Biologia e Genetica - Compendio

Antonio Simone Laganà – Medicina e chirurgia

Compendio del corso integrato di biologia e genetica dedicato a tutti quelli che vanno avanti con le proprie forze, lottando contro l’indifferenza generale.

Antonio Simone Laganà

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Aneuploidia e poliploidia

• Anse del t-RNA
• Canali ionici (sistemi a controllo di ligando, di potenziale, a deformazione meccanica)
• Caratteri bio-quantitativi
• Caricamento degli amminoacidi
• Ciclo cellulare
• Citoscheletro
• Come avviene la sintesi del secondo filamento di c-DNA dopo la sintesi del primo?
• Come si costruisce una molecola di c-DNA
• Come si realizzano le banche cromosomiche?
• Complesso del poro nucleare
• Condizioni che modificano la struttura della cromatina (attivazione/inattivazione):
• Metilazione, fosforilazione, acetilazione
• Cosa sono i geni concatenati? Quali conseguenze portano?
• Cos'è la cromatina facoltativa? (es. corpo di Bahr)
• Crossing-over
• Da dove prende la peptil-transferasi il ribosoma?
• Differenze nella fase di allungamento tra procarioti ed eucarioti
• Diffusione facilitata (proteine canale)
• Duplicazione del DNA
• Epistasi
• Equilibrio chimico del potenziale di membrana.
• Funzione dei centromeri
• Funzione della telomerasi e telomeri
• Genetica mendeliana
• Geni procariotici
• Il collagene
• Integrine
• La genetica dei gruppi sanguigni
• La via di Ras
• Lisosomi
• Marcatori dei vettori artificiali (marcatori selettivi dominanti)
• Matrice extracellulare
• Meccanismi di insorgenza della mutazioni geniche
• Microvillo
• Mutazioni cromosomiche
• Nucleo
• Organizzazione del genoma virale
• PCR
• Polimeria (caratteri quantitativi, es. delle cariossidi del grano)
• Pompa Na+/K+
• Possibilità o meno del crossing-over (frequenza di ricombinazione)
• Prioni
• Proteina p53
• Proteine di membrana
• Proteine G e funzione
• Qual'è la cromatina che può essere trascritta?
• Qual'è la frequenza massima di ricombinazione?
• Qual'è la funzione delle lamine nella mitosi?
• Qual'è la sequenza di Shine-Dalgarno?
• Quali fattori intervengono nel processo di allungamento della traduzione?
• Quali sono i sistemi di controllo del ciclo cellulare e come agiscono?
• Regola della somma - regola del prodotto
• Retroinibizione enzimatica
• Reversioni cromosomiche
• Schaffold proteico

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Segregazione

• Senquenze palindromiche
• Sintesi proteica (tutte le fasi della traduzione del messaggio genetico)
• Sito cos del concatamero (struttura, posizione e funzioni)
• Spiralizzazione del DNA: differenza tra dominio funzionale e dominio strutturale
• Struttura del t-RNA
• Superavvolgimento del DNA
• Test-cross (reincrocio)
• Tipi di cromatina e differenze
• Traporto passivo
• Trasporto attivo
• Vettori di clonazione (plasmidi, cosmidi e differenze)
• Vettori di clonazione artificiali del lievito (YAC)

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Antonio Simone Laganà – Medicina e chirurgia

Domande di biologia

• Canali ionici (sistemi a controllo di ligando, di potenziale, a deformazione meccanica)

La struttura dei canali ionici è quella di un poro molto piccolo rivestito da gruppi laterali di amminoacidi idrofili, per questo sono molto selettivi. La selettività si attua principalmente per differenza di carica o di dimensioni. Molti canali ionici sono controllati, possono cioè essere aperti e chiusi mediante cambiamenti conformazionali della proteina, regolando così il flusso degli ioni. Nelle cellule animali, 3 diversi tipi di stimoli inducono cambiamenti conformazionali nei canali controllati:

• I canali a controllo di potenziale si aprono e si chiudono in risposta a cambiamenti del potenziale di membrana.
• I canali a controllo di ligando sono innescati dal legame alla proteina canale di sostanze specifiche.
• I canali a controllo meccanico rispondono a forze meccaniche che agiscono sulla membrana.

