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Antonio Simone Laganà – Medicina e Chirurgia

membrana nucleare interna). La fosforilazione induce la depolarizzazione delle

lamine che porta alla disgregazione della lamina nucleare. La perdita della mina

nucleare destabilizza l'involucro nucleare, che si disperde in piccole vesicole

membranarie.

La condensazione cromosomica è indotta dalla fosforilazione di alcune proteine

cromosomiche, tra cui l'istone H1 e il complesso multiproteico della condensina.

La fosforilazione delle proteine associate ai microtubuli può facilitare la

formazione del fuso mitotico.

Operazioni relative al punto di controllo G1: il bersaglio principale è la prteina Rb,

un amolecola che controlla l'espressione di geni i cui prodotti proteici sono

necessari per poter oltrepassare il punto di controllo G1 e entrare nella fase S. La

proteina Rb esercita questo tipo di controllo legando il fattore trascrizionale E2F,

una proteina che, quando non è legata ad Rb, attiva la trascrizione dei geni che

codificano per enzimi ed altre proteine necessarie per iniziare la replicazione del

DNA. Finché la proteina Rb è legata a E2F tale molecola è inattiva, e questi geni

restano inespressi, impedendo l'entrata della cellula in fase S.

Nelle cellule che hanno ricevuto uno stimolo proliferativo (per esempio da parte di

un fattore di crescita), la via del segnale mediata da fattori di crescitaporta alla

produzione e all'attivazione di complessi cdk-ciclina che catalizzano la

fosforilazione della proteina Rb. Le molecole di Rb fosforilate perdono così la

capacità di trattenere E2F, e E2F libero attiva la trascrizione dei geni i cui prodotti

sono necessari per l'ingresso in fase S.

La proteina codificata dal gene p53 svolge un ruolo cruciale nell'impedire che le

cellule con il DNA danneggiato superino il punto di controllo G1 con un

meccanismo di azione che si basa in parte sulla inibizione della via che porta alla

fosforilazione di Rb.

L'inizio dell'anafase invece, è indotto da una via di degradazione delle proteine

attivata verso la fine della mitosi ad opera di MPF (il complesso mitotico cdk-

G2). MPF consente il superamento del

ciclina che agisce al punto di controllo

punto di cocntrollo dell'assemblaggio del fuso catalizzando una o più reazionidi

fosforilazione di proteine che portano all'attivazione del complesso che promuove

l'anafase. Il ruolo di questo complesso è quello di segnare il destino degradativo

di alcune proteine bersaglio, legandole alla ubiquitina, una molecola il cui legame

a una proteina ne induce la distruzione.

Il complesso che promuove l'anafase segna il destino degradativo di almeno 2 tipi

di proteine. In primo luogo, induce la degradazione degli inibitori dell'anafase, che

in condizioni normale impediscono l'inizio dell'anafase mantenendo legati i due

cromatidi fratelli. Il secondo tipo di proteina a cui viene legata la ubiquitina è la

ciclina mitotica, la cui concentrazione alla fine della mitosi si abbassa

drasticamente. Essendo la ciclina mitotica una componente di MPF, anche MPF

smette di funzionare. Il complesso che promuove l'anafase induce sia l'inizio

dell'anafase, (attraverso la degradazione degli inibitori dell'anafase) sia il

successivo completamento della mitosi (attraverso la degradazione della ciclina

mitotica). Il completamento di questo passaggio è controllato dai cinetocori dei

cromosomi che, fin quando non sono attaccati ai microtubuli del fuso, rilasciano

una proteina, la Mad2. Mad2 inibisce il complesso che promuove l'anafase,

impedendo quindi l'inizio dell'anafase. Quando tutti i cinetocori sono stati

attaccati al fuso, Mad2 non è più rilasciata, il complesso che promuove l'anafase

non è più inibito e l'anafase può avere inizio.

Gli organismi multicellulari utilizzano proteine extracellulari chiamate fattori di

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crescita, come segnali che contrallano il tasso di crescita cellulare. (fattore di

crescita di derivazione piastrinica PDGF, fattore di crescita epidermico EGF).

I fattori di crescita come PDGF e EGF agiscono legandosi a recettori di membrana

situati sulle cellule bersaglio. I recettori dei fattori di crescita hanno attività

tirosina chinasica. Il legame del il fattore di crescita al recettore ne stimola

l'attività tirosina chinasica, che provoca la fosforilazione di residui di tirosina

situati nella regione intracitoplasmatica del recettore. In tutta la cascata di eventi

che si relazza successivamente ha un ruolo chiave la via di ras.

Il meccanismo con cui la via di ras induce il superamento del punto di controllo di

G1 e l'entrata in fase S ha sei passaggi:

1) il fattore che stimola la crescita si lega al recettore di membrana.

recettore, causando

2) questo legame stimola la attività tirosina chinasica del

quindi la fosforilazione dei residui di trosina

3) le tirosine fosforilate servono come sito di legame per una serie di proteina

adattatrici che, a loro volta, attivano una proteina G associata alla membrana, la

proteina ras. Come nel caso di altre proteine G, la attivazione della proteina ras è

accompagnata al legame di GTP e al rilascio di GDP.

4) la molecola ras attivata stimola una cascata di reazioni di fosforilazione, che

inizia con la fosforilazione di una proteina chinasi detta raf. Nella forma attiva raf

fosforila le serine e le treonine di una proteina chinasi chiamate MEK, che a sua

volta fosforila le treonine e le tirosine di un gruppo di proteine chinasi dette MAP

chinasi.

5) le MAP chinasi attive entrano nel nucleo e fosforilano diversi fattori

trascrizionali, cioè proteine che attivano la trascrizione di geni specifici. Tra le

proteine attivate da questo meccanismo di fosforilazione vi è Jun ( che fa parte

del fattore trascrizionale AP-1) e alcune proteine della famiglia di fattori

trascrizionali ETS. Questi fattori trascrizionali così attivati accendono la

trascrizione dei geni precoci che codicficano per latri fattori trascrizionali come

Myc, Fos e Jun, che, a loro volta, attivano la trascrizione di alcuni geni tardivi: uno

di questi codifica per il fattore E2F.

6) tra i geni tardivi ci sono anche i geni per chinasi e cicline, la cui produzione

porta alla formazione di processi di complessi ciclina-chinasi che fosforilano la

proteina Rb e quindi inducono il passaggio da G1 a S.

alcuni fattori di crescita in realtà inibiscono la proliferazione cellulare. Un esempio

è il fattore di traformazione-beta (TGF-beta), una proteina che, a seconda del tipo

di cellula bersaglio, può avere sia funzione di inibizione che di attivazione della

crescità. Tra le attività anti-proliferative di TGF-beta c'è un'azione antagonista nei

confronti dell'effetto stimolante della crescita di altri fattori come PDGF e EGF.

Quando agisce come inibitore della crescita, TGF-beta legandosi al suo recettore

di superfice, stimola una serie di eventi che fanno aumentare i livelli della proteina

p15, che sopprime l'attività dei complessi cdk-ciclina, bloccando quindi la

progressione del ciclo cellulare. La proteina p15 funziona quindi come cdk

inibitore. un altro fattore che funzione come cdk inibitore è la proteina p21, che

svolge un ruolo cruciale nell'impedire che le cellule che hanno danni al DNA

superino il punto di controllo G1. pag. 7 di 72

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• Citoscheletro

L'interno delle cellule eucariotiche è organizzato attraverso il citoscheletro, che è

strutturato come una rete proteica complessa di filamenti e tubuli interconnessi

che si estende nel citosol, dal nucleo alla faccia interna della membrana

plasmatica. Il citoscheletro serve principalmente nei processi di movimento e di

divisione cellulare e nel posizionare e muovere gli organelli collegati alle

membrane all'interno del citosol, ma prende anche parte ai processi di

segnalazione e di adesione cellulare.

I tre principali elementi strutturali del citoscheletro sono i microtubuli, i

microfilamenti ed i filamenti intermedi (presenti SOLO nelle cellule eucariotiche).

I microtubuli sono composti della proteina tubulina ed hanno un diametro di 25

nm, i microfilamenti sono polimeri di actina ed hanno un diametro di 7 nm, i

filamenti intermedi sono possono essere composti da varie proteine ed hanno un

diametro di 8-12 nm. Inoltre ad ogni filamento possono essere associate diverse

proteine accessorie. Microtubuli e microfialmenti sono strettamente associati alla

motilità cellulare. I microfilamenti sono i componenti strutturali delle miofibrille

muscolari, mentre i microtubuli formano ciglia e flagelli.

Microtubuli

I microtubuli sono gli elementi più grossi del citoscheletro. Nelle cellule

eucariotiche possono essere suddivisi in 2 gruppi:

• il primo gruppo è quello dei microtubuli assonemali, e comprende i microtubuli

altamente organizzati e stabili che si trovano in strutture subcellulari specifiche

associate con il movimento, quali ciglia e flagelli e corpi basali. La struttura

portante o assonema è formata da un fascio di microtubuli assonemali molto

organizzati.

• il secondo gruppo è costituito dalla rete dei microtubuli citoplasmatici. Tali

microtubuli hanno varie funzioni, per esempio servono a mantenere la forma

polarizzata della cellula, oppure servono per formare il fuso mitotico e meiotico

necessario per il movimento dei cromosomi durante la divisione cellulare,

inoltre contribuiscono alla disposizione nello spazio ed al movimento

direzionale di vescicole ed organelli, fornendo un sistema organizzato di fibre-

guida per il movimento. Per esempio servono a controllare la localizzazione del

Golgi e del reticolo endoplasmatico, e sono coinvolti nel movimento attivo delle

vescicole.

I microtubuli sono cilindri cavi con un diametro esterno di 25 nm e uno interno di

15 nm. La parete laterale dei microtubuli è formata da fasci longitudinali di

polimeri lineari chiamati protofilamenti. Generalmente un microtubulo è formato

da 13 protofilamenti accostati fianco a fianco attorno alla cavità centrale.

La subunità di base di un protofilamento è un eterodimero di tubulina. Gli

eterodimeri che formano i protofilamenti sono composti da una molecola di

tubulina-alfa e una di tubulina-beta, che, subito dopo sintesi si associano a

formare l'eterodimero alfa-beta. Ogni proteina si organizza in 3 domini funzionali:

un dominio ammino-terminale che lega il GTP, un dominio centrale a cui si può

associare la colchicina, ed un terzo dominio carbossi-terminale che interagisce

con le proteine associate ai microtubuli (MAP). All'interno di un microtubulo, i

dimeri di tubulina sono orientati nella stessa direzione, e questo comporta una

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sorta di polartà funzionale del protofilamento, perché le due estremità del

protofilamento sono diverse dal punto di vista chimico e strutturale.

Una tappa critica nella formazione dei microtubuli è quella della nucleazione, cioè

l'aggregazione dei dimeri di tubulina in oligomeri, che servono da nuclei da cui i

nuovi microtubuli possono crescere. Quando un microtubulo è stato nucleato,

cresce per aggiunta di subunità ad una estremità, e tale processo e detto

allungamento. La formazione dei microtubuli è inizialmente lenta, dando origine

alla cosidetta fase di ritardo nell'assemblaggio dei microtubuli. Questa fase riflette

il processo relativamente lento di nucleazione, la fase di allungamento è invece

veloce. La massa dei microtubuli aumenta sino ad un punto dove la

concentrazione di tubulina libera diventa limitante e conduce alla fase di

stabilizzazione in cui l'assemblaggio ed il disassemblaggio dei microtubuli si

bilanciano (concentrazione critica).

Un'estremità del microtubulo può crescere o contrarsi più rapidamente dell'altra.

L'estremità in crescita rapida è chiamata estremità positiva, mentre l'altra è detta

estremità negativa. La diversa velocità di crescita alle estremità positive e

negative dei microtubuli riflette le diverse concentrazioni critiche richieste per

l'assemblaggio alle due estremità, concentrazione che è più bassa per l'estremità

positiva che per quella negativa. La simultanea crescita e depolimerizzazione del

microtubulo producono un fenomeno chiamato treadmilling, che si verifica

quando ogni molecola di tubulina incorporata all'estremità positiva è

controbilanciata da una molecola di tubulina che si depolimerizza all'estremità

negativa. Ogni eterodimero di tubulina lega 2 molecole di GTP, una alla porzione

alfa e una alla beta. Il GTP è idrolizzato colo quando l'eterodimero si associa ad un

microtubulo. Secondo il modello di instabilità dinamica c'è l'esistenza di due

popolazioni di microtubuli, una che si accresce in lunghezza per polimerizzazione

continua dell'estremità positiva, l'altra che si accorcia per depolarizzazione,. La

distinzione tra queste due popolazioni sta nel fatto che quella in accrescimento

lega il GTP all'estremità positiva, mentre quella che si accorcia porta legato il

GDP. Poiché le molceole di tubulina che legano il GTP sembrano avere più affinità

fra di loro rispetto alla tubulina che lega il GDP, la presenza di un gruppo di

molecole di tubulina associate al GTP all'estremità positiva crea un cappuccio di

GTP che può associare stabilmente altri dimeri. La perdita del GTP invece crea

un'estremità instabile, a cui può avvenire rapidamente la depolarizzazione.

I microtubuli originano da una struttura cellulare detta MTOC, centro di

organizzazione dei microtubuli. Tale MTOC serve come ounto di assemblaggio e

di ancoraggio di un'estremità dei microtubuli. Molte cellule nell'interfase hanno un

MTOC detto centrosoma, localizzato vicino al nucleo. Il centrosoma delle cellule

animali è normalmente associato con due centrioli circondati da materiale

pericentriolare. All'interno del centrosoma vi è la presenza di un'isoforma di

tubulina, la tubulina-gamma, associta con la proteina pericentrina. La tubulina-

gamma si struttura in anelli alla base dei microtubuli che emergono dal

centrosoma. Il MTOC è in grado di nucleare ed ancorare i microtubuli, per cui i

microtubuli si estendono dall'MTOC verso la periferia della cellula, così l'estremità

negativa resta ancorata al MTOC mentre l'estremità positiva si estende verso la

periferia.gli MTOC influenzano anche il numero di microtubuli di una cellula,

perché hanno limitati siti di nucleazione e di aggancio.

