Biologia molecolare applicata

Biologia molecolare applicata

Modulo 1 – Tecniche utilizzabili per analizzare l’espressione genica

Northern Blot: il punto di partenza può essere analisi su trascritti (una sottopopolazione sono mRNA – in alcuni casi è necessario purificarlo) o RNA totale. Può essere:

• Semplice → che ci permette di dire se c’è o meno il trascritto e di determinare il peso molecolare
• Relativa → permette di dire se il trascritto è più o meno rispetto ad altri o all’interno dello stesso campione (varia a seconda del tessuto, condizioni…) ci sono trascritti rari e altri abbondanti

RT-PCR: retro-trascrizione abbinata alla PCR (amplificazione). Può essere:

• Semplice → c’è o meno il trascritto, con vantaggi di sensibilità rispetto alla Northern e non mi dà la possibilità di definire il peso molecolare
• Relativa → ci permette di dire se ci sono variazioni all’interno dei trascritti

PCR quantitativa → PCR non convenzionale, la struttura è analoga ma occorre fare un'amplificazione in modo quantitativo così che ciò che viene amplificato possa dare precise informazioni sul templato iniziale, e può avvenire solo seguendo specifici principi. Il concetto di PCR quantitativa è lo stesso che troviamo nella RT-PCR competitiva.

• Competitiva: retro-trascrizione in presenza di un competitore, permette di avere misure della quantità in modo assoluto

NB: RT-PCR e Real Time PCR sono diverse!

Real Time PCR → mi permette di vedere la cinetica di amplificazione. Può essere:

• Relativa
• Assoluta

Ma c’è sempre una PCR in tempo reale con la quale vedo la cinetica di amplificazione.

Saggi di ibridazione standard e saggi inversi

Sono basati su ibridazione, questo presuppone la presenza di una sonda e dei target. Però:

• Standard
  • Northern
  • Southern → I target sono quelli non marcati sul supporto (DNA digerito o RNA). È la sonda ad essere marcata e che sta in soluzione.
• Inversa
  • Array → la sonda non è quella in soluzione e marcata ma le probe sono sui supporti e non sono marcate. I target sono quelli in soluzione e sono marcati.

Northern Blot

Il punto di partenza è RNA che viene estratto da un determinato tessuto o determinate cellule. In alcuni casi è prevista (ma non sempre) la purificazione sull’RNA totale degli mRNA sfruttando la presenza di una coda poli-A (200-250bp). Ci sono degli oligo-dT per cui si fa passare la preparazione di RNA totale in opportune condizioni di ibridazione verranno attaccati tutti gli RNA con la coda e il resto invece eluisce, poi variando la forza ionica si recupereranno gli mRNA.

Sia mRNA che RNA totale devono essere separati su un gel di agarosio denaturante → deve essere denaturante perché voglio che siano separati in base al peso molecolare e non in base alla conformazione (altro parametro che influenza la migrazione). NB: gel di agarosio denaturante con formamide o formaldeide (ripasso formule).

Prima di caricare su gel si deve dosare: il dosaggio viene fatto allo spettrofotometro (260nm UV). Leggiamo dell’UV e non nel visibile perché viene sfruttata l’assorbanza delle basi (effetto ipercromico). Le letture si possono fare anche a 280nm (si leggono anche le proteine e gli anelli aromatici) e 240nm. Si fa quindi poi la migrazione in funzione del peso molecolare, in particolare avviene inversamente proporzionale al MW.

Alla fine della corsa vado a visualizzare le bande, questo può essere fatto perché nel campione è stato messo un intercalante o perché coloro il gel con una soluzione che contiene un intercalante. Posso usare:

• Etidio
• Derivati

Uso quindi un intercalante, questi sono:

• Specifici per l’acido nucleico
• È un legame stechiometrico, quindi in funzione della quantità.

Questo intercalante nonostante sia stechiometrico non lo si usa per fare Real Time PCR, a prescindere da quanto sia dannoso. Quindi nel momento in cui viene caricato un RNA totale si hanno anche indicazioni della bontà della preparazione: per RNA totale sul gel si vedono sicuramente le bande relative al RNA ribosomiale (rRNA - presenti ad alti livelli) e possono dare quindi bande discrete.

