Biologia molecolare applicata

Le piante

Le piante sono organismi fotosintetici con proprietà di poter usare energia luminosa per sintetizzare zuccheri, ATP e potenziale riducente: non hanno bisogno di una fonte di C: hanno però bisogno di fonte di K, Na, P... quindi elementi minoritari rispetto al carbonio, che è quello maggiormente usato per fare biomassa.

Con "piante" intendiamo diversi organismi fotosintetici che usano un sistema di trasporto degli elettroni unizzando ossigeno come accettore. Le piante superiori sono molto rilevanti industrialmente. Ad esempio, il tabacco fa parte delle angiosperme e viene molto usato perché è facilmente modificabile geneticamente ma anche perché le foglie contengono sostanze che possono essere facilmente purificate.

Le piante sono caratterizzate da cellule vegetali. Queste sono eucarioti e hanno:

• Nucleo circondato da doppia membrana nucleare con pori che consentono il passaggio del materiale
• Il nucleo contiene il genoma diviso in...

le piante superiori sono tipicamente diploidi o poliploidi (molti frumenti sono poliploidi) e contiene un sistema di trascrizione simile a quello animale (3 DNA pol: la 1 che trascrive geni per rRNA, la 2 che trascrive DNA in mRNA) di reticolo endoplasmatico con apparato di Golgi che serve a modificare le proteine che devono essere secrete o inviate agli organelli Mitocondri che servono alla respirazione per processi biochimici specifici dei mitocondri NON ci sono lisosomi ma ci sono grossi vacuoli: provvedono a degradare macromolecole e organelli danneggiati. Nelle cellule vegetali il vacuolo è molto grande coprendo l'80% dello spazio e può fungere da riserva Perossisomi: contengono enzimi che servono a neutralizzare i ROS Ribosomi: presenti sul reticolo RER e liberi nel citoplasma. Sono tipicamente ribosomi 80S differenza fondamentale è la presenza di cloroplasti, che distinguono la cellula vegetale da animale. Sono organi responsabilidella fotosintesi. Il cloroplasto contiene enzimi e tutto l'apparato fotosintetico: qui avviene la fissazione della CO2 e la conversione di energia luminosa in ATP e potenziale riducente NADPH. Inoltre, si ha la presenza di una rete cellulare che non c'è nelle cellule animali (membrana plasmatica di tipo fosfolipidico e matrice, non hanno una parete rigida). Le cellule vegetali sono meccanicamente resistenti per la presenza della parete molto rigida, che può subire modificazioni, modificando anche il modo con cui la cellula si divide: avendo una parete la cellula non si può dividere per scissione ma la divisione consiste nel creare un set divisorio e una nuova parete. La parete è molto spessa ed è composta, almeno nelle cellule vegetali in rapida crescita, da monosaccaridi di cellulosa. Non c'è solo cellulosa ma anche peptidoglicani e pectina. La parete deve essere dinamica quindi modificata in modo tale da consentire la crescita della cellula.cellula: ci sono enzimi che modificano la struttura dell'aparete stessa. Le cellulose sono polimeri del glucosio, dove gli elementi di glucosio sono uniti da legami beta-glicosidici e formano lunghe catene lineari, rinforzati da legami beta 1-4, dando maggior resistenza alle fibre di cellulosa. Altri polisaccaridi sono le pectine: polimeri di acido poligalatturonico. I peptidoglicani sono altri polisaccaridi e contengono monomeri di zucchero (tra cui xilosio). Questi materiali sono presenti in cellule che si replicano. Quando le cellule si differenziano e non replicano più, la parete può subire modificazioni, tra cui presenza di lignina. La lignina è un polimero derivato da fenilpropano ed è un polimero molto complesso: genera una struttura polimerica a rete che dà resistenza meccanica elevata. Quando avviene questa modificazione la parete cellulare diventa così spessa che la cellula all'interno fa fatica ad avere scambi quindi la cellula muore e.

resta la struttura a generare vasi o fibre. La caratteristica fondamentale delle piante è la presenza di cloroplasti. Questi sono organelli di dimensioni simili al mitocondrio quindi nell'ordine di pochi micron. Sono numerosi: ogni cellula contiene decine o centinaia di cloroplasti e sono responsabili del colore verde della piante perché contengono la clorofilla: la clorofilla assorbe la luce nel regione del rosso a dare verde (la clorofilla è anche fluorescente nell'infrarosso).

I cloroplasti derivano da un processo di endosimbiosi: sono di origine batterica, derivano dai batteri fotosintetici verdi chiamati cianoficee.

I cloroplasti contengono un loro genoma, tipicamente circolare dalle dimensioni di 200-500bp e sono genomi presenti in multicopia (ogni cloroplasto contiene circa 10 genomi). I genomi codificano per elementi dell'apparto fotosintetico. Il cloroplasto ha un apparato di trascrizione e traduzione:

• Ci sono RNA polimerasi che generano mRNA e

rRNA 111- Ci sono ribosomi che utilizzano mRNA per sintetizzare proteine. Anche i ribosomi sono di tipo sintetico 70S (simili a quelli di coli) e sono inibiti dagli stessi antibiotici che inibiscono la sintesi proteica nei batteri (ES: cloramfenicolo, tetraciclina…) e questo ha applicazioni biotech.