I microtubuli sono anche molto importanti nel corso della mitosi. Prima della

profase il centrosoma si duplica in due centrosomi figli. Questi si separano

durante l'inizio della profase e migrano ai poli opposti della cellula, dove servono

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come poli per la formazione del fuso mitotico. Quando si rompe l'involucro

nucleare, i cromosomi vengono portati ai poli tramite i microtubuli, grazie al fatto

che ogni cinetocore di ogni cromosoma si lega all'estremità positiva dei

microtubuli. Quindi, i microtubuli crescendo dal polo del fuso, incontrano il

cinetocora e si stabilizzano. Quelli che non trovano il cinetocore si destabilizzano

per instabilità dinamica: così ogni cromosoma riesce ad agganciare un

microtubulo tramite il cinetocore e a collegarsi al fuso mitotico.

Le MAP (proteine associate ai microtubuli), costituiscono un ulteriore livello di

regolazione dell'organizzazione dei microtubuli. Le diverse MAP variano

soprattutto per la loro capacità di collegare i microtubuli fra loro o con altre

strutture e nella loro regolazione a livello di polarizzazione/depolarizzazione. Le

MAP si dividono in 2 classi: le MAP motrici, che includono la dineina e la

chinesina, usano ATP per guidare il trasporto di vescicole o d organelli e per

creare forze di scorrimento tra i microtubuli.

La dineina produce un movimento verso l'estremità negativa del microtubulo

(movimento centripeto), la chinesina invece produce un movimento verso

l'estremità positiva del microtubulo (movimento centrifugo).

Le MAP non motrici sono in grado di regolare l'organizzazione microtubulare. Ne

sono esempi la MAP specifica degli assoni Tau (che produce micrtotubuli in fasci

compatti) e la proteina MAP2 (che produce estroflessione del tipo dendritiche). La

funzione di alcune MAP può essere modificata attraverso fosforilazione

(nell'Alzheimer c'è un progressivo deterioramento delle funzioni mentali dovuto

alla morte di cellule neuronali nella corteccia cerebrale e nell'ippocampo, e questi

ammassi neurofibrillari sono dovuti principalmente alla fosforilazione anomala

della proteina Tau, che perde così la capacità di legare i microtubuli e forma

invece filamenti ad elica accoppiati, che precipitano associati ad altre proteine).

Microfilamenti

I microfilamenti hanno un diametro di 7 nm, ed hanno la principale funzione nella

contrattilità delle cellule muscolari dove interagiscono con la miosina( la miosina

di tipo I, monomero, è responsabile del movimento lungo il filamento di actina, la

miosina di tipo 2, filamento, è responsabile del movimento lungo il filamento di

actina nel sarcomero della cellula muscolare) e sono comunque associati a

funzioni di movimento (movimento ameboide, correnti citoplasmatiche, solco di

clivaggio durante la citocinesi). Fasci paralleli di microfilamenti formano anche la

struttura portante dei microvilli.

sintetizzata, si organizza in un struttura ad U che lega ATP o

L'actina, una volta

ADP nella cavità centrale. Le singole molecole di actina sono chiamate actina G

(globulare). Le catene di actina G poi polimerizzano per formare i microfilamenti, e

questa forma è detta actina F (filamentosa). Vi sono inoltre molte proteine che

legano l'actina e ne regolano l'attività. Le actine possono essere divise in due

gruppi principali: le actine muscolo-specifiche (actine alfa) e le actine non

muscolari (beta e gamma), inoltre sono presenti le proteine correlate all'actina

(ARP) che sembrano avere una funzione critica nel processo di nucleazione dei

microfilamenti, come lo aveva la tubulina gamma nel processo di nucleazione dei

microtubuli. I filamenti di actina F che si formano sono composti da due catene

parallele lineari di actina G avvolte ad elica. Anche i microfialementi hanno una

polarità intrinseca. Il frammento S1 della miosina si lega ai microfilamenti di

actina conferendogli una tipica forma a punta di freccia, con tutte le molecole di

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S1 rivolte nella stessa direzione: si stabilisce così estremità appuntita l'estremità

negativa, ed estremità sfrangiata quella positiva. La polarità fa sì che i filamenti di

actina G siano aggiunti e sottratti più rapidamente all'estremità positiva e più

lentamente a quella negativa. Man mano che l'actina G è polimerizzata in actina F

nei microfilamenti, avviene l'idrolisi di ATP ad ADP, così come avviene con il GTP

relativamente ai microtubuli. LE proteine G monomeriche Rac, Rho e Cdc42

regolano l'assemblaggio dei filamenti di actina attivando enzimi chiansi che

fosforilano gli inositoli di membrana, causando quindi un aumento degli inositoli

fosforilati.

Le estremità dei microfilamenti possono essere bloccate da proteine cappuccio

che, inibendo ulteriori aggiunte di o sottrazioni di subunità, stabilizzano il

microfilamento. La proteina cappuccio che lega l'stremità positiva dei

microfilamenti è chiamata capZ, e il suo legame impedisce l'aggiuntà di nuove

subunità all'estremità positiva, mentre la sua rimozione permette di riprendere il

processo di addizione delle subunità.

Filamenti intermedi

I filamenti intermedi hanno un diametro di circa 8-12 nm, sono singoli o

organizzati in fasci ed hanno la funzione strutturale o di sostegno della tendione

cellulare, sono inoltre le strutture più stabili e meno solubili del citoscheletro, si

trovano solo negli organismi multicellulari,e differiscono profondamente come

composizione amminoacidica da tessuto a tessuto. I filamenti intermedi possono

essere raggruppati in sei classi: le classi 1 e 2 comprendono le cheratine, proteine

che organizzano i tonofilamenti delle cellule epiteliali che ricoprono la superficie

del corpo e le sue cavità. Le cheratine di classe 1 sono le cheratine acide, mentre

quelle di classe 2 sono le cheratine basiche o neutre. La classe 3 comprende la

vimentina, la desmina e la proteina fibrillare acida della glia (GFA). La classe 4 è

costituita dalle proteine dei neurofilamenti. La classe 5 è costituita dalle lamine

nuclaeri A, B e C. La classe 6 è data dalla nestina (si trova nei neurofilamenti del

sistema nervoso embrionale). La tipizzazione dei filamenti intermedi serve anche

come strumento diagnostico in medicina ed è particolarmente utile nella diagnosi

di tumori, in quanto le cellule tumorali mantengono i filamenti intermedi

caratteristici del tessuto d'origine, indipendentemente dalla localizzazione del

tumore del corpo. Le proteine dei filamenti intermedi sono fibrose,anziché

globulari, e sono caratterizzate da un dominio centrale a bastoncello formato da

circa 310-318 amminoacidi. Questo dominio centrale consiste di 4 segmenti di

eliche avvolti a spirale inframmezzati da 3 corti segmenti di giunzione. Ai fianchi

dell'elica centrale sono presenti due domini, ammino e carbossi terminale che

rendono conto della diversità funzionale dei diversi filamenti intermedi tessuto-

specifici. La struttura di base dei filamenti intermedi consiste di due polipeptidi

avvolti tra loro in una struttura a spirale. I domini centrali ad elica dei due

polipeptidi sono paralleli ed allineati, mentra i domini ammino e carbossi

terminale sporgono come strutture globulari alle due estremità. Due dimeri si

associano lateralmente a formare un tetramero detto protofilamento. I

protofilamenti interagiscono tra loro e si associano per sovrapposizione laterale e

longitudinale per costituire la struttura filamentosa. Quando è del tutto

assemblato, un filamento intermedio è sotituito da 8 protofilamenti, connessi

testa-testa con sovrapposizione sfalsata.

Nelle cellule epiteliali i tonofilamenti costituiti da cheratina sono connessi a

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placche chiamate desmosomi che formano robuste giunzioni di connessione tra

due cellule vicine. Un'altra struttura, l'emidesmosoma, connette la superficie

basale delle cellule epiteliali con la matrice extracellulare.

Malattie connesse ai filamenti intermedi: epidermolisi bollosa (EBS), sclerosi

laterale amiotrofica (ALS), cardimiopatie ereditarie, Epidermolisi bollosa associata

a distrofia muscolare (EBS-MD, quando manchi l'espressione della proteina

plectrina).

Nel nucleo delle cellule, i filamenti intermedi formano una struttura di supporta

detta lamina nucleare, localizzata al di sotto della membrana interna del nucleo.

La lamina nucleare è composta da 3 proteine distinte dei filamenti intermedi,

chiamate lamine nucleari A, B e C. queste lamine sono fosforilate e si

disorganizzano nel momento in cui una parte dell'involucro nucleare si disgrega

all'inizio della mitosi. Al termine della mitosi, delle fosfatasi specifiche rimuovono

i gruppi fosfato, permettendo all'involucro nucleare di riformarsi.

I 3 elementi citoscheletrici concorrono al mantenimento della tensegrità cellulare,

atta a sopportare lo stress meccanico.

• Complesso del poro nucleare

Il nucleo è circondato da un involucro nucleare costituito da due membrane

interna ed esterna, separate da uno spazio perinucleare con dimensione interna di

20-40 nm. Ogni membrana è spessa 7-9 nm e presenta un'organizzazione

trilaminare. La membrana nucleare interna è appoggiata su una rete di fibre di

sostegno chiamata lamina nucleare, mentra la membrana nucleare esterna è in

comunicazione col reticolo endoplasmatico, rendendo così lo spazio perinucleare

continuo ripetto al RE. Come le membrane del reticolo endoplasmatico rugoso, la

membrana esterna è spesso ricoperta sulla superficie esterna dai ribosomi attivi

nella sintesi proteica.

Sulla membrana nucleare ci sono i pori nucleari, ogni poro è costituito da un

piccolo canale cilindrico che si estende attraverso tutte e due le membrane

dell'involucro nucleare, permettendo la comunicazione fra citosol e nucleoplasma.

La membrana esterna e interna sono fuse tra loro a livello di ogni singolo poro,

formando un canale tappezzato da un'intricata struttura proteica detta complesso

del poro nucleare (NPC), che ha un diametro di circa 120 nm e contiene più di 100

tipi di subunità proteiche diverse. Le sue subunità presentano organizzazione

ottagonale, alcuni complessi del poro presentano granuli centrali. Tale complesso

si struttura quasi come una ruota appoggiata all'interno dell'involucro nucleare:

ognuno dei due anelli paralleli appoggiati sei bordi della ruota consiste di otto

subunità. Otto bracci si estendono dagli anelli verso il mozzo della ruota che

rappresenta il granulo centrale. Tale granulo è chiamato trasportatore, e ci sono

anche proteine che si estendono dal bordo verso lo spazio perinucleare che

ancorano il complesso all'involucro,ed inoltre alcune fibre che si estendono dagli

anelli verso il citosol ed il nucleoplasma. Quelle che si estendono verso il

nucleoplasma formano il "cesto nucleare" (basket).

L'involucro nucleare protegge l'RNA non ancora maturo dell'essere usato dai

ribosomi citoplasmatici o dagli enzimi. Tutti gli enzimi e le proteine necessarie nel

nucleo, per la replicazione dei cromosomi e per la trascrizione del DNA devono

essere importati nel nucleo dal citoplasma. Al contrario, tutte le molecole di RNA

e i ribosomi parzialmente assemblati necessari per la sintesi proteica nel

citoplasma devono arrivare dal nucleo.

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La velocità di ingresso delle particelle nel nucleo è inversamente proporzionale al

loro diametro. Particelle con un diametro maggiore di 10 nm sono escluse dal

passaggio, per questo si è concluso che il complesso del poro contiene dei

piccoli canali acquosi di diffusione, attraverso i quali possono liberamente

muoversi piccole particelle. I pori hanno indicato che i canali acquosi hanno circa

9 nm di diametro, e ci sono 8 canali localizzati alla periferia del complesso del

poro, fra i bracci, e forse anche un nono canale al centro del trasportatore. Le

grosse proteine, come gli enzimi della sintesi del DNA e RNA e i complessi

ribonucleoproteici dell'mRNA e le subunità ribosomiali, attraversano il poro con

un meccanismo di trasporto attivo. Il meccanismo alla base di questo processo è

meglio conosciuto per le proteine che sono attivamente trasportate dal citosol al

nucleo. Queste proteine posseggono uno o più segnali di localizzazione nucleare

(NLS).il limite massimo per questo tipo di trasporto attivo nel complesso del poro

è di 26 nm. Il meccanismo di trasporto attivo all'interno del nucleo comprende 3

passaggi:

1)la proteina contenente il segnale NLS è convogliata dal citosol verso un poro

nucleare. Questo passaggio coinvolge delle proteine citoplasmatiche che fungono

da recettore, le importine, che si legano al segnale NLS e che mediano il

movimento della proteina-NLS verso un poro, forse con l'ausilio delle fibre

citoplasmatiche del poro che in qualche modo funzionano da binari.

• Il complesso importina-proteina-NLS lega la parte citoplasmatica del

complesso del poro nucleare.

• Questo passaggio è energia-dipendente. Il complesso importina-proteina-NLS

è trasportato all'interno del nucleo dal trasportatore, localizzato al centro del

poro. Questo trasporto richiede la presenza di una proteina che idrolizza GTP,

nota come Ran.

Per il processo di esportazione di ribonucleoproteine dal nucleo al citoplasma il

meccanismo è principalmente lo stesso. Le componenti proteiche da esportare

contengono segnali diesportazione nucleare (NES), e questi segnali sono

riconosciuti da proteine dette esportine.

• Trasporto passivo o Diffusione facilitata

Molte sostanze presenti nelle cellule sono troppo grandi o troppo polari per poter

attraversare le membrane per diffusione semplice a velocità ragionevoli, anche se

il processo è esorgonico. Per questo è necessario l'intervento di proteine di

trasporto che mediano tale movimento di soluto entro e fuori la membrana. Se tale

processo è esorgonico, viene definito diffusione facilitata, o trasporto passivo,

perché il soluto diffonde secondo il gradiente di concentrazione o il gradiente

elettrochimico senza che vi sia apporto di energia.

