ha anche quella di bloccaggio

per l’attacco d aparte di enzimi.

La formazione dei nucleosomi da vita alla struttura cosi detta cromatina.

Sono tutti basici : quindi ricchi di aa basici, il 20 % è rappresentato da lisina e

arginina.

Sono formati da una regione conservata che viene chiamata DOMINIO HISTONE

FOLD. Sono formati da 3 regioni alfa elica separate da 2 sequenze non

strutturali.

Associazione prima H3-H4 legano il DNA -> poi H2a,H2b e infine H1chiude un

po’ il dna legando le eliche che crea angolo di entrata e di uscita del DNA dal

nucleosoma.

L’assembraggio viene fatto tramite chaperonine istoniche dette ASF , NAP 1 ,

CAF1 . La prima trasporta i tetrameri H3-H4 fino alle CAF1 che le posiziona al

centro del nucleosoma , mentre NAP1 si occupa del trasporto di H2A,H2B

all’interno dei nuovi nucleosomi. Nel caso di replicazione di DNA , verranno

conservate il 50 per cento anche degli istoni e aggiunte ex novo solo il restante

50 per cento. Ma poiché metà sono nuove quindi non acetilate ci sarà bisogno

di enzimi che vadano ad acetilare i nuovi istoni (di norma l’acetilazione avviene

sempre su H3-H4).

Le code istoniche sono molto importanti per la stabilizzazione della struttura a

fibra , da recenti studi si è visto come l’interazione tra estremità

amminoterminale carica + di H4 e la regione carica – del dominio HISTONE