All’interno della cellula le subunità ribosomiali sono presenti in rapporto 1:1, quindi c’è la stessa quantità. Se si interala in modo stechiometrico, se hanno la stessa quantità, dovrebbero dare lo stesso segnale. Però non → dipende solo dalla quantità ma anche dalla lunghezza: quanto è più lungo e tanto più si intercala le bande più alte a parità di quantità su gel sono più intense di quelle più basse.

Nel momento in cui si purifica da mRNA, non si vede più nulla, perché i messaggeri sono presenti in dimensioni e quantità diversa, ma non in quantità sufficiente da dare bande discrete, in funzione della sensibilità di quello che stiamo utilizzando per vedere (etidio). NB: se ci sono delle bande non è stato purificato correttamente.

Il gel viene poi trasferito su un filtro di nitrocellulosa o nylon, comunque carico positivamente. Il trasferimento nella maggior parte dei casi viene fatto con elettron-blotting o manualmente. C’è una vaschetta con il tampone, un supporto su cui si mette della carta (forma un “ponte” con la carta che pesca il tampone), si appoggia il gel e sul gel si mette direttamente la nitrocellulosa. Sopra ancora si mette dell’altra carta asciutta (peso). Per capillarità il tampone flussa verso l’alto (da bagnato ad asciutto) e porta l’acido nucleico che dal gel passa alla nitrocellulosa.

NB: non è fissato. Il filtro viene poi fissato agli UV, dove si cross-linka → si ha la formazione di legami covalenti tra l’acido nucleico e gruppi ammidici del supporto. NB: Non ci sono trattamenti denaturanti come avviene con la Southern perché l’RNA è già a single strand. Ora occorre ibridare il filtro e posso fare Northern normale o Northern relativa.

È stato ottenuto un filtro di Northern (stesso discorso se si ottiene filtro di Southern o Northern relativa) in cui è stato fissato RNA. Serve ora una sonda, che viene marcata e messa in soluzione. Ci sono n metodiche di ottenere una sonda, ma ogni metodo è specifico per ciò che si sta facendo. È importante la specificità: si possono fare sonde a RNA, a DNA… dipende dalle informazioni di partenza che si hanno. Servono sonde molto sensibili, legate ai livelli di ciò che si sta cercando.

ES: per messaggeri molto rari si usano sonde molto sensibili per rilevare anche quantità molto basse. Le sonde possono essere marcate:

• In modo radioattivo
• In modo indiretto (non radioattivo)

In linea di massima l’utilizzo di traccianti radioattivi rende, a parità di tipologia di sonda, il sistema più sensibile. Per la Northern si usano sonde sensibili e si marcano in modo radioattivo, inoltre la sonda la si ottiene per sintesi: sintetizziamo → DNA sonda random-priming.

Se stiamo sintetizzando, dobbiamo avere:

• Una polimerasi (incorpora nucleotidi formando un legame fosfodiesterico con liberazione di 2 fosfati)
• Nucleotidi marcati in modo radioattivo (marcati in modo tale che la radioattività rimanga su quello sintetizzato) – dopo l’incorporazione la marcatura sarà in alfa
• Primer NB: non stiamo modificando i nucleotidi, ma semplicemente al posto del P normale ci sarà P

NB: per altre marcature non si marcherà in alfa ma ad esempio in gamma (dipende da cosa devo fare). Le DNA polimerasi hanno come verso di polimerizzazione 5’→3’. Ha bisogno di un innesco, rappresentato dal 3-OH: dal 3-OH in direzione 5’→3’ copiano ciò che c’è sul templato single strand.

NB: questo vale per tutte le DNA polimerasi, tranne la terminal transferasi, che ha tutto quello che è stato detto ma non copia, aggiunge semplicemente quello che viene messo in soluzione (ES: mettendo tutti i nucleoidi C, tutti i G ecc… aggiunge all’estremità 3-OH code poly-C, poly-G ecc… in funzione di quanti nucleotidi vengono messi in soluzione e in funzione del tempo per cui si lascia agire la polimerasi).

Ad oggi non sono ancora state modificate le polimerasi in modo tale che polimerizzino in direzione opposta. Le polimerasi hanno anche associate altre attività per cui si differenziano, che sono attività esonucleasiche.