Tutte le proteine di trasporto coinvolte in tali processi sono proteine integrali di

membrana con parecchi segmenti transmembrana. Tali proteine si dividono dal

punto di vista funzionale, in 2 gruppi:

1) le proteine carrier (trasportatori o permeasi), si legano ad una o più molecole di

soluto su un lato della membrana e poi subiscono un cambiamento

conformazionale, che determina il trasferimento del soluto sul lato opposto della

membrana. Una proteina carrie si lega alle molecole del soluto in modo tale da

proteggerne i gruppi polari o provvisti di carica dalla parte interna apolare della

membrana.

• le proteine canale invece formano attraverso la membrana dei canali idrofili

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che permettono il passaggio dei soluti senza alcun cambiamento

conformazionale. Alcuni di questi canali sono larghi e aspecifici, come i pori

presenti nelle membrane di batteri, mitocondri e cloroplasti. I pori sono formati

da proteine transmembrana dette porine, che permettono il passaggio di soluti

idrofili selezionati fino a 600 Da. Tuttavia alcuni di questi canali sono altamente

selettivi, ed altri ancora sono coinvolti nel passaggio di ioni e sono detti canali

ionici.

Una proteina carrier è una proteina allosterica che si alterna tra due stadi

conformazionali, in maniera tale che il sito della proteina a cui si lega il soluto è

aperto o accessibile prima su un lato della membrana e poi sull'altro.

Le proteine carrier funzionano un po’ come gli enzimi, perché attuano una

dimuzione dell'energia di attivazione della reazione dovuta al coinvolgimento della

proteina catalizzatrice, e per questo tali processi seguono le cinetica di Michaelis-

Mentev. Le proteine carrier inoltre sono altamente specifiche. Le proteine carrier

sono soggette anche ad inibizione competitiva.

Quando una proteina carrier trasporta attraverso la membrana un singolo soluto, il

processo è chiamato uniporto. Quando due soluti vengono trasportati

contemporaneamente ed il loro trasporto è accoppiato in modo tale che il

trasporto dell'uno si interrompe se l'altro è assente, il processo è definito

cotrasporto o trasporto accoppiato. Nel cotrasporto, il processo viene chiamto

simporto,se i due soluti si spostano nella stessa direzione, o antiporto se i due

soluti si spostano in direzioni opposte.

Il passaggio di glucosio all'interno di un eritrocita è un esempio di trasporto

facilitato attraverso la membrana plasmatica, mediato da una proteina carrier

uniporto chiamata GluT. La bassa concentrazione intracellulare di glucosio, che

rende possibile per la maggior parte delle cellule animali la diffusione facilitata,

viene mantenuta grazie al fatto che il glucosio, appena entrato, viene subito

fosforilato a glucosio-6-fosfato dall'enzima esochinasi, con l'intervento dell'ATP

che funge da donatore di fosfato e da fonte di energia. La fosforilazione del

glucosio ha anche l'effetto di mantenere il glucosio nella cellula, poiché la

membrana plasmatica dell'eritrocita non possiede una proteina di trasporto per il

glucosio-6-fosfato.

Una proteina carrier antiporto presente nella membrana plasmatica dell'eritrocita è

la proteina scambiatrice di anioni,o scambiatore cloruro-bicarbonato o proteina

della banda 3, con accoppiamento obbligatorio degli ioni cloruro e bicarbonato.

Il flusso rapido degli ioni bicarbonato, reso possibile da questa proteina, è

essenziale per il ruolo espletato dall'eritrocita nel trasporto della CO2 dai tessuti ai

polmoni. Nella forma gassosa la CO2 non è molto solubile nelle soluzioni acquose

quali il citoplasma o il plasma sanguigno. La proteina scambiatrice di anioni,

tuttavia, facilita il trasporto di CO2: non appena la CO2 diffonde nell'eritrocita,

viene convertita in anioni bicarbonato dall'anidrasi carbonica, un enzima del

citosol, che vengono poi trasportati all'esterno mentre gli ioni cloro si muovono

all'interno per bilanciare la carica. Nei polmoni il processo è invertito: gli anioni

bicarbonato entrano nell'eritrocita scambiandosi con gli ioni cloro e sono

convertiti in CO2 dall'anidrasi carbonica. La CO2 poi diffonde al di fuori

dell'eritrocita e all'interno delle cellule che tappezzano i vasi capillari del polmone.

La quantità di bicarbonato trasportato in questo modo è sufficiente per reggere il

ritmo della produzione di CO2 nel corpo.

Vi sono principalmente 3 tipi di proteine canale transmembrana: i canali ionici, le

porine e le acquaporine. pag. 14 di 72

Antonio Simone Laganà – Medicina e Chirurgia

La struttura dei canali ionici è quella di un poro molto piccolo rivestito da gruppi

laterali di amminoacidi idrofili, per questo sono molto selettivi. La selettività si

attua principalmente per differenza di carica o di dimensioni. Molti canali ionici

sono controllati, possono cioè essere aperti e chiusi mediante cambiamenti

conformazionali della proteina, regolando così il flusso degli ioni. Nelle cellule

animali, 3 diversi tipi di stimoli inducono cambiamenti conformazionali nei canali

controllati:

1) i canali a controllo di potenziale si aprono e si chiudono in risposta a

cambiamenti del potenziale di membrana.

2) i canali a controllo di ligando sono innescati dal legame alla proteina canale di

sostanze specifiche.

3) i canali a controllo meccanico rispondono a forze meccaniche che agiscono

sulla membrana.

La trasmissione dei segnali elettrici da parte delle cellule nervose dipende dai

cambiamenti rapidi e controllati degli ioni Na+ e K+, attraverso i loro rispettivi

canali. Oltre a questo tipo di regolazione a breve termine, molti canali ionici sono

soggetti a regolazione a lungo termine, più che altro per controllo ormonale.

Le porine sono proteine transmembrana multipasso. La caratteristica principale

delle porine è che i segmenti transmembrana attraversano la membrana non in

forma di alfa-elica, ma di beta-foglietto cilindrico chiuso denominato beta-barrel, il

quale ha nella parte centrale un poro ripieno di acqua. La parte interna del poro è

tappezzata di catene laterali polari, mentre la parte esterna è formata da porzioni

apolari che interagiscono con la porzione idrofoba della membrana. Il complesso

della porina permette così il passaggio di diversi soluti idrofili.

Le acquaporine permettono il passaggio veloce di acqua all'interno e all'esterno

della membrana. Le acquaporine sono proteine integrali di membrana con sei

segmenti transmembrana elicoidali. Nel caso di AQP-1, l'acquaporina presente bei

tubuli renali, l'unità funzionale è costituita da un tetramero formato da 4 monomeri

identici. Tali subunità formano un canale grazie ai loro segmenti transmembrana.

• Equilibrio chimico del potenziale di membrana.

Un potenziale di membrana è una proprietà fondamentale di tutte le cellule che

deriva dal fatto che la cellula a riposo in genere ha un eccesso di carico negativa

all'interno ed un eccesso di carica positiva all'interno, si dice appunto che la

cellula ha un potenziale di membrana a riposo negativo.Nelle cellule che hanno

eccitabilità elettrica (nerovose, muscolari, isole del pancreas endocrino), alcuni

tipi di stimoli inducono una rapida sequenza di modificazioni del potenziale di

membrana detta potenziale di azione. Durante il potenziale di azione, in poco più

di un millisecondo il potenziale di membrana cambia da negativo a positivo per

poi tornare negativo. Nelle cellule nervose tale cambiamento del potenziale di

membrana temporaneo ha la funzione di trasmettere il segnale elettrico lungo

l'assone.

Il potenziale di membrana a riposo si genera per il diverso contenuto di anioni e

cationi fra il citosol della cellula e il fluido extracellulare. Il fluido extracellulare è

una soluzione acquosa di sali, tra cui il cloruro di sodio e, in quantità minore, il

cloruro di potassio. Il catione principale del citosol, invece, a causa dell'azione

della pompa Na+/K+ è il potassio e non il sodio. Gli anioni contenuti nel citosol

sono per lo più macromolecole, come proteine, RNA ecc. queste macromolecole

cariche negativamente non riescono a passare all'esterno della membrana

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plasmatica e restano quindi all'interno della cellula. La presenza nel citosol di

questi anioni non diffusibili è il motivo principale per cui la cellula ha un

potenziale di membrana a riposo.

Le cellule in genere hanno una concentrazione di ioni potassio alta all'interno e

bassa all'esterno: questa diversa distribuzione degli ioni potassio è detta

gradiente dello ione potassio, per cui gli ioni potassio avranno la tendenza ad

uscire dalla cellula. Nel citosol i cationi K+ bilanciano la carica degli anioni

(macromolecole proteiche), mentra all'esterno della cellula, i cationi Na+

bilanciano la carica degli anioni Cl-. La tendenza di due ioni a riunirsi è detta

potenziale. Nel momento in cui due ioni con carica opposta si muovono per

riunirsi si genera una corrente, misurata in ampére. Per questi principi si genera il

potenziale di membrana a riposo: la membrana plasmatica, in genere, è

permeabile al potassio in quanto provvista di alcuni tipi di canali del potassio, che

permettono una certa diffusione di questi ioni all'esterno della cellula. Non

esistono invece canali per le macromolecole cariche negativamente. Quindi,

quando il potassio esce dal citosol, rimangono intrappolati all'interno anioni privi

di controione; nel citosol si accumula così un eccesso di carica negativa, mentre

all'esterno si accumula un eccesso di carica positiva, per cui si genera così il

potenziale di membrana.

Si raggiunge un equilibrio quando la forza di attrazione dovuta al potenziale di

membrana controbilancia la tendenza del potassio a diffondere lungo il suo

gradiente di concentrazione. Questo tipo di equilibrio, in cui un gradiente chimico

è controbilanciato da un potenziale elettrico, si definisce equilibrio elettrochimico.

Il potenziale di membrana al punto di equilibrio viene detto potenziale di

membrana all'equilibrio. Dato che il gradiente di ioni potassio svolge il lavoro di

separare le cariche negative da quelle positive fino al raggiungimento di un

potenziale di membrana all'equilibrio, l'ampiezza del gradiente di ioni potassio

determina il valore del potenziale di membrana all'equilibrio.

• Il collagene

I componenti più abbondanti della matrice extracellulare (MEC) delle cellule

animali sono una famiglia di proteine chiamate collageni, che formano fibre con

elevata resistenza alla trazione. I collageni sono secreti da diversi tipi di cellule

dei tessutio connettivi quali i fibrioblasti. Il collagene è presente soprattuttoo nei

tendini e nei legamenti. Tutti i collageni hanno in comune due caratteristiche

specifiche: la presenza di una tripla elica rigida di tre catene polipeptidiche

avvolte tra loro e una composizione amminoacidica inusuale. In particolare i

collageni sono caratterizzata dall'elevata presenza degli amminoacidi glicina,

idrossiprolina, idrossilisina. La presenza della glicina rende possibile la

formazione della tripla elica in quanto la spaziatura della glicina nella sequenza

amminoacidica la posiziona sull'asse dell'elica e questo è l'unico amminoacido

sufficientemente piccolo da trovar spazio all'interno della tripla elica stessa.

Ciascuna fibra di collagene è composta da numerose fibrille. Una fibrilla a sua

volta è costituita da numerose molecole di collagene, ciascuna delle quali

consiste di 3 catene polipeptidiche, chiamate catene alfa, avvolte tra loro in una

tripla elica destrorsa rigida. Le molecole di collagene hanno una lunghezza di

circa 270 nm ed diametro di 1,5 nm, e sono allineate lateralmnte con legame testa-

coda all'interno della fibrilla. pag. 16 di 72

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Nel lume del reticolo endoplasmatico tre catene alfa si assemblano formando una

tripla elica chiamata pro-collagene. Ad entrambe le estremità della tripla elica

sono presenti brevi tratti di sequenze amminoacidiche non strutturate che

prevengono la polimerizzazzione in fibrille all'interno della cellula. Una volta

secreto nella spazio pericellulare, il pro-collagene è convertito in collagene ad

opera di una peptidasi specifica, un enzima che rimuove i tratti amminoacidici alle

estremità ammino e carbossi terminale della molecola di pro-collagene. Le

molecole così modificate interagiscono spontaneamente e polimerizzano

formando le fibrille collageniche mature che successivamente si associano

formando la fibra. La stabilità delle fibre collagene è rinforzata ponti H che

coinvolgono gli ossidrili dei residui di idrossiprolina e di idrossilisina delle catene

alfa. Questi ponti H formano legami crociati sia all'interno che tra le singole

molecole di collagene presenti in una fibrilla.

Nei vertebrati sono note 25 catene alfa differenti, ciascuna delle quli è codificata

da un gene specifico e possiede una sequenza amminoacidica caratteristica.

Queste catene alfa si associano in varie combinazioni generando 15 tipi differenti

di molecole di collagene, la maggioranza delle quali si trova in tessuti specifici. I

collageni 1,2,3 sono i più abbondanti. Le fibrille di collagene 1,2,3,5 mostrano una

striatura caratteristica formata da bande trasversali che si ripetono con un

periodo di 67 nm.

• Integrine

Le fibronectine e le laminine si legano alle cellule, poiché queste espongono sulla

membrana recettori glicoproteici che riconoscono e legano regioni specifiche di

queste proteine della matrice. Questi recettori, insieme a recettori per altre

molecole della matrice extracellulare, appartengono ad una famiglia di

glicoproteine transmembrana chiamate integrine, il cui ruolo è appunto quello di

integrare meccanicamente e funzionalmente la matrice extracellulare con il

citoscheletro. Le integrine sono importanti recettori,tramite i quali le proteine

della matrice, quali i collageni, le fibronectine e le laminine possono legarsi alle

cellule controllandone l'organizzazione e la funzione.

