Biologia generale

La comunicazione cellulare

La comunicazione tra cellule diverse avviene attraverso segnali di natura chimica (ligandi), che si legano a recettori specifici posti all'interno della membrana plasmatica o nel citoplasma. Un segnale apolare può diffondere liberamente all'interno del doppio strato fosfolipidico, pertanto i suoi recettori potranno trovarsi immersi nel citoplasma (un esempio sono i recettori per il cortisolo e per la tiroxina); contrariamente, un recettore polare non può attraversare il doppio strato, pertanto i suoi recettori si dovranno trovare sulla superficie della membrana cellulare (un esempio è dato dal recettore per l'insulina). Se una cellula è priva di recettori per un determinato segnale essa non potrà rispondere.

Tipologie di segnale

• Citochine: sono molecole segnale di natura peptidica secrete soprattutto dal sistema immunitario ed implicate nella segnalazione paracrina (su cellule vicine e diverse).
• Fattori di crescita: alcune cellule sintetizzano fattori di crescita che hanno come bersaglio le stesse molecole che li hanno prodotti (segnale autocrino), un esempio può essere dato dalle cellule tumorali.
• Ormoni: possono essere di natura peptidica o lipidica e sono implicati nella segnalazione endocrina, agiscono su cellule distanti che raggiungono mediante il circolo sanguigno. Gli ormoni steroidei sono considerati cofattori e non regolatori della trascrizione.
• Neurotrasmettitori

Tipi di segnali

• Autocrini: sono segnali che agiscono sulla stessa cellula che li ha prodotti.
• Giustacrini: agiscono su cellule adiacenti a quella che li ha prodotti.
• Paracrini: agiscono su cellule vicine a quella che li ha prodotti.
• Endocrini: agiscono su cellule distanti e vengono trasportati dal circolo sanguigno.

Recettori ad attività protein-chinasica

Le chinasi indicano una classe di enzimi che catalizzano le reazioni nelle quali viene idrolizzato un ATP e viene trasferito un gruppo fosfato su una proteina che così facendo si attiva. Non tutte le molecole possono tuttavia essere fosforilate, tra gli amminoacidi ad esempio gli unici che possono farlo sono serina, treonina e tirosina. Questa modifica è chiaramente temporanea e l'attività della proteina fosforilata cessa quando entra in gioco la fosfatasi che allontana il gruppo fosfato. Un esempio di recettore ad attività protein chinasica è quello dell'insulina dove è la tirosina a essere fosforilata.

• Il recettore che lega l'insulina è formato da due subunità: alfa e beta. L'insulina si lega alla subunità alfa.
• Ciò induce un cambiamento conformazionale nella subunità beta che invia il segnale della presenza dell'insulina nel citoplasma.
• Ciò attiva il dominio protein chinasico del recettore situato nel citoplasma.
• Quest'ultimo procede a fosforilare i substrati della risposta insulinica, innescando una cascata di risposte chimiche dentro la cellula.

In particolare la fosforilazione determina la trasduzione del segnale: GLUT4 si sposta dal citoplasma alla membrana cellulare. Il GLUT4 è una proteina di membrana che consente il passaggio di glucosio attraverso la membrana plasmatica in seguito a risposta insulinica.

NB: ricorda che il glucosio in eccesso viene immagazzinato nel fegato e nei muscoli.

Il recettore accoppiato a proteina G

La terminologia deriva dal fatto che queste proteine legano nucleotidi guaninici tra cui GTP (guanosina trifosfato che attiva la via di trasduzione del segnale) e GDP (guanosina difosfato che la disattiva). Le proteine G sono proteine periferiche, possono essere trimeriche (avere 3 subunità) o monomeriche (avere solo una subunità). Anche in questo caso avvengono numerosi passaggi:

• Legandosi dal lato extracellulare del recettore, il ligando ne induce un cambiamento di conformazione nella sua regione citoplasmatica, esponendo un sito che si lega ad una proteina mobile detta proteina G.
• Quando la proteina G si lega ad una proteina recettoriale attivata, GDP è sostituito con GTP. Il legame con GTP porta ad un cambiamento di conformazione nella proteina. La subunità legata a GTP si stacca dal resto della proteina G e diffonde nel piano del doppio strato finché non incontra un effettore proteico.
• La subunità della proteina G (legata a GTP), legandosi con l'effettore proteico, causa cambiamenti nel funzionamento della proteina. Una volta attivato l'effettore, GTP viene idrolizzato a GDP. La subunità della proteina G ormai inattiva si separa dall'effettore e diffonde nella membrana, fino ad incontrare e legare le altre 2 subunità (ricomponendosi).

