Biologia molecolare

Biologia molecolare

Produzione e regolazione del ligando

Si parte con la produzione di una molecola detta ligando da parte di una cellula che deve quindi produrre una molecola segnale. L'intero processo può quindi essere regolato a partire dalla produzione del ligando. Lo sviluppo, generalizzando, è definito da una corrispondenza tra un carattere e una base, l'uomo presenta 25000 geni, quello che differenzia gli organismi più evoluti è la regolazione non la grandezza del genoma. Un singolo gene non corrisponde infatti a una singola proteina, dipende da variabili diverse tra cui lo splicing alternativo.

La trasduzione inizia dalla sequenza AUG, non essendo sviluppata la proteina 1:1 avviene lo splicing, per siti recettoriali diversi avviene un taglio in punti diversi, le porzioni risulteranno così diverse. Anche questo processo va a definire una regolazione. La molecola del ligando andrà ad interagire con il proprio recettore, la presenza o meno di questo definisce un altro punto di regolazione: le conseguenze del legame possono definire una modifica a livello del metabolismo, della proliferazione, oppure delle modifiche a livello dell'espressione di un gene. Giunti ad un determinato punto il processo viene spento.

Classi di ligando

• Molecole idrofobiche che vengono complessate ad altre proteine che le trasportano nel circolo fino alla cellula sulla quale attraverseranno subito la membrana.
• Idrofiliche, necessitano di un recettore e di meccanismi per la trasduzione.

Un'altra forma di regolazione riguarda il bersaglio, dipende infatti dalla distanza da cui si trova, endocrino, paracrino o autocrino. Esistono poi casi in cui c'è contatto diretto tra i due tessuti.

La funzionalità alla quale è destinato il processo è definita da domini proteici altamente conservati per una determinata funzione con una struttura ottimizzata. Tramite il processo di trasduzione avvengono modifiche a livello del gene coinvolto e vengono attivati meccanismi di proliferazione, differenziamento e regolazione del ciclo cellulare. Sono infatti note regioni mutate altamente espresse nel caso di tumori con lo sviluppo di tutte le conseguenze correlate a recettori e passaggi intermedi della cascata del segnale che risultano essere anche bersagli farmacologici.

Attivazione ligando-recettore e regolazione

Considero una certa concentrazione di ligando che è regolata dalla produzione e diffusione di questo. La regolazione del recettore è definita dalla produzione e dal posizionamento in membrana. Si intende per KD la concentrazione di ligando necessaria per occupare il 50% dei siti recettoriali disponibili.

Possiamo osservare una curva aspecifica, possiamo immaginare una cellula completamente priva di recettori, aggiungendo grandi quantità di ligando si legheranno casualmente definendo una crescita lineare della curva all'aumentare del ligando. Osserviamo poi una curva specifica che rappresenta il ligando legato in modo specifico al recettore, la curva arriverà poi al livello di saturazione. La differenza tra totale e specifico ci darà il valore della curva aspecifica.

La risposta fisiologica è una curva simile e si sviluppa in funzione al numero di recettori che sono impegnati con il ligando, c'è un numero di soglia minimo che ne definisce l'attivazione. Per regolare il processo si può intervenire in 3 modalità differenti:

• Regolare la quantità di ligando
• Aumentare il numero di recettori a parità di ligando
• Modificare il valore della KD, per modificare questa costante bisogna cambiare la conformazione della proteina modificando i siti e aumentando o diminuendo l'interazione. Posso fosforilare la proteina attuando modifiche post trasduzionali, oppure posso farla interagire con un’altra proteina che andrà ad alterarne i siti. Al variare della KD la curva si deformerà andando ad intersecare la retta che rappresenta il 50% in punti diversi.

Patway di trasduzione e recettori accoppiati a proteine G trimeriche

I patway di trasduzione sono classificati in funzione del tipo di recettore. Per ogni recettore ci sono una serie di patway preferenziali che interagiscono fra loro. La funzione è quella di trasferire un segnale dall'esterno all'interno. Quando il segnale entra (secondo meccanismi diversi) si propaga attraverso la cascata di trasduzione del segnale in base alla funzione da svolgere.