Le integrine sono costituite da due catene polipeptidiche transmembrana, le

subunità alfa e beta, che si associano in modo non covalente formando un

dimero. Il dimero alfa/beta alla superficie esterna della membrana forma un sito di

legame per le proteine adesive extracellulari. La specificità di legame dipende in

modo particolare dalla subunità alfa. Sul versante citoplasmatico della membrana,

le integrine legano molecole del citoscheletro specifiche, permettendo così

l'interazione fisica tra il citoscheletro e la matrice extracellulare attraverso la

membrana plasmatica. La presenza di diverse subunità alfa e beta porta alla

formazione di un numero elevato di eterodimeri di integrine che differiscono nella

capacità di legame con le proteine della matrice e che sono espressi su diversi

tipi cellulari.

Le integrine che contengono la subunità beta1 sono presenti sulla membrana di

quasi tutte le cellule animali e mediano l'adesione di queste alla matrice

extracellulare. Le integrine che hanno la subunità beta2 sono presenti solo sulla

membrana dei leucociti e controllano le interazioni cellula-cellula. Molte integrine

riconoscono la sequenza RGD nelle glicoproteine della matrice che cono capaci di

legare.

Il recettore della fibronectina è l'integrina meglio caratterizzata. Il recettore della

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fibronectina è una proteina transmembranaria con un sito di legame per la

sequenza RGD della fibronectina sul versante esterno della membrana. Sul

versante esterno il recettore ha un sito di legame per la talina, una proteina del

citoscheletro che a sua volta lega la vincolina e quindi i microfilamenti di actina.

L'affinità dell'integrina per la talina dipende dallo stato di fosforilazione di una

tirosina presente nel sito di legame per questa proteina. quando la tirosina non è

fosforilata, il sito di legame ha un'alta affinità per la talina. Tuttavia, quando la

tirosina è fosforilata da una chinasi specifica, l'affinità di legame diminuisce

portando alla dissociazione della talina, e quindi alla rottura del legame tra la

fibronectina e i microfilamenti di actina del citoscheletro.

Le integrine giocano un ruolo chiave nella connessione della matrice

extracellulare con il citoscheletro grazie alla capacità di legare i componenti della

matrice extracellulare alla superfice esterna ed i filamenti di actina alla superficie

citoplasmtica della membrana. Grazie a questa interazione la matrice

extracellulare e il citoscheletro si influenzano a vicenda.

• La via di Ras

Il meccanismo con cui la via di ras induce il superamento del punto di controllo di

G1 e l'entrata in fase S ha sei passaggi:

1) il fattore che stimola la crescita si lega al recettore di membrana.

2) questo legame stimola la attività tirosina chinasica del recettore, causando

quindi la fosforilazione dei residui di trosina

3) le tirosine fosforilate servono come sito di legame per una serie di proteina

adattatrici che, a loro volta, attivano una proteina G associata alla membrana, la

proteina ras. Come nel caso di altre proteine G, la attivazione della proteina ras è

accompagnata al legame di GTP e al rilascio di GDP.

4) la molecola ras attivata stimola una cascata di reazioni di fosforilazione, che

inizia con la fosforilazione di una proteina chinasi detta raf. Nella forma attiva raf

fosforila le serine e le treonine di una proteina chinasi chiamate MEK, che a sua

volta fosforila le treonine e le tirosine di un gruppo di proteine chinasi dette MAP

chinasi.

5) le MAP chinasi attive entrano nel nucleo e fosforilano diversi fattori

trascrizionali, cioè proteine che attivano la trascrizione di geni specifici. Tra le

proteine attivate da questo meccanismo di fosforilazione vi è Jun ( che fa parte

del fattore trascrizionale AP-1) e alcune proteine della famiglia di fattori

trascrizionali ETS. Questi fattori trascrizionali così attivati accendono la

trascrizione dei geni precoci che codificano per latri fattori trascrizionali come

Myc, Fos e Jun, che, a loro volta, attivano la trascrizione di alcuni geni tardivi: uno

di questi codifica per il fattore E2F.

6) tra i geni tardivi ci sono anche i geni per chinasi e cicline, la cui produzione

porta alla formazione di processi di complessi ciclina-chinasi che fosforilano la

proteina Rb e quindi inducono il passaggio da G1 a S.

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• Lisosomi di degradare tutte le

Il lisosoma è un organulo contenente enzimi digestivi capaci

capaci di degradare tutte le principali classi di macromolecole biologiche, che

includono i lipidi, i carboidrati, gli acidi nucleici e le proteine. Gli enzimi digestivi

sono necessari per degradare materiali extracellulari introdotti per endocitosi, e

per digerire strutture intracellulari e macromolecole che sono danneggiate o non

più necessarie.

I lisosomi contengono fosfatasi acida, beta-glucuronidasi, una

desossiribonucleasi, una ribonucleasi, e una proteasi. Il lisosoma è circondato da

una singola membrana, questa membrana è determinante per proteggere il resto

della cellula dagli enzimi idrolitici contenuti in esso. Pompe protoniche ATP-

dipendenti mantengono all'interno del lisosoma una ambiente acido (ph 4-5) che

favorisce la digestione enzimatica delle molecole denaturandole parzialmente. I

prodotti della digestione vengono così trasportati, passivamente o attivamente,

attraverso la membrana del citosol, dove entrano in varie vie sintetiche o vengono

espulsi dalla cellula.

Tutti gli gli enzimi lisosomali hanno la proprietà comune di essere idrolasi acide,

ed idrolici con un PH ottimale intorno a 5. Ci sono 5 fosfatasi, 14 proteasi e

peptidasi, 2 nucleasi, 6 lipasi, 13 glicosidasi, 7 solfatasi. Un'ampia glicosilazione

dei componenti della membrana esposti all'interno del lisosoma maturo protegge

la membrana lisosomale della degradazione. Gli enzimi lisosomiali vengono

sintetizzati dai ribosomi adesi al RE rugoso e trasferiti nel lume del RE, prima di

essere trasportati al complesso di Golgi. Dopo aver subito modificazione e

maturazione nel RE e nel complesso di Golgi ad opera di alcuni degli stessi

enzimi che modificano e maturano le glicoproteine di secrezione e della

membrana plasmatica, gli enzimi lisosomiali sono selezionati dalle altre proteine

del TGN. Gli enzimi lisosomiali vengono impacchettati in vescicole rivestite da

clatrina che gemmano dal TGN, perdono i loro rivestimenti proteici e viaggiano

verso uno dei compartimenti endosomiali. Un endosoma tardivo è un orgulo con

un corredo completo di idrolasi acide, ma non ancora impegnato nell'attività

digestiva. Dopo che le idrolasi acide provenienti dal TGN si sono unite al

materiale extracellulare e intracellulare portati da un endosoma precoce,

l'endosoma tardivo forma un lisosoma pienamente attivo. Durante questo

processo l'attività continuata delle pompe protoniche ATP-dipendente abbassa il

ph da circa 5,5 nell'endosoma tardivo a 4-5 nel lisosoma, favorendo l'attivazione

delle idrolasi acide e la parziale denaturazione del materiale destinato alla

degradazione.

Per distinguere tra i lisosomi maturi di origine diversa denominiamo lisosomi

eterofagici quei lisosomi che contengono ostanze di origine extracellulare, mentre

quelli con materiale di origine intracellulare vengono chiamati lisosomi autofagici.

I processi specifici in cui vengono coinvolti gli enzimi lisosomiali sono la

fagocitosi, l'endocitosi mediata da recettore, l'autofagia e la digestione

extracellulare.

Tali vescicole di endocitosi possono accumulare proteine lisosomiali mediante:

• la fusione con vescicole di trasporto che provengono direttamente dal TGN

• la formazione di associazioni transitorie con endosomi precoci o tardivi, mai

fondendosi in maniera permanente con un compartimento lisosomiale.

• La fusione diretta con endosomi tardivi

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Alla fine comunque rimane nel lisosoma soltanto il materiale non digerito che,

quando la digestione cessa, diventa un corpo residuo (causando l'invecchiamento

cellulare). La digestione degli organuli o delle altre strutture cellulari vecchie o

danneggiate è definita autofagia: macrofagia e microfagia.

La macrofagia comincia quando un organulo, o un'altra struttura,viene avvolta da

una doppia membrana di derivazione dal RE. La vescicola che si viene a formare è

chiamata vacuolo autofagico. La microfagia comporta la formazione di un vacuolo

autofagico molto più piccolo, circondato da un solo doppio strato fosfolipidico

che racchiude piccole parti di citoplasma.

Alcune malattie infiammatorie, come l'artrite reumatoide, sono determinate da

un'involontaria liberazione di enzimi lisosomiali all'interno delle articolazioni. Si

ritiene che il cortisone e l'idrocortisone, ormoni steroidei, siano agenti anti-

infiammatori efficaci, grazie alla loro azione di stabilizzazione delle membrane

lisosomiali e perciò di inibizione della liberazione degli enzimi.

Le malattie connesse al malfunzionamento dei processi di dogestione lisosomiale

sono per lo più date dall'accumulo di prodotti indigeriti e dannosi.

La glicogenosi di tipi 2 è causata dall'accumulo di quantità eccessive di glicogeno

nel fegato, nel cuore e nei muscoli scheletrici, per carenza dell'enzima lisosomiale

alfa-1,4-glicosidasi.

Vi sono anche la sindrome di Hurler (l'enzima difettoso è la alfa-L-ialuronidasi) e la

sindrome di Hunter, e la malattia di Tay-Sachs, una condizione ereditata come

carattere recessivo, cha a causa della mancanza dell'enzima lisosomiale beta-N-

acetilesosamminidasi, responsabile della scissione della N-acetil-galattosammina

terminale dalla porzione glucidica del ganglioside, e tale situazione determina

l'accumulo dei gangliosidi a livello dei tessuti nervosi.

• Matrice extracellulare

Le strutture extracellulari negli organismi eucarioti hanno caratteristiche comuni:

consistono di lunghe molecole fibrose flessibili immerse in una matrice cellulare

idratata amorfa di glicoproteine e polisaccaridi ramificati. Tale matrice

extracellulare (MEC) è importante per i processi di motilità, differenziamento e

adesione.

La MEC delle cellule animali è formata da 3 classi di molecole:

1. proteine strutturali, quali i collageni e le elastine, che conferiscono restistenza e

flessibilità.

• complessi di proteine e polisaccaridi definiti proteoglicani che costituiscono le

molecole idratate in cui sono immerse le proteine strutturali

• glicoproteine adesive quali le fibronectine e le laminine (i loro recettori sono le

integrine).

• Collagene = vedi risposta specifica sul collagene

• Elastina = le elastine sono ricche di amminoacidi glicina e prolina. Tuttavia la

prolina non è idrossilata né sono presenti residui di idrossilisina. Le molecole

di elastina sono legate fra loro da legami crociati covalenti tra i residui di lisina.

• Fibronectina = è formata da due catene polipeptidiche molto grandi legate in

prossimità del carbossi-terminale da due ponti disolfuro.ogni subunità è

organizzata in una serie di regioni globulari connesse da brevi tratti flessibili.

Alcuni frammenti di fibronectina hanno la capacità di legare i recettori di

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membrana grazie ad una sequenza specifica detta RGD, (arginina-glicina-

aspartico). Tale sequenza è riconosciuta da diversi recettori della famiglia delle

integrine.

• Laminine = rappresentano la seconda grande famiglia di glicoproteine adesive.

Le laminine sono presenti esclusivamente nelle lamine basali, una struttura

planare di proteine della matrice di circa 50 nm di spessore, frapposta tra le

cellule epiteliali e il connettivo sottostante. Tutte le forme di lamina basale

contengono collagene di tipo 4, proteoglicani e una proteina detta entactina. La

laminina è una glicoproteina molto grande, costituita da 3 lunghe catene

polipeptidiche chiamate alfa, beta1 e beta2. Le tre catene formano una struttura

a croce stabilizzata da ponti disolfuro con parte del braccio lungo avvolto in

una spirale a 3 filamenti. Come la ficronectina, anche la laminina consiste di

regioni differenti capaci di legare il collagene di tipo 4, l'eparina, eparan-solfato,

entactina. Queste proprietà di legame permettono alla laminina di fungere da

molecola-ponte tra le cellule e la lamina basale.

• Integrine = vedi risposta apposita.

• Glicocalice = le cellule animali presentano subito al di sopra della membrana

plasmatica, una zona con un elevato numero di carboidrati detta glicocalice,

che protegge la superficie cellulare, permette denomeni di riconoscimento e di

adesione e forma una barriera di permeabilità. Consiste di due porzioni:

glicocalice ancorato, che consiste di elementi che fanno parte della membrana

stessa (catene glucidiche legate covalentemente alle glicoproteine integrali di

membrana o ai glicolipidi); e glicocalice disancorato, consiste di porzioni che

possono essere rimosse senza danneggiare la cellula o la membrana.

L'adesione fra le cellule è mediata dal legame di una molecola di N-cam (molecola

adesiva dei neuroni) su una cellula con una molecola uguale su di un'altra cellula.

Un'altra famiglia di glicoproteine adesive che mediano il riconoscimento cellulare

è quella delle caderine, che richiedono ioni calcio per un cambiamento

conformazionale che permette l'adesione. Le caderine sono tessuto-specifiche.

Un altro tipo di proteine che favoriscono l'adesione sono le lectine.

• Giunzioni cellulari

Sono di tre tipi: adesive, occludenti e comunicanti.

• Le giunzioni adesive permettono il collegamento fra il citoscheletro di due

cellule diverse. Delle giunzioni adesive fanno parte le giunzioni aderenti, i

desmosomi e gli emidesmosomi. Queste tre giunzioni contengono 2 tipi di

proteine: le proteine di ancoraggio intracellulare, che permettono il legame

della giunzione con i filamenti di citoscheletro all'interno della cellula, e le

proteine di giunzione transmembrana, che sporgono dalla superficie della

cellula e permettono il legame con altre cellule o con la MEC. Le proteine di

ancoraggio intrecellulare formano uno strsto fibroso spesso indicato come

placca sul versante citoplasmatico della membrana plasmatica.