I recettori associati a canali ionici

In molti tipi di cellule la membrana plasmatica contiene canali ionici ad apertura controllata, che fanno entrare ed uscire ioni. Il meccanismo di apertura consiste in modificazioni della forma tridimensionale della proteina canale dovuta all'interazione con un segnale: tali proteine funzionano quindi da recettori. Il recettore dell'acetilcolina è un esempio di canale ionico. Altri esempi sono dati dalle molecole odorose presenti sulla membrana dei neuroni olfattivi.

I secondi messaggeri: la via di Ras-MEK-MAP chinasi

Ras è una proteina G che regola positivamente la divisione cellulare. Il nome RAS deriva da "rat sarcoma", così chiamato perché scoperto per la prima volta nel ratto. Il tumore nell'uomo fa sì che RAS e GTP siano perennemente legati e quindi questo causa una continua stimolazione alla proliferazione cellulare. Tutti i membri della famiglia delle proteine RAS appartengono ad una classe di proteine chiamate "piccole GTPasi". Queste sono coinvolte nella trasmissione del segnale all'interno delle cellule (trasduzione del segnale).

I secondi messaggeri: la via di Wnt - beta catenina

La via di Wnt è importante sia a livello embrionale, sia nell'organismo adulto perché è una famiglia di vie utilizzate per la segnalazione paracrina e autocrina.

• In presenza del ligando Wnt che interagisce con il recettore di membrana FRIZZLED, il complesso proteico è inibito e la beta-catenina NON viene degradata. Quindi essa entra nel nucleo ed interagisce con molti fattori. In generale l'attivazione della beta-catenina innesca meccanismi di crescita e resistenza all'apoptosi (il gene che codifica per la beta-catenina è considerato un oncogene). Un aumento della beta-catenina è infatti riscontrabile nel carcinoma delle cellule basali e nel cancro del colon retto.
• In assenza del ligando Wnt la beta-catenina interagisce con un complesso proteico formato da APC, AXIN (1-2), la proteina fosfato 2 e GSK-3B. Quest'ultimo provoca ubiquitinazione della B-catenina che sarà così degradata dal proteasoma.

I secondi messaggeri: AMP ciclico

La glicogeno fosforilasi catalizza la demolizione del glicogeno contenuto nel fegato affinché le molecole di glucosio risultanti possano riversarsi nel sangue. L'AMP ciclico (cAMP) deriva dall'ATP per opera dell'enzima adenilato ciclasi. Questo enzima si attiva attraverso un recettore per l'adrenalina accoppiato ad una proteina G. Mentre il legame con il recettore ha un'altissima specificità, i secondi messaggeri come il cAMP permettono di rispondere ad un solo evento con molti eventi all'interno della membrana citoplasmatica. I secondi messaggeri sono quindi utili per amplificare e distribuire il segnale. Ad esempio una sola molecola di adrenalina porta alla produzione di molte molecole di cAMP.

La trasduzione del segnale con molecole idrofobiche

Tipo 1

Le molecole segnale liposolubili passano attraverso la membrana cellulare e si legano a recettori specifici nel citoplasma o nel nucleo. Molecole segnale di natura idrofobica (es: ormoni steroidei) interagiscono con recettori plasmatici. Il complesso ormone-recettore entra nel nucleo: la porzione proteica (recettore) interagisce con regioni specifiche del DNA chiamate HRE (hormone response elements), stimolando la trascrizione di geni specifici.

Tipo 2

Molecole segnale di natura idrofobica (per esempio vitamina D, acido retinoico) interagiscono con recettori nucleari. Il recettore è sempre localizzato nel nucleo e viene attivato dall'interazione con l'ormone e quindi interagisce con regioni specifiche del DNA stimolando la trascrizione di specifici geni.

In che modo le cellule di un organismo pluricellulare possono comunicare direttamente?

