Biologia molecolare - cenni per passare lo scritto

Acidi nucleici, ribosio, deossiribosio e sequenza di 3-4 nucleotidi

Studi legati al DNA

1) La composizione in basi del DNA varia da specie a specie.
2) Le molecole di DNA isolate da tessuti diversi di uno stesso organismo hanno la stessa composizione.
3) Nella molecola di DNA, indipendentemente dalla specie, il numero di AT ed il numero di CG è uguale.

Nel 1953, grazie alla diffrazione a raggi X, Watson e Crick proposero un modello tridimensionale della struttura di DNA destrogira elicoidale.

Legami del DNA

- Legami H tra purine e pirimidine (stesso piano)
- Tra basi azotate e zucchero legame glicosidico
- Tra basi azotate e acido fosforico legame fosfodiesterico

Nucleotide = zucchero + base + gruppo fosfato

Nucleoside = zucchero + base

Conformazioni del DNA

Le conformazioni possono essere sin o anti. Dipenderà dal modello di DNA in atto. Infatti, studiandolo, si sono identificati 3 modelli:

• B: Destrogiro, filamenti antiparalleli, basi azotate non allineate ai 2 zuccheri a cui sono unite ma proiettate in avanti formando angoli di 50° o 60°. Questo determina due solchi, uno maggiore ed uno minore. Tra basi intercorrono forze di van der Waals. Forma maggiormente presente nella cellula, ma in soluzione sarà leggermente più avvolto. 10.5 paia per giro.
• A: In soluzione con forza ionica elevata o con umidità sotto il 75% si ha questa conformazione. 11 paia per giro, solchi meno accentuati e le basi sono inclinate rispetto al piano dell’asse. Forma tipica dell’etero duplex.
• Z: Elica, osservata da Alexander Rich mentre studiavano la conformazione B. È a zig-zag, si trova solo con successioni CG o AT. Si forma rotazione del legame n-glicosidico con la guanina da anti a sin. Qui infatti c’è alternanza tra anti e sin.

Il DNA è una molecola flessibile ed i parametri che lo caratterizzano sono in funzione sia delle condizioni ioniche dell’ambiente sia della natura delle proteine che interagiscono con esso per formare complessi nucleoproteici.

DNA circolare e lineare

Il DNA circolare ha una forma che è topologicamente definita, tanto da essere definito circolare covalentemente chiuso cccDNA. Il DNA lineare, invece, poiché non è chiuso, sarà in continua variazione di costrizioni topologiche per via dell’impacchettamento sotto forma di cromatina e l’interazione con altri componenti cellulari.

Proprietà topologiche del DNA

L (linking number) = Il numero di volte (in un cccDNA) che un filamento viene passato attraverso l’altro affinché le due catene possano separarsi l’una dall’altra; è sempre un numero intero ed è una proprietà invariante del cccDNA qualunque sia la struttura geometrica della molecola. Ha due componenti: Twist e Writhe (è la loro somma).

T (twist) = Il numero di volte che un filamento gira intorno all’altro, uguale al linking se consideriamo un cccDNA a struttura planare che giace su di un piano. Si calcola il twist contando il numero di volte in cui un filamento passa sull’altro.

W (writhe) = La cccDNA non è planare ma ha delle tensioni torsionali; l’asse longitudinale della doppia elica si incrocia su se stessa, a volte anche ripetutamente determinando una struttura tridimensionale. Questo incrocio è definito writhe.

• Plectonemico (o interwound): L’asse longitudinale della doppia elica è avvolto su se stesso.
• Toroide (spirale): L’asse longitudinale è avvolto intorno al cilindro e si ha quando il DNA si avvolge attorno a una proteina.

Quindi writhe rappresenterà il numero di incroci dell’asse longitudinale su se stesso e/o il numero di spirali del cccDNA.

Relazione tra i tre: L = T + W

C’è anche un valore L° = È il linking number del cccDNA completamente rilassato in condizioni fisiologiche, il suo twist sarà di circa 10.5 basi per giro d’elica.

Se ho, ad esempio, un cccDNA di 10500 coppie di basi: L = 10500/10.5 = +1000

Il DNA nella cellula è sup - negli eucarioti; la struttura dei nucleosomi altro non è che un toroide o spirale, la quantità di sup di un cccDNA è come la differenza tra L e L°: ΔL = L - L°; se ΔL > 0, sup +; se ΔL < 0, sup -.