• Giunzioni occludenti non lasciano spazio tra le membrane delle cellule, e

servono principalmente per isolare spazi del nostro corpo permettendo una

netta compartimentazione. Ogni giunzione appare come una serie di filamenti

intrecciati che costituisce una fascia di giunzione, e ciascuno dei filamenti è

costituito da un insieme di proteine giunzionali transmembrana.

• Giunzione comunicante è una regione dove le membrane di due cellule sono

allineate ad una distanza di di 2-3 nm. Questa connessione mette in contatto il

citoplasma delle due cellule, permettendo lo scambio di ioni e piccole molecole

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e quindi instaurando una comunicazione chimica ed elettrica. in questa regione

le membrane delle due cellule sono legate da connessoni, strutture a cilindro

cavo formate da proteine transmembrana strettamente addossate. Ogni

connessone è un cilindro cavo formato da sei subunità di una proteina

chiamata connessina.

• Microvillo

I microvilli sono strutture caratteristiche della porzione apicale delle cellule della

mucosa intestinale, ogni microvillo è lungo 1-2 micron ed ha un diametro di 0,1

micron. I microvilli servono principalmente ad aumentare la superficie assorbente

della cellula. La struttura portante del microvillo è data da un denso fascio di

microfilamenti. Le estremità positive sono rivolte verso la punta, dove sono

ancorate alla membrana tramite una placca amorfa elettrondensa. I microfilamenti

sono inoltre connessi anche lateralmente alla membrana plasmatica tramite le

proteine misonia 1 e calmodulina. Microfilamenti adiacenti sono in stretto contatto

grazie a legami a distanze regolari resi possibili dalle proteine fimbrina e villina.

Alla base dei microvilli, i fasci di microfilamenti si estendono in una rete di

filamenti detta trama terminale, ed in tale trama i filamenti sono arricchiti da

miosina e spectrina, che collegano i filamenti uno all'altro ed a proteine localizzate

nella membrana plasmatica e forse anche con la rete di filamenti intermedi

localizzata sotto la trama terminale. La trama conferisce rigidità ai microvilli

ancorando i fasci di microfilamenti in modo che essi si possano proiettare in alto

verso superficie cellulare.

• Nucleo

Il nucleo è il luogo all'interno della cellula eucariotica dove sono localizzati e

replicati i cromosomi e dove il DNA in essi contenuto, viene trascritto. il nucleo

rappresenta quindi sia il luogo di deposito della maggiore parte delle informazioni

genetiche della cellula, sia il centro di controllo per l'espressione di questa

informazione. Il nucleo è circondato da un involucro nucleare costituito da due

membrane interna ed esterna, separate da uno spazio perinucleare con

dimensione interna di 20-40 nm. Ogni membrana è spessa 7-9 nm e presenta

un'organizzazione trilaminare. La membrana nucleare interna è appoggiata su una

rete di fibre di sostegno chiamata lamina nucleare, mentra la membrana nucleare

esterna è in comunicazione col reticolo endoplasmatico, rendendo così lo spazio

perinucleare continuo ripetto al RE. Come le membrane del reticolo

endoplasmatico rugoso, la membrana esterna è spesso ricoperta sulla superficie

esterna dai ribosomi attivi nella sintesi proteica.

Sulla membrana nucleare ci sono i pori nucleari, ogni poro è costituito da un

piccolo canale cilindrico che si estende attraverso tutte e due le membrane

dell'involucro nucleare, permettendo la comunicazione fra citosol e nucleoplasma.

La membrana esterna e interna sono fuse tra loro a livello di ogni singolo poro,

formando un canale tappezzato da un'intricata struttura proteica detta complesso

del poro nucleare (NPC), che ha un diametro di circa 120 nm e contiene più di 100

tipi di subunità proteiche diverse. Le sue subunità presentano organizzazione

ottagonale, alcuni complessi del poro presentano granuli centrali. Tale complesso

si struttura quasi come una ruota appoggiata all'interno dell'involucro nucleare:

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ognuno dei due anelli paralleli appoggiati sei bordi della ruota consiste di otto

subunità. Otto bracci si estendono dagli anelli verso il mozzo della ruota che

rappresenta il granulo centrale. Tale granulo è chiamato trasportatore, e ci sono

anche proteine che si estendono dal bordo verso lo spazio perinucleare che

ancorano il complesso all'involucro,ed inoltre alcune fibre che si estendono dagli

anelli verso il citosol ed il nucleoplasma. Quelle che si estendono verso il

nucleoplasma formano il "cesto nucleare" (basket).

L'involucro nucleare protegge l'RNA non ancora maturo dell'essere usato dai

ribosomi citoplasmatici o dagli enzimi. Tutti gli enzimi e le proteine necessarie nel

nucleo, per la replicazione dei cromosomi e per la trascrizione del DNA devono

essere importati nel nucleo dal citoplasma. Al contrario, tutte le molecole di RNA

e i ribosomi parzialmente assemblati necessari per la sintesi proteica nel

citoplasma devono arrivare dal nucleo.

La velocità di ingresso delle particelle nel nucleo è inversamente proporzionale al

loro diametro. Particelle con un diametro maggiore di 10 nm sono escluse dal

passaggio, per questo si è concluso che il complesso del poro contiene dei

piccoli canali acquosi di diffusione, attraverso i quali possono liberamente

muoversi piccole particelle. I pori hanno indicato che i canali acquosi hanno circa

9 nm di diametro, e ci sono 8 canali localizzati alla periferia del complesso del

poro, fra i bracci, e forse anche un nono canale al centro del trasportatore. Le

grosse proteine, come gli enzimi della sintesi del DNA e RNA e i complessi

ribonucleoproteici dell'mRNA e le subunità ribosomiali, attraversano il poro con

un meccanismo di trasporto attivo. Il meccanismo alla base di questo processo è

meglio conosciuto per le proteine che sono attivamente trasportate dal citosol al

nucleo. Queste proteine posseggono uno o più segnali di localizzazione nucleare

(NLS).il limite massimo per questo tipo di trasporto attivo nel complesso del poro

è di 26 nm. Il meccanismo di trasporto attivo all'interno del nucleo comprende 3

passaggi:

1)la proteina contenente il segnale NLS è convogliata dal citosol verso un poro

nucleare. Questo passaggio coinvolge delle proteine citoplasmatiche che fungono

da recettore, le importine, che si legano al segnale NLS e che mediano il

movimento della proteina-NLS verso un poro, forse con l'ausilio delle fibre

citoplasmatiche del poro che in qualche modo funzionano da binari.

• Il complesso importina-proteina-NLS lega la parte citoplasmatica del

complesso del poro nucleare.

• Questo passaggio è energia-dipendente. Il complesso importina-proteina-NLS

è trasportato all'interno del nucleo dal trasportatore, localizzato al centro del

poro. Questo trasporto richiede la presenza di una proteina che idrolizza GTP,

nota come Ran.

Per il processo di esportazione di ribonucleoproteine dal nucleo al citoplasma il

meccanismo è principalmente lo stesso. Le componenti proteiche da esportare

contengono segnali di esportazione nucleare (NES), e questi segnali sono

riconosciuti da proteine dette esportine. La lamina nucleare è una sottile e densa

rete di fibre che tappezzano la superficie interna della membrana nucleareinterna

che serve da sostegno per l'involucro nucleare. La lamina nucleare è spessa circa

10-40 nm ed è costituita da filamenti intermedi costituiti da proteine chiamate

lamine. Alcuni di questi filamenti sembrano essere connessi con le proteine della

membrana nucleare interna. Oltre a essere un supporto per l'involucro nucleare,

la lamina nucleare può anche fornire punti di attacco per la cromatina.

La lamina nucleare può aiutare l'organizzazione della cromatina legando certi

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segmenti cromatinici a siti specifici dell'involucro nucleare. I segmenti di

cromatina che si legano in questo modo sono molto compatti, cioè sono costituiti

da etrocromatina. la maggior parte di questo materiale sembra corrispondere al

tipo di cromatina definita come eterocromatina costitutiva, che in ogni mometno

del ciclo cellulare ed in ogni cellula dell'organismo mantiene la sua struttura

altamente condensata. Il DNA che costituisce l'eterocromatina costitutiva consiste

di sequenze ripetute semplici (che sono corte sequenze organizzate come

ripetizioni in tandem che non sono trascritte). Le due maggiori regioni

cromosomiche costituite da etrocromatina costitutiva sono il centromero ed i

telomeri. Al contrario, l'eterocromatina facoltativa varia in relazione al momento

funzionale della cellula, e non sembra presentare zone cromosomiche che sono

state specificatamente rese inattive in una determinata cellula.

Il nucleolo è la "fabbrica dei ribosomi". Una cellula eucariotica di solito contiene

1-2 nucleoli. Il nucleolo appare costituito da fibrille e granuli: le fibrille contengono

DNA che viene trascritto in RNA ribosomiale (rRNA), i granuli rappresentano

molecole di rRNA associate a proteine importate dal citoplasma a costituire le

subunità ribosomiali. I nucleoli contengono la regione organizzatrice nucleolare

(NOR), un blocco di DNA che contiene copie di geni per l'rRNA. Le copie multiple

sono raggruppate in uno o più NOR, che possono essere localizzate in più di un

cromosoma. In ogni NOR le copie multiple sono organizzate in tandem. Il genoma

umano contiene 10 NOR per assetto cromosomico diploide, ognuno localizzato

vincino all'estremità di un cromosoma differente. Ma al posto di 10 nucleoli

separati, un nucleolo umano rapprsentativo mostra un singolo grande nucleolo

che contiene anse di cromatina derivate da dieci cromosomi separati. Il nucleolo

scompare durante la mitosi. Come la cellula si avvicina alla divisione la cromatina

si condensa a formare le strutture compatte dei cromosomi e

contemporaneamente si ha il disassembleggio e la scomparsa dei nucleoli: le

anse estese di cromatina del nucleolo cessano di essere trascritte e vengono

avvolte e condensate, ogni residuo di rRNA e di proteine ribosomiali viene quindi

disperso e degradato. Al termine della mitosi, la cromatina si decondensa, il NOR

riforma le anse e la sintesi di RNA ricomincia. Nelle cellule umane, questo è il solo

periodo in cui sono visibili i 10 NOR del nucleo diploide.

• Pompa Na+/K+

Una proprietà caratteristica della maggior parte delle cellule animali è costituita

relativamente alla parte intracellulare di un alta concentrazione degli ioni potassio

e da una bassa concentrazione di ioni sodio, e relativamente alla parte

extracellulare di una bassa concentrazione di ioni potassio e di un'alta

concentrazione di ioni sodio.

Queste differenze sono necessarie per assicurare uguali concentrazioni di soluti

ad entrambi i lati della membrana, mantenendo in tal modo l'equilibrio osmotico e

proteggendo la cellula dal rigonfiamento e dalla lisi. In più, i risultanti gradienti

degli ioni potassio e sodio sono essenziali come forza motrice per il cotrasporto,

così come per la trasmissione degli impulsi nervosi. La pompa sfrutta ATP come

fonte di energia ed è perciò considerata un esempio di ATPasa di trasporto.

L'ATPasi Na+/K+ o pompa sodio-potassio, accoppia l'idrolisi esorgonica dell'ATP

di trasporto all'interno degli ioni potassio e all'esterno degli ioni sodio.

Questa pompa possiede una direzionalità intrinseca: gli ioni potassio sono

sempre pompati all'interno e gli ioni sodio sono sempre pompati all'esterno. Gli

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ioni sodio e potassio, attivano l'ATPasi solo sul lato della membrana da cui sono

trasportati (gli ioni sodio dalla parte interna e gli ioni potassio dalla parte esterna).

Per gli eritrociti una molecola di ATP idrolizzata permette il trasporto di 3 ioni

potassio dentro e 2 ioni sodio fuori.

La pompa è costituita da una proteina tetramerica transmembrana, con due

subunità alfa e due beta. Le subunità alfa hanno attività catalitica e presentano i

siti di legame per l'ATP e per gli ioni sodio sul lato citoplasmatico (interno) e per

gli ioni potassio sul lato estreno della membrana. Sappiamo che le subunità beta

sono situate sul lato extracellulare e sono glicosilate. La pompa Na+/K+ è una

proteina allosterica, con due stati conformazionali alternativi, denominati E1 e E2

(per tale motivo spesso le ATPasi di tipo P sono denominate ATPasi e1e2). e1 è

aperta verso l'interno della cellula ed ha un'alta affinità per gli ioni sodio, mentre

e2 è aperta verso l'esterno della cellula ed ha un'alta affinità per gli ioni potassio.

La fosforilazione dell'enzima, evento innescato dal sodio, lo stabilizza nella

configurazione e2. La defosforilazione, invece, è innescata dal potassio e

stabilizza l'enzima nella forma e1.

Il meccanismo di trasporto inizia con un ineziale legame di 3 ioni sodio ad e1 sul

lato interno della membrana, il legame degli ioni sodio provoca la fosforilazione

dell'enzima da parte dell'ATP, che porta ad un cambiamento conformazionale da

e1 e e2. Di conseguenza, gli ioni sodio legati vengono trasferiti attraverso la

membrana sulla superficie esterna dove vengono rilasciati. Per gli ioni potassio

provenienti dall'esterno si legano alle subunità, provocando la defosforilazione ed

il ritorno alla configurazione iniziale. In questo modo gli ioni potassio sono

trasferiti all'interno, dove si dissociano, lasciando la proteina pronta ad accettare

altri ioni sodio.

La pompa sodio potassio è molto importante anche nel meccanismo di sinporto

Na+/glucosio. Quando gli ioni sodio si legano al loro sito sulla parte esterna della

membrana, la conformazione della proteina cambia, conferendo al sito di legame

del glucosio un'alta affinità per il glucosio stesso. Il legame del glucosio

presumbilmente provoca un'ulteriore cambiamento conformazionale della

proteina, che porta al trasferimento degli ioni sodio e del glucosio sulla superficie

interna della membrana. Qui, gli ioni si dissociano come risposta alla loro bassa

concentrazione intracellulare. Questo fatto provoca il distacco del glucosio dal

suo sito a dispetto del suo livello intracellulare, probabilmente perché l'affinità di

quel sito per il glucosio viene notevolmente ridotta della dissociazione degli ioni

sodio. La proteina quindi ritorna alla sua conformazione iniziale, e i siti di legame

vuoti ritornano sulla superficie esterna della membrana.