Recettori accoppiati a proteine G trimeriche presentano 7 domini transmembrana e una struttura a 7 eliche con domini immersi nel citosol. Questi recettori sono accoppiati a proteine G, proteine che si trovano nel citosol e sono ancorate alla membrana con code lipidiche. Le anse C3 e C4 sono responsabili dell'interazione con le proteine G. L'approccio utilizzato inizialmente per lo studio di questi domini prevedeva la costruzione di chimere, staccando più pezzi di proteine e isolando i diversi siti si può capire ad esclusione la funzione svolta dai diversi domini. In questo caso tutti i recettori sono organizzati in famiglie e accoppiati a proteine G, troviamo quindi proteine simili accoppiate a determinate famiglie recettoriali.

Le proteine sviluppano quindi la stessa funzione ma rispondono a ligandi diversi così da ampliare le possibilità di attivazione. Con minor numero di elementi a disposizione vengono ottimizzate le possibilità di attivazione. Consideriamo in questo caso 2 recettori che rispondono allo stesso ligando ma che legano 2 proteine G diverse, inibitoria e stimolatoria. Misuro quali delle 2 viene attivata da un determinato ligando in seguito ad uno stimolo ottenendo diverse risposte, si cominciò così a mischiare frammenti inibitori e stimolatori (rossi e blu) provando ad isolare quale fosse il frammento effettore della funzione. Il cuore della funzione per esclusione risulta l'ansa 5-6.

Funzionamento delle proteine G trimeriche

Le proteine G trimeriche legano il GTP, attraverso l'attività di defosforilazione il GTP viene scisso in GDP ricavando energia. Per caricare nuovamente GTP il GDP deve essere allontanato, avviene una modificazione conformazionale e al termine dell'attività viene liberato fosfato, a questo punto il gruppo non mantiene la conformazione che varia modificando anche lo stato di affinità. La proteina può interagire con proteine diverse definendo sviluppi diversi presentando conformazioni in grado di sviluppare o meno un legame. Esistono infatti proteine accessorie che modulano la transizione regolando i siti attivi.

GTP (entra), Gets, GDP (esce): sono scambiatori che favoriscono lo scambio. Gaps, Rgs, Gdis: promuovono l'attività intrinseca Gtpasica della proteina G o attivano il processo aumentando l'idrolisi, rallentandola o inibendola.

Le proteine G trimeriche sono formate da tre subunità, Alpha, Beta e Gamma, divise in due complessi: complesso alpha e complesso betagamma. Sono ancorate alla membrana attraverso code lipidiche e galleggiano sopra a questa. Quando arriva il ligando cambia l'affinità con la proteina G trimerica, il dominio trans-membrana crea una tasca e smuove la conformazione del recettore (anche a livello del citosol) spostando C3 e C5 e cambia l'affinità del recettore per le proteine trimeriche.

Dopo la formazione della tasca le proteine trimeriche G risultano altamente affini e il recettore rimane legato per più tempo. Il recettore ha la funzione dello scambiatore, aumenta la velocità di rilascio di GTP (cinetica già presente ma che viene ora velocizzata esponenzialmente). La proteina Galpha cambia così conformazione, diminuisce di affinità per il complesso betagamma e si stacca più facilmente restando comunque ancorata alla membrana e galleggiando più distante dal complesso. Una volta che si stacca dal recettore questo diventa nuovamente libero, per ogni recettore ci può essere infatti un legame alternato di più proteine fino a quando il ligando non viene rilasciato.

In seguito ci sarà di nuovo affinità fra Galpha e il complesso betagamma e galleggiando si incontrano nuovamente ripristinando il complesso di partenza. A questo punto il segnale ha attraversato la membrana, Galpha generalmente è quello che attiva l'effettore il complesso betagamma lo fa meno frequentemente. Galpha carico di GTP attiva gli effettori che promuovono il secondo messaggero.

Effettori e secondi messaggeri

Un esempio è l'adenilatociclasi che promuove cAMP, per alpha stimolatoria avremo aumento di cAMP, per alpha inibitoria avremo diminuzione di cAMP. Il ciclo c'è sempre, gli effetti dipendono dal numero di molecole coinvolte.

Troviamo 2 tipi di Galpha, la GalphaS e la GalphaI (stimolatoria e inibitoria), che presentano entrambe lo stesso effettore per adenilatociclasi. Sono quindi due proteine diverse che attivano entrambe adenilatociclasi.

Troviamo poi le ultime 3 dell'elenco che sono Alpha ma attivano per effettori diversi. Gli effettori promuovono per un secondo messaggero che attiverà una seconda cascata di segnalazione (per esempio l'adenilatociclasi avrà effetto su cAMP, la fosforilasi avrà effetto su IP3 e DAg). Ricordiamo inoltre cAMP, GMP ciclico, diacilglicerolo 3 fosfato di membrana e attaccato a inositolo difosfato.