Densità di superelica: Sono dipendenti dalla lunghezza del DNA. È più semplice esprimere il superavvolgimento della molecola come densità di superelica per DNA circolari batterici sup-. Sigma = ΔL/L°

Importanza biologica dei superavvolgimenti

Dal punto di vista biologico, ciò significherà che i sup negativi hanno la tendenza a svolgersi localmente permettendo una separazione locale dei due filamenti. Nei batteri termofili, invece, ci sono sup + che si pensa siano stati selezionati dall’evoluzione per proteggere l’informazione genetica. Saranno questi sup+ dei magazzini di energia libera che presentano il DNA.

Per esempio: 3200 bp plasmide rilassato + EtBr → W = +20. Sup passa da 0 (poiché era rilassato) a +20.

Plasmide circolare → L = 32; T = 32; W = 0
Plasmide sup positivamente (da quello lo + del W) → L = 30; T = 10; W = +20

Metodi per rimuovere o introdurre superavvolgimenti

Per rimuovere i superavvolgimenti da un cccDNA non rilassato userò una DNAse 1 che va ad idrolizzare uno o pochi legami fosfodiesterici in ciascuna molecola. Interrompendo il DNA, non sarà più topologicamente costretto e i filamenti possono liberamente ruotare uno rispetto all’altro fino ad annullare il parametro W.

DNA sup con L = 32, T = 36, W = -4 → DNAse
L = 34, TW = 34 e W = 0. Se il nick è riparato, il cccDNA sarà rilassato e verrà L = L°.

Per introdurre superavvolgimenti userò EtBr. Per introdurre sup positivi al cccDNA sup -, tratterò con EtBr, il quale farà variare il coefficiente di sedimentazione (che misura la velocità a cui la molecola precipita in un gradiente di densità). Procederò così: intercalo EtBr che va a variare l’angolo twist → il DNA si rilassa perdendo sup - il coefficiente diminuisce → riaggiungo EtBr darà sup + con un aumento del coeff di sedi.

Rilassamento del DNA superavvolto

Per rilassare il DNA superavvolto userò enzimi:

Topoisomerasi 1

Caratterizzata dalla rottura di un filamento e variazione del numero di legame topologico di un’unità per volta. Lavorano con DNA sup - non usano energia (no ATP), mentre uno subisce rottura l’altro gira intorno, catalizza anche la richiusura. Reazione di transesterificazione in cui i legami fatti e rifatti sono di pari energia.

Meccanismo: Rompe legame fosfodiestere tra 3’OH → 5’P. Questo si lega momentaneamente ad una tirosina dell’enzima la cui attività è della nick–closing. È un legame di tipo covalente.

Possibili attività della classe 1:

• Svolge il DNA
• Svolge i nodi del DNA a singoli filamenti così da permettere la formazione della doppia elica
• Unisce due DNA a singolo filamento superavvolgimenti opposti

Di solito, per mantenere questa classe enzimatica, è utilizzata per ottenimento in vitro di DNA sup negativamente.

1) DNA plasmidico (trattato con EtBr) → SUP + → trattato con Topo 1 → circolare → sp -.

Topoisomerasi II

Agiscono introducendo rottura su entrambi i filamenti passando un’elica sotto l’altra; necessita di energia per funzionare, svolgono e riavvolgono il DNA, non sono DNasi perché sostituiscono il legame che rompono con un nuovo legame, successivamente dopo una fase di rilassamento, succede che si va a riformare il legame fosfodiestere.

Meccanismo: Dipende da ATP, tetramero di sub A (2) e B (2). È costituita da due subunità A che creerà il legame tra p5’ e la tirosina necessaria per creare l’intermedio, B legherà il DNA da far passare sotto così da creare il nodo (sup), rompere il filamento del DNA legato in A, far passare al di sotto il filamento legato a B e richiudere l’elica.

In laboratorio è usato per rompere la DS in due punti, è inibita dagli antibiotici. Si possono ulteriormente classificare in A e B. Nei batteri sono la forma A il 5’ P.

Negli eucarioti sono IA, IB, IIA, IIB, di cui IB è fondamentale sia in sup + che -, è essenziale nei processi di trascrizione e replicazione → regola la cromatina.

Le topoisomerasi poi possono concatenare o deconcatenare molecole circolari di DNA. Sono dette concatenate quando due molecole di DNA circolare passano l’una dentro l’altra come due anelli di una catena. La deconcatenare ovviamente è opera della topoisomerasi II. Negli eucarioti poi vanno a svolgere le due molecole figlie l’una dall’altra cosicché da permettere la separazione dei cromosomi fratelli durante la mitosi che altrimenti verrebbe bloccata.