• Proteine di membrana

Le proteine di membrana differiscono per la loro affinità nei riguardi della regione

interna idrofoba della membrana, e quindi per l'estensione della regione con cui

esse interagiscono con il doppio strato lipidico. In base a tale criterio, le proteine

di membrana vengono classificate in 3 classi: integrali, periferiche ed ancorate ai

lipidi.

• Proteine integrali di membrana: molecole anfipatiche con una o più regioni

idrofobe che presentano affinità per il doppio strato lipidico. Tali proteine

possiedono anche delle regioni idrofile che sporgono all'esterno della

membrana, nella fase acquosa su uno o su entrambi i lati della membrana. Se le

proteine sporgono da un lato solo del doppio strato lipidico sono dette

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monotopiche. Se hanno invece regioni idrofile che sporgono da entrambi i lati

della membrana sono dette transmembrana. Le proteine transmembrana

possono essere monopasso (se attraversano la membrana una sola volta, tipo

glicoforina) o multipasso (se la attraversano più volte, tipo proteina della banda

3 della membrana dell'eritrocita). Alcune proteine multipasso possono essere

costituite da più di un polipeptidiche e sono dette multimeriche. nella maggior

parte dei casi la proteina attraversa la membrana secondo la conformazione ad

alfa elica, meno spesso nella conformazione a beta foglietto (porine).

• Proteine periferiche di membrana: alcune proteine associate alla membrana

sono prive di sequenze idrofobe distinte e quindi non penetrano all'interno del

doppio strato fosfolipidico. Queste proteine periferiche di membrana, mediante

forze elettrostatiche deboli e legami H, si collegano alle superfici di membrana

con le porzioni idrofile delle proteine integrali e anche con le teste polari dei

lipidi di membrana che sporgono.

• Proteine di membrana ancorate ai lipidi: le catene poipeptidiche di queste

proteine ancorate ai lipidi sono situate sulla superficie del doppio strato e unite

con legame covalente a molecole incluse nell'uno o nell'altro strato di

membrana.

• Proteine G e funzione (trasduzione del segnale II)

Esistono diverse molecole che funzionano come messaggeri chimici,

trasmettendo segnali da cellula a cellula. Alcune di queste, come gli ormoni, sono

prodotte in sedi molto distanti dal loro tessuto bersaglio e sono portate alle

diverse parti attraverso il sistema circolatorio. Altre, come ad esempio i fattori di

crescita, sono rilasciate localmente e agiscono solamente sui tessuti vicini.

Quando il messaggero raggiunge il suo bersaglio, si lega ai recettori sulla

membrana della cellula bersaglio, dando inizio al processo di trasduzione. Una

molecola, detta ligando, si lega ad un recettore di membrana. Altri ligandi, come

ad esempio gli ormoni steroidei, si legano a recettori intracellulari. In entrambi i

csi il ligando è detto primo messaggero. Il legame del ligando al recettore, in

genere, induce la produzione di altre molecole nella cellula che riceve il segnale.

Questi secondi messaggeri sono piccole molecole o ioni che spostano il segnale

all'interno della cellula, dando inizio ad una cascata di eventi che, molto spesso,

portano a modificazioni dell'espressione di geni specifici nella cellula ricevente. I

messaggeri possono essere di natura proteica, e avranno recettori di membrana.

Se invece sono di natura steroidea (idrofobici), avranno recettori citosolici o

nucleari, la cui funzione sarà quella di regola l'espressione di geni specifici.

Il messaggero forma legami non covalenti col recettore. Quando la presenza del

ligando e l'occupazione dei recettori persistono per un certo periodo di tempo, la

cellula va incontro a un processo di adattmento e cioè si desensibilizza e non

risponde più allo stimolo. A questo punto, per stimolare la cellula, c'è bisogno che

la concentrazione del ligando aumenti. La desensibilizzazione o down-

regolazione, è dovuta per lo più a modifiche delle proprietà o della localizza

cellulare del recettore e può avvenire per 1) rimozione del recettore dalla

superficie cellulare 2) modifiche del recettore che ne riducono l'affinità per il

ligando 3) modifiche del recettore che ne abbassano la capacità di indurre

modificazioni di alcune funzioni cellulari.

La rimozione del recettore dalla superficie cellulare può avvenire per endocitosi

mediata da recettore. L'isoprotenerolo e il propanololo, rispettivamente attivano e

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inibiscono i recettori beta-anedrergici. L'isoproterenolo è usato nel trattamento

dell'asma no come stimolante cardiaco, mentre il propanololo è usato per ridurre

la pressione sanguigna e la forza delle contrazioni cardiache e per combattere gli

attacchi d'ansia. La famotidina e la cimetidina legano e inibiscono un particolare

tipo di recettore istaminico presente sulle cellule delle pareti dello stomaco, e

serve a controllare l'acidità di stomaco.

I recettori sulla membrana plasmatica possono essere classificati in 2 famiglie: i

recettori associati a proteine G e i recettori associati a protein-chinasi.

Recettori associati a proteine G

I recettori associati a proteine g sono chiamati così in quanto il legame del

ligando induce una modifica conformazionale del recettore che attiva una proteina

G (proteina che lega un nucleotide guanina). La proteina g attivata si lega, a sua

volta, a una proteina bersaglio, un enzima o una proteina che forma un canale,

modificandone l'attività.

I recettori associati a proteine g hanno tutti una struttura simile. La proteina

recettore ha sempre 7 alfa eliche transmembranarie connesse ad anse

alternativamente citosoliche e extracellulari. La parte n terminale della proteina è

in contatto con il fluido extracellulare, mentre la parte c terminale è

intracitoplasmatica. L'ansa citosolica fra la quinta e la sesta alfa elica

transmembranaria è specifica per una determinata proteina g. le proteine g si

sttivano o si disattivano a seconda che leghino o meno una molecola di GTP o di

GDP. Eistono due diverse classi di proteine G: proteine g grandi eterotrimeriche e

proteine g piccole monomeriche. Le proteine g grandi eterotrimeriche sono

formate da 3 subunità alfa, beta e gamma.

Delle 3 subunità dell'eterotrimero alfabetagamma, la più grande, alfa, lega il

nucleotide guanina (GTP o GDP). Quando g-alfa è legata al GTP, si stacca dal

complesso beta-gamma. Le subunità beta-gamma restano invece sempre

accoppiate. Alcune proteine g, dette gs, fungono da stimolatori della trasduzione,

altre dette gi, fungono da inibitori.

Un messaggero che si lega a un recettore associato alla proteina g presente sulla

membrana esterna della cellula, induce una modificazione conformazionale del

recettore e il suo legame fa staccare il GDP e legare il GTP alla subunità alfa, che

si sgancia così dal complesso. A questo punto, a seconda della proteina g e del

tipo cellulare coinvolti, la subunità alfa-GTP libera o il complesso beta-gamma

fanno partire gli eventi di trasduzione. Alcune proteine g, interagendo

direttamente con canali ionici del calcio e del potassio, mediano l'azione di

neurotrasmettitori specifici. In alcuni organismi le proteine g attivano delle

chinasi. L'evento più importante connesso alle proteine g è comunque il rilascio

dei secondi messaggeri, e quelli più come sono l'AMP ciclico e gli ioni calcio,

quando la concentrazione intracitosolica dei secondi messaggeri è alta, viene

stimolata l'attività di specifici enzimi bersaglio.

L'AMP ciclico (cAMP) viene prodotto a partire da ATP citosolico dall'enzima

adenilato ciclasi. In condizioni normali, l'enzima è inattivo e resta tale fintanto che

non si lega alla subunità alfa di una specifica proteina g del tipo gs.

Quando un recettore associato a una proteina g è accoppiato ad una proteina gs,

l'attacco del ligando stimola il rilascio del GDP dalla subunità alfa, che si carica di

GTP. A sua volta questo evento induce il distacco della subunità alfa-GTP dalla

subunità beta-gamma e il suo legame all'adenilato ciclasi. Il legame della subunità

alfa-GTP all'adenilato ciclasi attiva l'enzima che converte l'ATP in cAMP. In

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seguito all'inattivazione della proteina g, l'adenilato ciclasi smette di sintetizzare

cAMP. I livelli intracitoplasmatici di cAMP rimarrebbero comunque elevati, se non

intervenisse un altro enzima, la fosfodiesterasi, che degrada il cAMP. Il principale

bersaglio intracellulare del cAMP è una chinasi cAMP dipendente, detta proteina

chinasi a (PKA). L'AMP ciclico regola l'attività della PKS causando il distacco delle

due subunità regolatorie dalle due subunità catalitiche. Quando le subunità

catalitiche sono libere, la PKA può catalizzare la fosforilazione di diversi substrati

cellulari. Ad Alte concentrazioni di cAMP nel muscolo scheletrico o nel fegato

viene attivati il catabolismo del glicogeno. Nel muscolo cardiaco, un innalzamento

dei livelli di cAMP fa aumentare le contrazioni cardiache; nel muscolo liscio, al

contrario, la contrazione viene inibita. L'innalzamento dei livelli di cAMP nelle

pastrine ne impedisce la mibilizzazione durante il processo di coagulazione, nelle

cellule epiteliali dell'intestino causa la secrezione di acqua e sali nel lume

intestinale.

L'aumento del livello di cAMP può essere ottenuto in due modi diversi:

stimolando la sintesi di cAMP o inibendo l'enzima fosfodiesterasi che degrada il

cAMP.

La tossina colerica ha un dominio enzimatico in grado di modificare

chimicamente la proteina gs, rendendola incapace di idrolizzare GTP a GDP, la gs

così non si spegne, i livelli di cAMP restano alti e le cellule intestinali continuano

a secernere grosse quantità di sali e acqua con conseguente disidratazione.

L'inositolo 1,4,5 trifosfato (Insp3), uno dei prodotti della degradazione dei

fosfolipidi derivati dall'inositolo, svolge un ruolo come secondo messagero.

L'insp3 deriva dal fosfatidil inositolo 4,5 difosfato (pip2), che, in seguito

all'attivazione della fosfolipasi c, viene scisso in 2 molecole: inositolo trifisfato e

diacilglicerolo (DAG). Insp3 e dag funzionano come secondi messageri, in

particolare nella via fosfatidil inositolo-calcio.

La sequenza di eventi inizia con il legame del ligando al recettore di membrana

che induce l'attivazione di una proteina g specifica, la proteina gp (attivatrice della

fosfolipasi c). la proteina gp a sua volta, attiva una particolare fosfolipasi c, la

fosfolipasi c-beta, che genera insp3 e dag. l'insp3 è idrosolubile e diffonde

rapidamente nel citosol, andandosi a legare a un canale del calcio a controllo di

ligando, il canale/recettore dell'insp3 presente sulle membrane del reticolo

endoplasmatico. In seguito al legame con l'insp3, il canale si apre e gli ioni calcio

vengono rilasciati nel citosol. Il calcio si lea alla calmodulina, e il complesso

calcio-calmodulina attiva altri processi.

Il dag prodotto per azione della fosfolipasi c resta nella membrana, dove attiva

una proteina chinasi c (PKC). la stimolazione della crescita da parte della PKC è

dovuta al fatto che tra i bersagli della PKC ci sono le MAP chinasi.

Gli ioni calcio CA2+ hanno un ruolo essenziale nella regolazione di diversi

processi cellulari. La regolazione è basata su variazioni della concentrazione del

calcio nel citosol in risposta a segnali esterni. Normalmente la concentrazione del

calcio nel citosol è mantenuta a livelli molto bassi dalle pompe del calcio, presenti

sulla membrana plasmatica e nel reticolo endoplasmatico. La pompa del calcio

sulla membrana plasmatica trasporta il calcio all'esterno, mentre la pompa del

calcio nel RE sequestra gli ioni calcio nel lume del RE. Alcune cellule hanno

inoltre degli scambiatori sodio-calcio che riducono ulteriormente la

concentrazione citosolica dela calcio. I mitocondri possono portare ioni calcio

nella matrice mitocondriale.

I livelli di calcio possono aumentare anche in seguito al rilascio del calcio dai

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depositi intracellulari. Gli ioni calcio sequestrati nel reticolo endoplasmatico

possono esser rilasciati attraverso i canali-recettori dell'insp3 e attraverso i

canali-recettori sensibili alla rianodina. Il ligando che apre i canali-recettori

sensibili alla rianodina sembra essere il calcio stesso (questo fenomeno è detto

appunto rilascio del calcio calcio-indotto).

La molecola della calmodulina è stata paragonata ad un braccio flessibile con una

mano alle sue estremità. Due ioni calcio si legano a ciascuna mano, inducendo

una modificazione conformazionale nella calmodulina che forma il complesso

attivo calcio-calmodulina. La maggior parte delle proteine che legano la

calmodulina sono enzimi della classe delle proteine chinasi e fosfatasi.

L'ossido nitrico (NO) è una molecola di gas tossica con emivita breve, prodotta

dalla conversione dell'amminoacido arginina a NO e citrullina ad opera dell'nziona

NO sintetasi. L'NO è il segnale rilasciato dalle cellule endoteliali responsabile del

rilassamento della muscolatura liscia dei vasi. L'No viene prodotto in seguito al

legame dell'acetilcolina sulla superficie delle cellule dell'endotelio dei vasi.