Il cloroplasto all’interno è strutturato similmente a un mitocndrio:

• Membrana interna
• Strutture lamellari come dei dischi fatti da strutture lamellari sovrapposte detti tilacoidi
• Sui tilacoidi è costruito l’apparato fotosintetico dove si trovano clorofille ed enzimi necessari
• Membrana esterna

Quando arriva la luce il sistema fotosintetico genera un trasporto di elettroni per cui alla fine si genera ossigeno e il potenziale riducente per generare NADPH. Si genera anche un gradiente di protoni sfruttato da ATPasi per generare ATP.

Questi sistemi sono poi usati da un sistema enzimatico che usa CO per produrre zuccheri.

Le cellule vegetali sono totipotenti. Prendendo

cellule di origine animale come i fibroblasti, questi possono essere mantenuti in coltura ma non possono generare un intero organismo. Con gli animali abbiamo al massimo cellule staminali embrionali che possono rigenerare tessuti. Per le piante accade che anche cellule differenziate, come le cellule verdi che fanno fotosintesi e contengono cloroplasti, se opportunamente trattate possono tornare cellule embrionali e rigenerare un tessuto. Con alcuni sistemi, da queste masse di tessuto posso riottenere dalle piante quindi dei germogli e radici totipotenti. È possibile prendendo cellule differenziate adulte farle differenziare, moltiplicare in vitro e poi da queste cellule riottenere di nuovo l'organismo da cui sono originariamente ottenute (piante). Questo processo è chiamato micropropagazione. In vitro posso generare tanti cloni: dal punto di vista genetico questi cloni sono tutti uguali alla pianta donatrice. 1. Prendo un pezzo di foglia opportunamente trattato per renderlo sterile (eliminare microbi e agenti contaminanti).

1. Coltivazione di tessuto vegetale in laboratorio (in vitro) sulla superficie di un terreno contenente nutrienti e fitormoni.

2. Le cellule si differenziano e formano masse cellulari indifferenziate chiamate calli.

3. I calli possono essere coltivati e, se trasferiti su un terreno con opportuni rapporti di ormoni vegetali, in particolare auxine e citochinine, è possibile indurre la formazione di germogli o radici. Se prevalgono le citochinine si ha l'induzione di germogli, mentre aumentando le auxine si inducono le radici.

4. Dai calli è possibile ottenere le piantine.

5. Dopo la prima fase di sviluppo, le piante possono essere trasferite in terreno e generare piante adulte.

Questa caratteristica può essere estesa ai protoplasti, ovvero alle cellule di origine vegetale che vengono mantenute in coltura attraverso un trattamento che consente di eliminare la parete cellulare. La parete impedirebbe una facile coltivazione delle cellule, ma idrolizzandola si permette alle cellule di crescere e svilupparsi in coltura.

Parete con opportuni enzimi si anno cellule prive di parete e che possono essere mantenute anche in terreno liquido fornendo una pressione osmotica adeguata. In presenza di concentrazioni opportune di ormoni vegetali possono proliferare non formando i calli in adesione ma in un liquido come se fossero cellule sospensioni. Possono essere ri-piastrate in presenza di ormoni a generare calli e dai calli come visto precedentemente possiamo generare piante.

I protoplasti sono rotondi: avendo rotto la parete dalla forma quadrata diventeranno tondeggianti. La totipotenza ci consente di differenziare le cellule e poi differenziarle. Possiamo poi avere:

• Una micropropagazione da calli
• Rigenerazione da cellule somatiche

I protoplasti sono stati il primo strumento utilizzato per introdurre DNA in cellule vegetali. È difficile farlo in cellule adulte data la parete difficile da penetrare. I fattori che influenzano la ricrescita e la morfogenesi sono:

1. Temperatura
2. Luce
3. Umidità

Macronutrienti (N, S, Ca, Mg…)- Micronutrienti (Fe, Cu, Co…)- Fitormoni

I fitormoni sono una importante differenza tra animali e vegetali. Anche gli animali usano ormoni, importanti per controllare l’omeostasi e le interazioni. Gli ormoni sono tipicamente proteine (ES: inulina) oppure di origine steroidea.

Le piante utilizzano ormoni semplici: fitormoni.

• Citochinine
• Auxine
• Etilene

Responsabili della capacità di formare dei calli e di indurre radice e germogli. Se non ci sono ormoni nel terreno le cellule non sono totipotenti. In presenza di ormoni si sdifferenziano e ho i calli. Cambiano i rapporti tra citochinine e auxine induco radice e germogli.

Le auxine sono derivate dal triptofano attraverso processi semplici arrivano all’acido endol acetico (che è l’auxina).

Le citochinine sono derivate dall’adenina la quale però presenta una modifica che può essere l’aggiunta di un gruppo isopentenilico. La isopenteniladenina

è la citochinina più diffusa. Altra molecola molto importante è l’etilente (gas): idrocarburo insaturo molo semplice. Prodotto dalle piantee serve per la maturazione dei frutti.

TRASFORMAZIONE DEI PROTOPLASTI:

La parete è un ostacolo insormontabile. Quindi i primi esperimenti di trasformazione sono stati fatti con protoplasti perché non presentano la parte: con shock osmotico si destabilizza la membrana plasmatica permettendo l’ingresso del DNA.

- Si fa un trattamento con PEG (polietilen glicole): a concentrazione elevata genera una sorta di shock osmotico generando dei danni sulla membrana plasmatica consentendo l’ingresso di DNA nelle cellule. La tecnica più comune è quindi usare PEG.

- Un’altra tecnica è l’elettroporazione: funziona su cellule di mammifero e batteri e ovviamente anche su cellule vegetali. Si dà un impulso elettrico che genera pori transienti. L’efficienza è

nettamente minore rispetto al trattamento chimico con PEG. Con PEG