GPCR e canali ionici

La subunità BetaGamma quando incontra i canali K ne modifica la conformazione provocando l'apertura e la fuoriuscita di ioni K+ dal citosol determinando un cambio di polarizzazione e variazione del battito cardiaco.

Altro esempio specifico è il meccanismo di visione al buio, troviamo i bastoncelli formati da siti che contengono rodopsina; formata a sua volta da una parte detta opsina e una parte detta retinale, funziona a basse intensità luminose. Il recettore è formato da 7 domini, il cambio di conformazione in questo caso non dipende dal complesso ligando recettore ma dalla presenza di un fotone che agisce sul retinale (modifica l'opsina) e ne cambia la conformazione da cis a trans (forma attiva, equivalente di un recettore che interagisce con il ligando).

Attivazione della rodopsina

La rodopsina è ora attivata e va ad agire come scambiatore di nucleotidi agendo sulla proteina G trimerica. Le proteine G attivano la fosfodiesterasi e il secondo messaggero GMP ciclico. La fosfodiesterasi in condizione normale è inattivata, la proteina G per attivarla toglie un inibitore; infatti Galpha interagisce con la fosfodiesterasi occupando i siti di inibizione, per attivarla promuove il distacco di due subunità inibitorie e così attiva e promuove la sua attività. Va a ridurre la concentrazione di GMP ciclico che è il secondo messaggero che controlla i canali che regolano la polimerizzazione della membrana che a sua volta regola i segnali neuronali. Se GMP ciclico è basso sono inibiti i canali sodio potassio e quindi la polarizzazione di membrana.

Altro processo di regolazione è definito dalla desensibilizzazione dei recettori; fondamentalmente l'intero meccanismo deve funzionare grazie alla luce ma solamente quando non c'è luce. Considerato che sul ligando non possiamo agire l'unico modo è modificare la conformazione agendo sulla KD.

Si potrebbe anche agire sul meccanismo di esocitosi ed endocitosi recettoriale ma in questo caso il fotone non ha bisogno che il sito recettoriale venga esposto in membrana, anche se il recettore è nel citosol all'interno di una vescicola il fotone lo raggiungerebbe comunque perché è in grado di attraversare la membrana. In questo caso anche internalizzando il recettore ci sarebbe comunque attività e la degradazione non sarebbe un’opzione ottimale perché al buio il processo dovrebbe essere invertito con una nuova trascrizione e trasduzione per rigenerare la proteina degradata; servirebbe troppo tempo.

L'opzione disponibile è quindi lavorare sulla KD operando modifiche interne più facili da attuare e più rapide, l'utilizzo della fosforilazione è ottimale, fosforilare la rodopsina cambia la KD, la rodopsina attivata sarà meno in grado di attivare il processo della proteina G. Posso quindi alterare la KD tra ligando e recettore ma posso anche alterare la KD tra recettore e proteina G (come in questo caso).

In questo caso il ligando è presente e rimane inalterato, può così attivare la rodopsina che è stata però modificata e non attiverà la proteina G; tutto questo senza influenzare la regolazione del ligando sulla rodospina. In base al numero di fosforilazioni, definite dalla diversa intensità luminosa, posso regolare il processo.

In seguito a una fosforilazione vado a limitarlo, dopo la seconda fosforilazione si crea un sito di binding per favorire il legame con l'arrestina, il meccanismo è bloccato completamente. Il tutto dipende dal range luminoso.

Fosfolipasi C e regolazione del calcio

La fosfolipasi C è un effettore di membrana, è attivato da proteine Galpha attraverso recettori per proteine trimeriche. La fosfolipasi C presenta più gruppi che possono essere fosforilati e in base a questo interagiscono con proteine diverse e attivano cascate del segnale diverse. Troviamo quindi chinasi specifiche che fosforilano in punti diversi e specifici, per esempio la PI-4 chinasi e la 5. Molto importante è anche P3K. Alcune fosofrilano molecole già fosforilate, la combinazione delle chinasi porta alla variabilità di fosforilazione in posizioni diverse garantendo interazione con gruppi diversi.