L'acetilcolina si lega a recettori associati a proteine g che attivano la via di

trasmissione del segnale del fosfatidil inositolo, inducendo la produzione di insp3

da parte delle cellule endoteliali. Insp3 causa il rilascio degli ioni calcio dal

reticolo endoplasmatico. Gli ioni calcio si legano alla calmodulina, formando un

complesso che stimola la NO sintetasi a produrre ossido nitrico. Tale ossido

nitrico è un gas che può diffondere rapidamente attraverso la membrana

plasmatica e passare dalle cellule endoteliali alle vicine cellule della muscolatura

liscia. All'interno delle cellule della muscolatura liscia, l'NO attiva l'enzima guanilil-

ciclasi, che catalizza la formazione di GMP-ciclico (cGMP). Il cGMP deriva dal GTP,

in maniera analoga alla produzione di cAMP da ATP, e come il cAMP anche il

cGMP agisceda secondo messagero. L'aumento della concentrazione del cGMP

attiva una proteina chinasi g che, catalizzando la fosforilazione di appropriate

proteine delle cullule muscolari, induce il rilassamento della muscolatura.

La nitroglicerina viene somministrata a pazienti con l'angina (dolori al petto per

insufficiente afflusso di sangue al cuore), appunto perché stimola la produzione di

NO, il quale rilassa la muscolatura liscia e permette di ridurre la costrizione dell

arterie coronarie.

Recettori associati alle proteine chinasi

La maggior parte delle chinasi coinvolte nella regolazione di enzimi cellulari

fosforilano residui di serina o treonina sull'enzima bersaglio e vengono quindi

dette chinasi serina/treonina. Molti recettori con attività tirosina chinasica

stimolano all'interno della cellula una catena di eventi di trasduzione del segnale.

I recettori con attività tirosina chinasica sono formati da una catena polipeptidica

unica con un unico segmento transmemebranario. A un'estremità della catena

polipeptidica si trova il dominio extracellulare con il sito di legame per il ligando.

All'altra estremità di trova il dominio intracitoplasmatico. La parte citosolica della

proteina è formata da un dominio con attività tirosina chinasica e una coda

citosolica. Nella parte citoslica sono presenti dei residui di tirosina che

costituiscono i substrati bersaglio della attività tirosina chinasica del recettore.

L'attività chinasica, in genere, è parte integrante della proteina recettore. In alcuni

casi però, l'attività di recettore e quella tirosina chinasica sono svolte da due

proteine diverse: in questo caso la tirosina chinasi è detta non associata al

recettore. La trasduzione del segnale, inizia con l'interazione ligando-recettore

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che causa l'aggregazione dei recettori con attività tirosina-chinasica. I recettori

con attività tirosina chinasica funzionano come dimeri. Quando i recettori

dimerizzano, la tirosina chinasi di ciascun recettore fosforila le tirosine del

recettore vicino. Questo processo di fosforilazione da parte di recettori dello

stesso tipo è detto autofosforilazione.

Quando la parte citoslica del recettore è fosforilata, vengono reclutate varie

proteine adattatrici presenti nel citosol che vanno ad interagire col recettore. Tutte

queste proteine si legano al recettore a livello dei residui di tirosina fosforilati. Per

legarsi al recettore, queste proteine devono contenere una sequenza

amminoacidica che riconosce sul recettorela fosfotirosina e alcuni amminoacidi

vicini. La parte della proteina che riconosce queste tirosine fosforilate è il dominio

SH2. I recettori con attività tirosina chinasica possono attivare

contemporaneamente diverse vie di trasduzione del segnale, tra cui la via che ha

come secondi messaggeri l'inositolo trifosfato-calcio, e la via della proteina Ras,

che culmina con l'attivazione dell'espressione di alcuni geni coinvolti nella

crescita e nello sviluppo.

Ras può essere legata sia al GDP che al GTP, ma solo quando è legata al GTP è

attiva. Se il recettore non è stimolato, Ras è nel suo stato normale legata al GDP.

Per essere attivata, ras deve rilasciare GDP e legare una molecola di GTP . perché

questo avvenga, ras ha bisogno dell'intervento di un'altra proteina, la proteina di

rilascio dei nucleotidi guanina (GNRP). La GNRP che attiva ras è sos. Perché sos

sia attivata, è necessario che si leghi al recettore con attività tirosina chinasica

indirettamente, attraverso un'altra proteina, la proteina GRB2. Questa proteina

contiene un dominio SH2 epuò quindi legarsi alle tirosine fosforilate del recettore.

Quindi per attivare ras devono essere fosforilate le tirosine sul recettore. GRB2 e

sos devono formare un complesso che si lega al recettore, e che attiva sos. Sos

attivata stimola il rilascio del GDP e il legame di GTP su ras, che così si attiva.

Viene così attivata la via di ras, in cui l'evento più importante è l'attivazione di una

classe di proteine chinasi, le MAP chinasi (MAPk) o proteine chinasi attivate da un

mitogeno. Una delle funzioni delle MAPK è la fosforilazione della proteina

nucleare jun. Quando jun è fosforilata, si associa ad altre proteine a formare il

fattore trascrizionale AP-1, che induce l'espressione di geni che cosificano per

proteine necessarie per la cerscita e la divisione cellulare.

Fattori di crescita come messaggeri

Il siero è pieno di fattore di crescita di derivazione piastrinica (PDGF). Molti altri

fattori di crescita stimolano recettori con attività tirosina chinasica. Tra questi

fattori citiamo l'insulina, il fattore di crescita insulino-simile di tipo 1, il fattore di

crescita dei fibroblasti, delle cellule epiteliali e dei neuroni.

I fattori di crescita dei fibroblasti (FGF) e dei loro recettori con attività tirosina

chinasica, i recettori per i fattori di crescita dei fibroblasti (FGFR), sono tra i più

studiati. È stato dimostrato che FGFR ha un ruolo importante nello sviluppo delle

cellule che derivano dal mesoderma. Una mutazione che annulla la funzione del

recettore normale è detta mutazione dominante negativa. Nell'uomo tali tipi di

mutazioni nel dominio transmembranario del FGFR-3 sono responsabili della

acondroplasia (nanismo) e della displasia tanatoforica.

La classe più importante di recettori con attività chinasica su serina e treonina è

rappresentata da una famiglia di proteina che lega alcuni componenti della

famislia dei fattori di crescita che include il fattore di crescita con effetto

trasformante beta (TGF-beta). Alcuni membri della famiglia del TGF beta formano

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dimeri fra loro prima di legare il recettore.

Prima di tutto il fattore di crescita si lega al dominio transmembranario.i memebri

della famiglia del TGF beta si legano a due tipi di recettori sulla cellula bersaglio: i

recettori di tipo 1 e 2. In seguito all'interazione con il ligando, il recettore di tipo 2

fosforila il recettore di tipo 1. I bersagli del recettore di tipo 1 sono le proteine

SMAD. In risposta ad un segnale specifico smad, fosforilata dal recettore attivato,

forma un complesso con una seconda proteina smad (detta co-smad)), e le due

smad si dirigono nel nucleo. All'interno del nucleo, il complesso smad, associato

a proteine che legano il dna, regola l'espressione di geni specifici.

Ormoni

Un ormone endocrino è una molecola che viene trasportata dalla cellula che la

secerna alla cellula bersaglio, di cui regola uno o più funzioni specifiche,

attraverso il sistema circolatorio. Un ormone paracrino invece può agire solo su

cellule vicine.

La somatotropina, ad esempio, è coinvolta nella regolazione della crescita del

corpo umano, mentre gli ormoni sessuali, gli androgeno i e gli estrogeni,

controllano il differenziamento dei tessuto e lo sviluppo dei caratteri sessuali

secondari. La tiroxina regola il livello di energia disponibile nell'organismo.

L'insulina controlla la concentrazione di glucosio nel sangue, l'aldosterone

controlla il livello di sodio e potassio a livello sangiugno, il paratormone controlla

i livelli di calcio nel sangue. La risposta dell'organismo allo stress è regolata

dall'epinefrina, norepinefrina, e cortisolo,e la risposta ai danni tissutali locali è

regolatadal rilascio di istamina e dalla produzione di prostaglandine.

Gli ormoni adrenergici si legano ai recettori adrenergici, una famiglia di recettori

associati alle proteine G, possono essere classificati in recettori alfa e beta

adrenergici. I recettori alfa adrenergici legano sia l'epinefrina che la norepinefrina,

mentre quelli beta adrenergici legano meglio l' epinefrina. I recettori alfa e beta

adrenergici sono associati a proteine g diverse, e stimolano quindi due diverse

vie di trasduzione del segnale. Le proteine g attivate da un tipo di recettori alfa

adrenergici, i rcettori alfa1 adrenergici sono proteine gp, mentre le proteine g

attivate dai rcettori beta adrenergici sono proteine gs. La attivazione della

proteina gs stimola la trasduzione del segnale mediata da cAMP e induce il

rilassamento di un parte della muscolatura liscia. La attivazione della proteina gp

stimola la fosfolipasi c con conseguente produzione di insp3 e dag, e

innalzamento dei livelli intracellulari di calcio.

Una delle azioni degli ormoni adrenergici è quella la stimolazione della

degradazione del glicogeno per fornire alle cellule muscolari un adeguato apporto

di zucchero. La demolizione del glicogeno è catalizzata dall'enzima glicogeno

fosforilasi che, aggiungendo fosfato inorganico, stacca dal glicogeno singole

molecole di glucosio, sotto forma di glucosio 1 fosfato. La sequenza di eventi

inizia con il legame di una molecola di epinefrina ad un recettore beta adrenergico

sulla membrana plasmatica di una cellula del fegato o del tessuto muscolare. Il

recettore attiva una proteina gs che,a sua volta, stimola l'adenilato ciclasi a

produrre cAMP. Tale aumento intracitoslico di cAMP attiva una proteina chinasi A.

questo enzima converte la glicogeno fosforilasi dalla forma b alla forma a, molto

più attiva, con conseguente aumento della degradazione del glicogeno. Il cAMP

stimola anche la inattivazione del sistema enzimatico di sintesi del glicogeno. La

PKA appunto fosforila l'enzima glicogeno sintetasi, che così si disattiva. L'effetto

complessivo del cAMP è quindi quello di aumentare la degradazione e bloccare la

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Antonio Simone Laganà – Medicina e Chirurgia

sintesi del glucosio.

I recettori alfa1 adrenergici stimolano la formazione di insp3, e del dag. i recettori

alfa1 adrenergici si strovano principalmente nella muscolatura liscia dei vasi

sanguigni, compresi quelli che controllano l'afflusso di sangue all'intestino. In

seguito alla stimolazione di un recettore alfa1 adrenergico e alla formazione di

insp3 la concentrazione di calcio intracellulare aumenta, provocando così

contrazione della muscolatura liscia con conseguente vasocostrizione e ridotto

afflusso di sangue.

• Qual'è la funzione delle lamine nella mitosi?

Per quanto riguarda la disgregazione dell'involucro nucleare, MPF attivo fosforila

e induce altre chinasi a fosforilare le LAMINE della lamina nucleare (proteine a cui

è associata la membrana nucleare interna). La fosforilazione induce la

depolarizzazione delle lamine che porta alla disgregazione della lamina nucleare.

La perdita della mina nucleare destabilizza l'involucro nucleare, che si disperde in

piccole vesicole membranarie.

• Retroinibizione enzimatica

È detta anche inibizione a feedback, (o da prodotto finale). Avviene ogni qualvolta

un prodotto metabolico della catena inibisce uno degli enzimi coinvolti nella

catena metabolica stessa che porta alla sintesi del prodotto. L'inibizione a

feedback è uno dei meccanismi più comuni utilizzati dalle cellule, per far si che le

sequenze di reazioni siano adeguati alle esigenze cellulari.

• Trasporto attivo

Il trasporto attivo si attua quando una molecola deve essere trasportata oltre la

membrana plasmatica contro un gradiente di concentrazione elettrochimico,

quindi si necessita dell'impiego di energia. Esso rende possibile l'assorbimento di

sostanze nutritive permette l'escrezione di sostanze di rifiuto e di secrezione e

consente di mantenere le concentrazioni intracellulari di potassio, sodio, calcio e

idrogeno in una situazione di costante non equilibrio. Le proteine di menbrana

coinvolte nel trasporto attivo sono dette pompe. Il trasporto attivo possiede una

direzionalità e si dice perciò che unidirezionale o vettoriale. I meccanismi del

trasporto attivo differiscono principalmente per la fonte di energia e se i due soluti

sono trasportati contemporaneamente o meno. In base alla fonte di energia il

trasporto attivo viene considerato diretto o indiretto. E' diretto quando l'accumulo

delle molecole di soluto o ioni su un lato della menbrana viene accoppiato

direttamente ad una reazione chimica esorgonica (più frequentemente l'idrolisi di

ATP). Le proteine di trasporto che sono attivate direttamente dall'idrolisi di ATP

sono dette pompe ATPasi. Il trasporto attivo indiretto dipende dal co-trasporto di

due soluti, in cui, il movimento secondo gradiente di uno attiva quello contro-

gradiente dell'altro. Il processo di trasporto è simporto o un antiporto. Le ATPasi

di trasporto o pompe sono responsabili del trasporto attivo diretto. Ci sono 4

ATPasi: ATPasi di tipo P, di tipo V, di tipo F, di tipo ABC.

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Antonio Simone Laganà – Medicina e Chirurgia

• Le ATPasi di tipo P vengono fosforilate in maniera reversibile dall'ATP (viene

fosforilato sempre un residuo di acido aspartico). Possiedono un singolo

polipeptide con 8-10 segmenti trans-menbrana. Sono tutte trasportatori di

cationi e sono responsabili del mantenimento del gradiente ionico. Tra questo

tipo di pompe c'è la pompa sodio-potassio. Altre esempi sono l'idrogeno

ATPasi che pompa protoni verso l'esterno, la CalcioATPasi che trasporti ioni

calcio contro-gradiente elettrochimico.

• Le ATPasi di tipo V pompano protoni in organuli quali le vescicole, i vacuoli, i

lisosomi, gli endosomi, il complesso di Golgi. Sono formate da due componenti

e più sub-unità: un componente integrale incluso nella membrana e un

componente periferico sulla superficie che contiene il sito di legame per l'ATP.