Dimensioni del genoma

Lo studio sulla lunghezza del DNA di quel dato organismo è correlato alle cinetiche che possiamo ottenere tramite il processo di denaturazione e rinaturazione del DNA di interesse. Il tipo di denaturazione prediletta è quella a caldo, poiché è stato dimostrato che la denaturazione a freddo crea dei cristalli sui due filamenti, provocando rottura e perdita di essi. Il DNA inizialmente sarà frammentato in sequenze di massimo 400-500 bp tali da dare cooperatività; denaturando la molecola si otterrà per aumento dell’effetto ipercromico aumento di assorbanza, rilevabile mediante lo spettrofotometro. L’effetto ipercromico è dato da esposizione delle componenti cromofore (le basi azotate) che farà aumentare di molto l’assorbanza.

La temperatura di denaturazione sarà 100°, ma si farà scendere ad una temperatura costante al di sotto del valore di Tm (tempo di melting, tempo al quale metà del DNA sarà denaturato e metà no), di circa 10-15°. Il DNA sintetico denatura a circa 40-50°.

La cinetica sarà: La rinaturazione è la fase più delicata che dipenderà dal tempo e sarà differente a seconda degli organismi. Può accadere che per necessità biologiche alcuni organismi si rinaturino in tempo molto più breve in quanto non hanno necessità di accuratezza di riappaiamento.

Tm = 69.3°C + 0.41°(%G+C) (per molecole corte meno di 20 nucleotidi questo valore varierà non essendoci cooperatività).

L’ordine di denaturazione sarà il seguente: AT+, AT-, CG+.

La cinetica di rinaturazione è definita come dC/dt = -kc². La cinetica di un singolo filamento sarà sostanzialmente –dC/c al 2. Integrando t=0 e c=c0 sarà: C/C0 = 1/1+KCot.

Ma andremo a considerare il valore a metà reazione di C0T1/2 = 1/K. Se la cinetica K è > la velocità di rinaturazione sarà maggiore; se è < invece la velocità di rinaturazione sarà minore.

Complessità genomica

La complessità è definita come il valore minimo della sequenza ripetuta. Solitamente la complessità dipende dalle dimensioni del genoma e posso definirla come C0T1/2 (DNA studiato)/C0T1/2 (DNA E.coli) = compl(DNA studiato / 4.2x10⁶).

Si usa come parametro E.coli ma esiste anche un altro parametro di complessità che è X = AC0t1/2 dove A è una costante e vale 5x10⁶.

Nei procarioti la curva di denaturazione e rinaturazione avrà un andamento sigmoide. Grafico y→ass a 280 OD; x→t(°C).

Negli eucarioti invece la cinetica di rinaturazione è più complessa, in quanto non è espressa da una singola sigmoide bensì da tre curve che sono descritte da 3 cinetiche, e da 3 complessità differenti.

Avremo una cinetica legata alla componente veloce, una intermedia ed una lenta. La veloce è rappresentata da circa il 25% del genoma, l’intermedia dal 30% e la lenta dal 10%.

Il grafico è fatto y → frazione riassociata (1-c/c0) x → C0t.

Se dobbiamo studiare la complessità di ogni sequenza, dovremmo considerare vari fattori:

Se è unica la complessità Nnr (non ripetuta) è uguale alla dimensione di quella frazione alfa del genoma Nnr = alfa x G.

Se invece è una sequenza ripetuta dalla dimensione di quella frazione beta del genoma bisogna tener conto della frequenza di ripetizione della frazione Nr = beta x G/F.

Possiamo ricavare la complessità moltiplicando il C0t1/2 osservato per quella sequenza, per la porzione di riassociazione di riferimento (coli):

Nnr: alfa (C0t1/2 nr x 4.2 x 10⁶/C0t1/2 coli)
Nr: beta(C0t1/2n x 4.2x10⁶/C0t1/2)

Confrontando le due equazioni possiamo ricavare una formula per calcolare le dimensioni genomiche del genoma G: G = C0t1/2 nr x 4.2 x 10⁶/C0t1/2 coli → vale 1000 e possiamo anche calcolarci la frequenza di ripetizione facendo: G/F = C0t1/2 x 4x10⁶/C0t1/2 coli e se g è uguale a sopra otterrò F = C0t1/2 nr/C0t1/2 r.

Rapporto densità genica e complessità dell’organismo

Paradosso K → Numero di cromosomi uomo 46, Lisandra Atl 250
Paradosso N → Numero di geni uomo 21000, riso 60000
Paradosso C → Quantità di DNA contenuto nel nucleo

Infine si è considerata la densità genica che è rappresentata dalla quantità di geni in un megabase di DNA genomico: se ad esempio un organismo avrà 5000 geni ed un genoma di 50 MB la densità sarà di 100 geni/mb. Ma le densità geniche più elevate...