Posso cambiare la concentrazione delle molecole in diversi stadi di fosforilazione che a loro volta possono interagire o meno con altre molecole. Tra queste la fosfolipasi C è una proteina che va a tagliare lasciando la porzione idrofilica, di diacilglicerolo, ancorata alla membrana e si libera così inositolo 1,4,5 trifosfato idrofilico. (4 e 5 sono le chinasi che lo fosforilano, 1 è la conseguenza della reazione). C’è quindi rilascio di queste due molecole di glicerolo e di 1,4,5 trifosfato è attivata dalla proteina G alpha a sua volta attivata tramite un recettore. I secondi messaggeri coinvolti risultano essere Camp e Gcmp per il glicerolo e IP3.

La reazione descritta parte della fosfolipasi Cb attivata da proteine G che sono attivate a monte da elementi diversi, questo indica la modularità del meccanismo. La fosfolipasi C libera glicerolo che resta in membrana e inosiltolo 3 fosfato che diffonde e aumenta la sua concentrazione citosolica, una delle sue funzioni è interagire con i canali del calcio che in presenza di questo si aprono e permettono il passaggio del calcio nella cellula con successivo sequestro nel reticolo endoplasmatico. Aprendo i canali la concentrazione di calcio aumenta a livello del citosol, sappiamo che altre molecole sono attivate dal calcio, fra queste, la proteina chinasi. La proteina chinasi C (PKC) reagisce infatti al calcio aumentando l’affinità alle proteine di membrana e aumentando la concentrazione locale a livello della membrana. Risulta così aumentata la possibilità di interazione con proteine e aumenta la fosforilazione dei substrati.

Pka e immagazzinamento del glucosio

Le GPCR attivano e inibiscono adenilato ciclasi e le proteine G degradano adenilato ciclasi per inibire il Camp. Troviamo poi la Pka (amp ciclico dipendente) dipende da Camp ed è l’equivalente della PKc, lo sviluppo è lo stesso ma cambia il metodo di attivazione, gli effetti dipendono poi da cosa vado a fosforilare.

È un tetramero con 2 subunità catalitiche e 2 subunità regolatorie. Le 2 subunità regolatorie presentano 2 siti di interazione per Camp. Quando il Camp aumenta si lega alle subunità regolatorie e attiva Pka. In realtà i 2 siti non si equivalgono, non presentano infatti la stessa affinità per Camp. Uno dei due presenta affinità maggiore e interagisce con Camp anche a concentrazioni piuttosto basse. Una volta che si forma questo primo legame diminuisce l’affinità per il secondo che diventa più sensibile alla variazione, infatti un calo della concentrazione può fargli perdere affinità per la subunità catalitica. Cambiando la concentrazione di Camp e al diminuire di questo la subunità si inattiva, se questo aumenta la subunità si attiva.

Un esempio specifico che vede coinvolto questo meccanismo della Pka è il processo di immagazzinamento del glucosio per mezzo del glicogeno. Ricordiamo che in questo processo troviamo il glucosio e la catena del glicogeno alla quale il glucosio si unisce per essere immagazzinato attraverso la glicogeno sintasi che svilupperà la catena di glicogeno legando glucosio. Dall’altra parte troviamo la glicogeno fosforilasi che fosforilando la catena di glicogeno libera il glucosio immagazzinato. Il processo dipende quindi dalla regolazione di questi 2 elementi.

All’inizio del processo la glicogeno fosforilasi è attiva e viene rilasciato il glucosio. Questa si trova nello stato attivo se è fosforilata. La glicogeno fosforilasi chinasi è la chinasi che fosforila la glicogeno fosforilasi, questa a sua volta per essere attiva ha bisogno di essere fosforilata e risulta così da substrato per la Pka. Pka; glicogeno fosforilasi chinasi; glicogeno fosforilasi; fosofrilazione del glicogeno; rilascio del glucosio.

La glicogeno sintasi in questo momento deve quindi essere inattiva e viene inattivata quando è fosforilata, non sintetizzando più glicogeno. L’intero processo di rilascio del glucosio funziona quindi per attivazioni e inibizioni definite dalla fosforilazione.

A questo punto potrebbe sembrare un processo chiuso, esiste tuttavia una proteina la fosfoproteina fosfatasi che per propria natura defosforilano le proteine fosforilate, in questo caso abbiamo però degli IP inibitori che quando sono fosforilati le inibiscono. Questo non accade però per il 100% delle proteine, esiste sempre una piccola quota percentuale che definirà comunque una defosforilazione lieve. Queste proteine defosforilate, seppur lentamente, non avranno più la Pka attiva e non ci sarà più il ciclo di fosforilazione.