Nuclease → reazione uguale e contraria alla polimerizzazione. Se le polimerasi costruiscono legami fosfodiesterici, le nucleasi idrolizzano questi legami. Come abbiamo delle DNA e RNA polimerasi, quindi hanno specificità di substrato, allo stesso modo abbiamo nucleasi che hanno specificità di substrato:

• DNasi: specifica per il DNA
• RNasi: specifica per l’RNA
• RNasi H (H: ibrido): specifica per un ibrido RNA-cDNA, idrolizza l’RNA che sta nell’ibrido

La differenza tra nucleasi è che possono essere:

• Eso: idrolizzano a partire dalle estremità
• Endo: idrolizzano all’interno

Le polimerasi hanno in diversi gradi attività esonucelasiche: tolgono un nucleotide per volta a partire dalle estremità. L’attività può essere:

• In direzione 5’→3’ (stesso verso di polimerizzazione: se stanno polimerizzando si trovano l’elica davanti e rimuovono il nucleoide che hanno davanti): attività tipica della DNA polimerasi 1 di E.Coli – attività di nick translation. Questa attività è stata sfruttata per ideare la prima sonda marcata (oggi non più utilizzata perché ha una sensibilità inferiore a random-priming)
• In direzione 3’→5’ (proof-reading – correzione di bozze): la polimerasi si accorge se ha sbagliato a introdurre un nucleotide e lo rimuove (si ferma, torna indietro, idrolizza, rimuove e va avanti)

Le polimerasi sono classificate in base al grado di capacità di correggere e la scelta sarà in funzione di quello che devo fare. Per fare random priming si usa una polimerasi che manca totalmente di attività esonucleasica 5’→3’ (nick translation). La polimerasi è quella che ha il frammento di Klenow ed è stato ottenuto dalla polimerasi Coli attraverso una digestione enzimatica eliminando l’altra attività.

Altra caratteristica delle polimerasi è la processività (quanto velocemente si staccano dal templato, nell’unità di tempo) ed efficienza: quanto a lungo possono polimerizzare. Il frammento di Klenow è poco processiva.

Punto di partenza per la random priming è DNA double strand, purificato eliminando mRNA attraverso PCR ma di cui non si conosce la sequenza. Oltre a polimerasi e nucleotidi servono anche i primer: miscela di esanucleoditi, sono una miscela perché sono presenti tutte le possibili combinazioni di 4 basi (4 combinazioni). Questo vuol dire che se aggiungo questa miscela, non ci sarà un appaiamento casuale, ma l’appaiamento è specifico perché avendo tutte le possibili combinazioni con 4 basi esiste una probabilità X per cui qualche primer si anneala in modo specifico ai due strand che sono stati denaturati. La polimerasi polimerizza e incorpora il nucleotide radioattivo a partire dai primer.

Non avendo attività eso 5’→3’, nel momento in cui arriva al primer davanti, si fermerà. Non viene fatta alcuna ligazione: abbiamo una miscela di frammenti radioattivi, rappresentativi del templato. Nelle sonde radioattive si misura l’attività specifica, data dal rapporto radioattivo/non radioattivo (templato). Se si fa questo rapporto si ottiene un certo valore di attività specifica, che determina la sensibilità (con la radiazione si ha emissione di segnale, il segnale sarà più elevato all’aumentare della sensibilità della sonda).

Perché non ligo? Potrei usare la ligasi che è in grado di riformare i legami fosfodiesterici, ma non lo faccio perché così aumenta la sensibilità: aumento la probabilità. C’è un target su un substrato fisso e la sonda in soluzione, la sonda deve incontrare il substrato e c’è quindi un discorso di probabilità. ES: 1 sonda lega il ligando, ma 5 sonde più piccole si legheranno al target con maggiore probabilità a parità di tempo. Quindi non vado ad aumentare l’attività specifica, ma aumento la probabilità di avere un segnale. L’altra sonda ad alta attività specifica è sempre una sonda di sintesi, ma si sintetizza in vitro RNA (questa metodica è usata per marcare il target su gene chip).