Attraverso giunzioni cellulari specializzate:

• Le giunzioni comunicanti (gap junctions) negli animali
• I plasmodesmi nelle piante

Dagli organismi pluricellulari ai multicellulari

I primi organismi pluricellulari risalgono a circa 700 milioni di anni fa. È interessante sottolineare che la multi-cellularità si è evoluta in maniera indipendente negli animali e nei vegetali, i quali possiedono un antenato comune: un eucariote unicellulare che possedeva mitocondri ma non cloroplasti. Nell'evoluzione da organismi unicellulari a pluricellulari è possibile riconoscere passaggi intermedi:

• Aggregati coloniali di organismi non differenziati. Un esempio è Volvox, un organismo coloniale. La colonia può essere disgregata ma i singoli elementi non sopravvivono isolati e si riaggregano. Ciò fa pensare che siano presenti delle connessioni citoplasmatiche che mettano in comunicazione i diversi individui. Interessante è anche la loro modalità di riproduzione che è asessuata ma occasionalmente si possono trovare cellule a riproduzione sessuata: i gameti.
• Vari tipi di dati morfologici e molecolari indicano che gli animali, i metazoi, derivano da flagelli coloniali antichi, simili agli attuali coanoflagellati. Essi sono importanti poiché sono i primi a presentare differenziamento cellulare e specializzazione. I coanoflagellati sono organismi coloniali che vivono sul fondale marino. La cellula dei coanoflagellati è uguale a quella dei multicellulari più semplici, ovvero le spugne.

NB: metazoi = insieme di tutti i pluricellulari eucarioti compreso nel regno animale. I metazoi più antichi sono le spugne.

I cordati

L'uomo appartiene al phylum del cordati. Tutti i cordati durante il loro sviluppo possiedono le seguenti caratteristiche:

• Corda postnatale muscolare
• Notocorda (o corda dorsale, è una struttura flessibile a forma di tubo che si riscontra in tutti gli embrioni dei cordati)
• Scissure e fessure faringee
• Corda nervosa dorsale cava

Questo perché gli stessi geni architetto "Hox" controllano lo sviluppo del corpo e delle regioni encefaliche. Sia nell'anfiosso che nei cordati presentano lo stesso ordine antero-posteriore: prosencefalo, mesencefalo e romboencefalo. Dai cordati derivano i craniati: cordati provvisti di estremità encefalica protetta da cranio. Dai craniati derivano i vertebrati: craniati provvisti di colonna vertebrale. Altro passaggio fondamentale risulta essere quello degli anfibi (animali come dice il nome stesso dalla doppia vita acquatica e terrestre) e che sono i primi cordati ad aver colonizzato la terra. Un organismo che probabilmente risulta essere l'antenato degli anfibi è "Acanthostega", un fossile rinvenuto in Groenlandia datato a circa 365 milioni di anni fa. Esso è un tetradope adatto alla vita acquatica proprio per la presenza di branchie, mentre la sua struttura ossea è adatta alla vita terrestre. Si ritiene invece che l'antenato dei mammiferi (comparsi nel Triassico) sia "Megaconus mammaliaformis" vissuto circa 165 milioni di anni fa. Aveva presumibilmente le dimensioni di un ratto, era ricoperto di pelo e probabilmente erbivoro. Si difendeva dai predatori grazie ad uno sperone contenente veleno, posto nel suo tallone.

Organismi modello

Un organismo per essere tale deve possedere le seguenti caratteristiche:

• Crescita rapida e brevi tempi riproduttivi
• Facilità di allevamento e manipolazione
• Dimensioni e caratteristiche peculiari del genoma
• Prolificità
• Pattern di sviluppo ben definito e conosciuto
• Estensibilità delle scoperte fatte negli organismi modello ad altre specie

Gli organismi modello attualmente in uso sono:

• Escherichia Coli (batterio)
• Saccharomyces Cerevisiae (lievito, appartenente al regno dei funghi)
• Arabidopsis Thaliana (primo genoma di pianta ad essere completamente sequenziato)
• Caenorhabditis Elegans (verme e primo organismo multicellulare ad essere completamente sequenziato). Può essere ermafrodito o maschio ed è molto usato negli studi sullo sviluppo.
• Drosophila Melanogaster (moscherino della frutta). Usata negli studi di genetica e dello sviluppo.
• Xenopus Laevis (rana africana) usata nei primi esperimenti di manipolazione degli embrioni ed ovociti poiché le sue uova hanno dimensioni notevoli e possono arrivare fino ad 1 mm.
• Fugu Rubripes (pesce palla). Possiede il genoma più piccolo dei vertebrati ed è molto compatto, nonostante possieda lo stesso numero di geni dell'uomo. In esso tuttavia è minore la porzione di DNA non codificante.
• Danio Rerio (zebrafish) è il modello ideale per gli studi sull'embriologia dei vertebrati poiché già dopo 48 ore dalla fertilizzazione, negli embrioni trasparenti sono visibili tutte le caratteristiche dei vertebrati.
• Mus Musculus (cavia da laboratorio). È il modello di mammifero più utilizzato poiché molto similare all'uomo.