• L'ATPasi di tipo F sono implicate nel trasporto di protoni e sono formate da

due componenti, entrambi costituiti da complessi con più sub-unità. Il

componente integrale è detto F0 e serve da poro trans-menbrana per i protoni,

il componente periferico, detto F1 contiene il sito di legame per l'ATP. Possono

funzionare in due modi: pompare protoni contro-gradiente con consumo di ATP

oppure, tramite un flusso esorgonico di protoni (secondo gradiente

elettrochimico) sintetizzano ATP. Quando funzionano in questo modo si dicono

ATPsintetasi.

• L'ATPasi di tipo ABC sono dette anche cassette che legano l'ATP (ATPbinding

cassette). Il termine cassette è indicato per i domini catalici della pompa. Un

trasportatore ABC tipico possiede 4 domini, due dei quali altamente idrofobici e

inclusi nella menbrana, mentre gli altri due sono localizzati perifericamente sul

lato citoplasmatico della membrana; ciascuno dei due domini inclusi è

costituito da 6 segmenti trans-membrana che formano dei canali. I trasportatori

ABC sono importanti in quanto alcuni di essi pompano antibiotici o altri farmaci

fuori dalla cellula rendendola così resistente al farmaco. Alcuni tumori umani,

per esempio, hanno notevole resistenza ai farmaci a causa di una proteina del

tipo pompa ABC detta MDR. Una persona affetta da fibrosi cistica accumula

muco denso nei polmoni, questo perché le cellule sono incapaci di secernere

ioni cloro ed il difetto deriva da una proteina che dovrebbe funzionare coma

canale ionico per il cloro. pag. 33 di 72

Antonio Simone Laganà – Medicina e Chirurgia

DOMANDE DI GENETICA

Aneuploidia e poliploidia

Un organismo ke ha un assetto normale di cromosomi è detto euploide. Un

organismo, o cellula aneuploide è caratterizzato da un numero cromosomico che

non è un multiplo esatto dell’assetto cromosomico aploide. Le cause della

aneuploidia sono da ricercare in una non-disgiunzione di uno o più cromosomi

durante la meiosi I o la meiosi II che portano alla formazione di gameti con un

numerp cromosomico anormale.

Una non disgiunzione alla meiosi I produce 4 gameti anormali: 2 gameti con un

cromosoma duplicato e 2 privi di quel cromosoma, quindi una fusione del primo

tipo di gamete con un gamete normale produrrà uno zigote con 3 copie del

cromosoma duplicato (mentre le altre coppie dei cromosomi rimarranno normali),

mentre una fusione del secondo tipo di gamete (in cui manca un cromosoma di

una coppia) darà origine ad uno zigote con una sola copia di quel particolare

cromosoma ( invece di aver una coppia normale di cromosomi) e tutte le altre

coppie cromosomiche normali.

Una non disgiunzione alla meiosi II produce due gameti normali e due anormali:

dei due gameti anormali uno conterrà due cromosomi fratelli (al posto di uno) e

l’altro non conterrà nemmeno una copia di quel determinato cromosoma. In

questo caso, con la fusione del primo tipo di gameti con gameti normali si

avranno zigoti trisomici, con la fusione del secondo tipo di gameti con gameti di

tipo normale si avrà uno zigote che manca completamente di una coppia di un

determinato cromosoma.

Tipi di aneuploidia:

1. nullisomia: implica la perdita di un paio di cromosomi omologhi.

2. monosomia: consiste nella perdita di un solo cromosoma di una

determinata coppia.

3. implica la presenza in più di un determinato cromosoma, cioè la

cellula ha 3 copie di un determinato cromosoma e 2 copie di tutti gli

altri.

4. tetrasomia: comporta una coppia cromosomica in più, cioè si

avranno 4 copie di un determinato cromosoma, e normalmente due

copie di tutti gli altri cromosomi.

L’anuploidia relativa ai cromosomi del sesso è meglio sopportata grazie al

meccanismo dell’inattivazione dell’x (lyonizzazione). La trisomia dell’8, del 13

(sindrome di Patau) e del 18 (sindrome di edwards) comporta morte in età

precoce, mentre si ha sopravvivenza fino alla vita adulta con la trisomia del 21

(sindrome di down). La sindrome di down può derivare anche da un tipo diverso

di mutazione cromosomica detta traslocazione robertsoniana, che porta alla

presenza di 3 copie del braccio lungo del cromosoma 21, questa forma di

sindrome di down è definita familiare. Una traslocazione robertsoniana è una

traslocazione in cui due cromosomi acrocentrici (cromosomi con i centromeri

vicini all’estremità) non omologhi si rompono a livello dei centromeri ed i bracci

lunghi si ritrovano attaccati ad un unico centromero. I bracci corti si uniscono a

loro volta a formare il prodotto reciproco, che generalmente contiene geni non

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Antonio Simone Laganà – Medicina e Chirurgia

essenziali e viene abitualmente perdute entro poche divisioni cellulari.

La monoploidia e la poliploidia implicano variazioni del numero di interi assetti

cromosomici, e possono derivare ad esempio quando la prima o la seconda

divisione meiotica è abortiva (assenza di citocinesi), oppure quando avviene una

noin disgiunzione meiotica che coinvolge tutti i cromosomi. La fusione di un

gamete con 2 assetti cromosomici con un gamete normale generà uno zigote

triploide, mentre la fusione di due gameti, ciascuno con 2 assetti cromosomici,

produce uno zigote tretraploide.

Esistono due classi di poliploidi: quelli che hanno un numero pari di assetti

cromosomici e quelli che ne hanno un numero dispari,quelli con un numero pari

di assetti cromosomici hanno almeno una maggiore probabilità di essere,dato che

esiste la possibilità per i loro cromosomi omologhi di segregare correttamente

durante la meiosi.

Nelle piante ci sono 2 tipi di poliploidia:

nella autopoliploidia tutti gli assetti cromosomici appartengono alla stessa specie,

questa condizione deriva da un difetto alla meiosi che porta a gameti diploidi o

poliploidi.

Nell’alloplolipoidia gli assetti cromosomici implicati derivano da specie diverse,

ahce se correlate: questa situazione può originarsi se due specie diverse si

incrociano generando uno zigote con 2 assetti cromosomici aploidi provenienti

da ciascuno genitore (un assetto da ciascuna specie) e poi entrami gli assetti

vengono raddoppiati.

Anse del t-RNA

I tRNA sono rna lunghi 75-90 nucleotidi con la funzione di portare gli amminoacidi

al complesso mRNA-ribosoma, dove vengono polimerizzati in catene

polipeptidiche durante la sintesi proteica.

di tRna ha una diversa sequenza nucleotidica, ma tutti hanno la

Ogni molecola

sequenza CCA all’estremità 3’. QUESTA SEQUENZA CCA è AGGIUNTA AL T-RNA

POST TRASCRIZIONALMENTE. Le differenze nella catena nucleotidica spigano la

capacità di un particolare tRNA di legare uno specifico amminoacido. Tutte le

molecole di tRNA sono modificate chimicamente in diversi punti da enzimi che

agiscono postrascrizionalmente.

La sequenza di tutti i tRNA può essere ripiegata in una struttura detta a trifoglio: la

struttura a trifoglio origina dall’appaiamento tra basi complementari in diverse

parti della molecola, che forma 4 strutture a stelo (stem) separate de 4 anse a

singola elica dette loop I, II, III, IV. L’ansa II contiene la tripletta nucleotidica

dell’anticodone, che durante la traduzione si appaia al corrispondente codone

dell’mRNA. Questo appaiamento codone-anticodone è fondamentale per

l’inserimento dell’amminoacido corretto specificato dall’mRNA nella catena

polipeptidica in crescita. tripletta CCA è detta braccio accettare,

La porzione terminale 3’ che presenta la

l’ansa I è detta D-loop perché contiene Diidrouridina, l’ansa II è quella che

contiene l’anticodone, l’ansa III è un’ansa variabile da 3 a 21 amminoacidi, l’ansa

IV è detta psi-loop perché contiene pseudouridina.

La forma a trifoglio viene ripiegata in una struttura più compatta, a forma di L

rovesciata. In questa struttura a L si trova ad una estremità la tripletta CCA dove

si lega l’amminoacido e all’altra estremità si trova l’ansa II che contiene

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Antonio Simone Laganà – Medicina e Chirurgia

l’anticodone.

Caratteri bio-quantitativi

Un carattere che presenti solo pochi fenotipi distinti definito carattere

discontinuo: di solito per i caratteri discontinui esiste una relazione semplice fra

genotipo e fenotipo, del tipo che per ogni genotipo esiste un determinato fenotipo.

Noi sappiamo però che la relazione tra genotipo e fenotipo non è sempre così

semplice, perché intervengono fenomeni quali la penetranza e l’espressività

variabili, e l’epistasi e la pleiotropia, inoltre lo stesso genotipo interagendo con

ambienti diversi può dare una diversa norma di reazione. I caratteri continui sono

detti quantitativi. All’aumentare del numero di loci che controlla un carattere

(carattere poligenico), il numero dei genotipi diventa rapidamente molto grande.

Se ogni genotipo di un carattere poligenico codifica per un fenotipo diverso, si

avrà un carattere di tipo continuo. Se il fenotipo è influenzato da genotipi multipli

e da fattori ambientali il carattere è detto multifattoriale. I geni che controllano

elementi diversi del fenotipo possono essere influenzati pleiotropicamente l’uno

dall’altro: in pratica spesso due o più caratteri sono spesso correlati.

Per il carattere bioquantitativo del colore della cariosside del grano si è proposto

che ciascuna dose di un gene che controlla la produzione del pigmento permetta

la sintesi di una determinata quantità del pigmento stesso. In tal caso gli alleli che

contribuiscono al fenotipo sono detti alleli additivi, gli alleli che non hanno effetto

sul carattere quantitativo sono detti alleli non additivi.

Quando si riesca ad identificare grandi regioni del genoma e a correlarle con la

variabilità fenotipica per un carattere metrico, si può iniziare a stabilire i loci

importanti per la determinazione del carattere, i QTL (quantitative trait loci).

Caricamento degli amminoacidi

L’amminoacido corretto viene legatomi al tRNA da un enzima detto amminoacil-

tRNA sintetasi. Questo processo è detto caricamento, e produce un amminoacil-

tRNA. L’amminoacilazione è ATP dipendente. Esistono 20 diversi tipi di

amminoacil-tRNA sintetasi per ognuno dei 20 amminoacidi: il sito di

riconoscimento per un amminoacil-tRNA sintetasi è enzima specifico, in molti casi

però è la regione dell’anticodone ad essere riconosciuta. Processo di

caricamento:

prima di tutto l’amminoacido e l’atp si legano all’amminoacil-tRNA sintetasi

specifica. L’enzima quindi catalizza la reazione per cui l’atp perde due gruppi P e

si lega come amp all’amminoacido per dare amminoacil-amp. In seguito il tRNA si

lega all’enzima, che trasferisce l’amminoacido dall’amminoacil-AMP sul tRNA,

rilasciando l’AMP. La molecola di amminoacil-tRNA così formata si stacca quindi

dall’enzima. Dal punto di vista chimico, l’amminoacido si attacca all’estremità 3’

del tRNA mediante un legame covalente tra il gruppo carbossilico

dell’amminoacido e il gruppo 3’ OH o 2’ OH dell’adeniva terminale della tripletta

CCA persente su tutti gli amminoacidi.

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Antonio Simone Laganà – Medicina e Chirurgia

Come si costruisce una molecola di c-DNA

Per produrre una molecola di c-Dna bisogna partire da molecola di mRNA, i quali

hanno all’estremità 3’ le importanti code di poliA.

Gli mRNA rappresentano il momento funzionale specifico della cellula, perché ci

possono dare il quadro generale del tipo di proteine che stanno per essere

prodotte, in quanto l’mRNA subisce un processamento di splicing in cui vengono

eliminati gli introni. Le sequenza degli introni sono presenti appunto nei cloni

genici, ma non nei cloni di c-DNA.

Avendo una miscela di tutti gli RNA, gli RNA poliA possono venire purificati

(isolati dagli altri tipi di RNA), passando la miscela su una colonna di oligo dT:

quando le catene di mRNA poliA passeranno dalla colonna le code di poliA si

legheranno alle catene di oligo dT, quindi gli mRNA verranno bloccati mentre tutti

gli altri RNA verranno eliminati dalla colonna. Gli mRNA catturati verranno

rilasciati dalla colonna per esempio aumentando la forza ionica del tampone

presente sulla colonna, in maniera tale da rompere i ponti H.

Per prima cosa si associa un breve primer di oligo(dT) alla coda di poliA, il primer

viene così esteso dalla trascrittasi inversa (DNA polimerasi-RNA dipendente) a

dare una copia del DNA dal filamento di mRNA. Il risultato è a quseto punto una

molecola a doppia elica ibrida di DNA-mRNA: successivamente RNasi H, Dna

polimerasi I e DNA ligasi vengono usate per sintetizzare la seconda elica di DNA.

L’RNasi H degrada il filamento di mRNA nella molecola ibrida a doppia elica, la

DNA polimerasi I sintetizza la nuova elica a partire dai frammenti di mRNA

degradati che fungono in tale caso da primer di innesco e infine la DNA ligasi lega

i frammenti di DNA per formare una nuova catena completa.

Come si realizzano le banche cromosomiche?

Prima di tutto bisogna separare i singoli cromosomi. Si può usare a tale scopo ad

esempio la tecnica della citofluorimetria, in cui i cromosomi di cellule in mitosi

(condensati) sono colorati con un prodotto fluorescente e passati attraverso un

raggio laser collegato con un rilevatore di luce. Questo sistema distingue i

cromosomi sulla base delle loro differenze nel legare il colorante e la rifrazione

risultante. Dopo che i cromosomi sono stati frazionati e raccolti si può costruire

una banca per ciascun tipo cromosomico.

Come si realizzano le banche genomiche?

Quando del dna genomico viene isolato e digerito con un enzima di restrizione e

la popolazione di frammenti di dna viene clonata in un vettore, si parla di banca

genomica. pag. 37 di 72


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Corso di laurea: Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia
SSD:
Università: Messina - Unime
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher flaviael di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Genetica umana e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Messina - Unime o del prof Laganà Antonio Simone.

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