Sintesi di RNA

Se devo fare sintesi di RNA mi serve:

• Templato
• RNA polimerasi
• Ribonucleotidi marcati in alfa
• Magnesio
• Promotore (le RNA polimerasi necessitano del promotore per effettuare la trascrizione)

La scelta tra le polimerasi è legata al fatto di avere quelle più efficienti e processive (non sono quelle di Coli e uomo, ma sono quelle di fagi). Quindi quelle che vengono utilizzate sono quelle di fagi:

• SP6
• T3
• T7

Si utilizza DNA double strand che deve avere up-stream, alle estremità, un promotore riconosciuto dalla RNA polimerasi corrispondente. Quindi devo avere costruito un sistema che mi permette di clonare il DNA che devo trascrivere down-stream al promotore corrispondente. Ci sono quindi una serie di plasmidi di Coli che vengono amplificati in Coli, in cui ai lati destro e sinistro del sito di inserzione multipla dove si clonano i frammenti di interesse ci sarà la sequenza relativa al promotore SP6 o a T7 o a T3. Questi avranno gli altri elementi di Coli, come resistenza alla ampicillina per la resistenza in Coli e la alfa-complementazione. Il frammento di interesse è quindi stato clonato e diventa double strand. Questo fa sì che a seconda del promotore che utilizzo posso fare RNA di uno o dell’altro strand.

Il sistema sperimentalmente prevede un inizio di trascrizione determinato dal promotore e in teoria la trascrizione dovrebbe terminare con i terminatori, ma in questo caso sono assenti perché sono stati semplicemente clonati dei frammenti di DNA. Quello che accade è che tagliando dalla parte opposta del promotore non serve un terminatore ma automaticamente terminerà la trascrizione. Quindi si deve:

1. Clonare DNA (o cDNA)
2. Definire quale promotore e polimerasi utilizzare
3. Tagliare con un enzima di trascrizione (linearizzare) dalla parte opposta a dove è stato clonato

Alla porzione lineare ottenuta si aggiungono ribonucleotidi, magnesio e RNA polimerasi, ottenendo RNA single strand. Ma queste polimerasi hanno una efficienza elevatissima, quindi non ho 100 molecole di templato e ottengo 100 molecole di RNA: c’è un processo di amplificazione 1:100. Dal punto di vista di attività specifica accade che misurando il radioattivo alla fine di questa amplificazione e dopo una random priming, l’attività specifica sarà molto più elevata. NB: si chiama cDNA se ho clonato DNA, invece si chiama cRNA se ho clonato RNA (nei target per la gene CHIP avrò cRNA). In questo sistema a differenza della random priming dove nella sonda non posso eliminare il DNA templato non marcato da quello marcato (li devo usare in miscela perché non hanno differenze tali da separarli), in questo caso posso eliminare in maniera specifica il templato utilizzato che è DNA (ho ottenuto RNA).

Questo può essere fatto utilizzando una nucleasi specifica per il DNA → DNasi 1. La DNasi 1 è una endonucleasi specifica per il DNA: idrolizza sia che sia single che double strand. Il taglio può avvenire:

• Lasciando il P sul 5’
• Lasciando il P sul 3’

Questa lo lascia sul 5’ (5’-P). Taglia a livello di siti adiacenti alle pirimidine. Le miscele che si ottengono dei prodotti di digestione sono in funzione della quantità DNasi-enzima rispetto al substrato o rispetto al tempo per cui si lascia agire. In un eccesso di enzima rispetto al substrato idrolizza tutto il templato. È possibile controllare, quindi mettere una quantità limitante di DNasi rispetto al substrato, in questo caso farà solamente dei NICK sul templato (questo è il principio su cui si basa la NICK translation). Questa sonda a RNA non ha alcun problema utilizzandola su una Southern perché è double strand, mentre se viene utilizzata sulla Northern è più problematico perché c’è solo uno strand ed è necessario quindi conoscere il senso di trascrizione dello strand. Posso fare 2 sonde: una per ogni senso di trascrizione e facendo due ibridazioni (→ stabilisco anche il senso di trascrizione).

Nick translation

In DNA è double strand e necessito di un primer 3-OH. Questo viene fatto trattando con la DNasi 1 il templato in condizioni estremamente limitanti:

• Endo
• 3’-OH e 5’-P
• Nucleotidi marcati
• Magnesio
• Enzima con attività eso 5’→3’ (stesso senso di polimerizzazione – oloenzima di Coli)

Come si fa? L’oloenzima si attacca al 3’OH e in direzione 5’→3’ inizia a incorporare, avendo attività eso nello stesso senso vuol dire che quello che si trova davanti lo toglie. Questa tecnica è stata abbandonata perché ha attività specifica inferiore rispetto alla random priming. La TAQ polimerasi che viene usata nella Real Time PCR ha attività eso 5’→3’. Una marcatura con attività specifica meno elevata è quella a livello dell’estremità.