Tecniche di manipolazione transgeniche

1. Un metodo consiste nell'inserimento di geni (prima che si formi lo zigote) nel pronucleo maschile (più facilmente raggiungibile) o nel pronucleo femminile. È un processo spontaneo di manipolazione, non c'è nulla di mirato: è un'operazione invasiva e non precisa, motivo per il quale spesso lo zigote viene danneggiato. È stato eseguito per la prima volta negli anni '70.
2. Un altro metodo è quello del gene targeting inventato per la prima volta da Mario Copecchi. Questo metodo sfrutta la ricombinazione omologa per silenziare o inserire un gene inserendone un altro modificato. È utile per studiare alcune malattie umane, come per esempio il piebaldismo (un difetto congenito di pigmentazione dovuto alla mutazione del gene Kit). La stessa mutazione grazie a questa tecnica può essere riprodotta anche nel topo.

La riproduzione cellulare

La sopravvivenza di tutti gli organismi è legata alla loro capacità di crescere e riprodursi. I procarioti si dividono per scissione binaria. La maggior parte dei procarioti ha solamente un cromosoma principale (una lunga e sottile molecola di DNA associata a proteine). In Escherichia Coli (un batterio) il DNA è a forma circolare. Due regioni del cromosoma procariotico hanno un ruolo fondamentale:

• Ori: l'origine della replicazione
• Ter: il sito di fine della replicazione

La riproduzione cellulare negli eucarioti come nei procarioti prevede segnali riproduttivi, replicazione del DNA, segregazione e citodieresi. I dettagli tuttavia sono piuttosto differenti:

• A differenza dei procarioti, gli eucarioti non si dividono ogniqualvolta le condizioni ambientali siano favorevoli.
• A differenza dei procarioti, gli eucarioti possiedono solitamente molti cromosomi. Inoltre la replicazione del DNA è solitamente limitata a una porzione del periodo tra le due divisioni successive della cellula.
• Negli eucarioti i cromosomi replicati sono intimamente associati tra loro (di conseguenza vengono chiamati cromatidi fratelli), e un processo chiamato mitosi permette la segregazione nei due nuclei figli.
• La citodieresi (divisione del citoplasma) procede in maniera diversa nelle cellule vegetali rispetto a quelle animali.

La mitosi

Nel 1892 Walther Flemming individua nel nucleo una sostanza chiamata cromatina, la quale durante la divisione cellulare si organizza in corpi allungati chiamati cromosomi. I cromosomi rappresentano lo stato di massima condensazione del DNA. Quando si addensa il DNA è avvolto intorno agli istoni (agglomerati di proteine basiche che interagiscono con il DNA per la presenza di gruppi fosfato carichi negativamente, formando legami di tipo polare), ad esempio: H2A, H2B, H3, H4. 8 istoni + DNA avvolto = nucleosoma. Il DNA si avvolge attorno agli istoni per circa un giro e mezzo con un numero fisso di basi 147 bp per tutte le specie. Esiste poi un istone H1 che collega gli avvolgimenti attorno a due nucleosomi.

La mitosi è il processo mediante il quale il nucleo di una cellula eucariote si divide dando origine a due nuclei figli, ciascuno dotato di una serie completa di cromosomi. Alla mitosi vera e propria precede una fase chiamata "interfase" dove le cellule solitamente trascorrono la maggior parte del tempo nel ciclo cellulare. L'interfase ha tra sottofasi chiamate: G1 - S - G2. Le cellule che non si dividono rimangono bloccate in G1 che viene chiamata così G0 e questo può essere temporaneo o permanente. Segue poi la mitosi vera e propria, suddivisa in:

• Profase: la cromatina si condensa ed i cromosomi divengono visibili al microscopio ottico.
• Prometafase: la membrana nucleare si dissolve ed i cromosomi, ognuno formato da due cromatidi, si legano al fuso.
• Metafase: i cromosomi si allineano al centro della cellula in posizione equatoriale.
• Anafase: i cromatidi si separano e si allontanano verso i poli opposti della cellula.
• Telofase: una nuova membrana si forma attorno ad ognuno dei due gruppi di cromosomi, appaiono i nucleoli ed i cromosomi divengono meno compatti. Il fuso sparisce.

L'apparato del fuso o semplicemente fuso è la struttura dinamica che separa i cromatidi fratelli durante la mitosi. È fatto di microtuboli. Ma prima che il fuso possa formarsi è necessario che si determini il suo orientamento. Questo è permesso dal centrosoma (corpo centrale) che consiste di un paio di centrioli (che si duplicano anch...)