La trasmissione dei segnali elettrici da parte delle cellule nervose dipende dai cambiamenti rapidi e controllati degli ioni Na+ e K+, attraverso i loro rispettivi canali. Oltre a questo tipo di regolazione a breve termine, molti canali ionici sono soggetti a regolazione a lungo termine, più che altro per controllo ormonale.

Le porine sono proteine transmembrana multipasso. La caratteristica principale delle porine è che i segmenti transmembrana attraversano la membrana non in forma di alfa-elica, ma di beta-foglietto cilindrico chiuso denominato beta-barrel, il quale ha nella parte centrale un poro ripieno di acqua. La parte interna del poro è tappezzata di catene laterali polari, mentre la parte esterna è formata da porzioni apolari che interagiscono con la porzione idrofoba della membrana. Il complesso della porina permette così il passaggio di diversi soluti idrofili.

Le acquaporine permettono il passaggio veloce di acqua all'interno e all'esterno della membrana. Le acquaporine sono proteine integrali di membrana con sei segmenti transmembrana elicoidali. Nel caso di AQP-1, l'acquaporina presente nei tubuli renali, l'unità funzionale è costituita da un tetramero formato da 4 monomeri identici. Tali subunità formano un canale grazie ai loro segmenti transmembrana.

Ciclo cellulare

Nel ciclo cellulare di una cellula eucariotica si distinguono le fasi G1, S, G2 e M, le quali si succedono ciclicamente. Le fasi della mitosi sono Prometafase, Metafase, Anafase e Telofase. La fase S è la fase in cui il DNA della cellula viene raddoppiato, le fasi G1 e G2 sono fasi detta gap (intervallo) ma sono comunque fasi di accrescimento, la fase M (mitotica) consiste di due eventi sovrapposti: la mitosi e la citocinesi. Durante la mitosi, il fuso mitotico segrega i cromosomi condensati e duplicati nei 2 nuclei fligli; durante la citocinesi il citoplasma si divide generando 2 cellule figlie geneticamente identiche. Il complesso delle fasi G1, S e G2 viene detto interfase. Lo stato G0 è quello delle cellule che restano bloccate in fase G1 per lungo tempo (tipo neuroni).

Il sistema di controllo del ciclo cellulare deve controllare che tutti i diversi processi delle diverse fasi siano stati portati a termine al tempo dovuto e nella sequenza corretta, deve assicurare che ogni fase del ciclo sia stata completata prima di permettere l'ingresso nella nuova fase, e deve controllare se l'ambiente esterno sia idoneo alla divisione (presenza di nutrienti e di fattori di crescita). Questi compiti sono svolti attraverso una serie di punti di controllo. Il primo punto di controllo è alla fine della fase G1; nel lievito questo punto di controllo G1 è detto Start, per passare Start la cellula di lievito deve aver sufficienti nutrienti e aver raggiunto una certa dimensione. Nelle cellule animali il punto di controllo G1 è detto punto di restrizione. La capacità di passare oltre il punto di restrizione è controllata per lo più da proteine extracellulari, i fattori di crescita.

Al punto di controllo G2, che si trova al confine tra la fase G2 e la fase M, è richiesto che la sintesi del DNA sia stata completata prima dell'ingresso in mitosi. Il terzo punto di controllo è detto punto di controllo di assemblaggio del fuso, al passaggio tra metafase ed anafase. Per superare tale punto di controllo tutti i cromosomi devono essere attaccati al fuso.

Il MPF, fattore che induce la mitosi, è necessario per indurre il superamento del punto di controllo di G2 e l'entrata in mitosi. La proteina codificata dal gene cdc2 è una delle 2 proteine che fanno parte di MPF. La proteina codificata dal gene cdc2 del lievito funziona come una proteina chinasi, perché catalizza il trasferimento di un gruppo fosfato dell'ATP a determinate proteine bersaglio (la fosforilazione delle proteine da parte delle chinasi, e la loro defosforilazione da parte delle fosfatasi, è un comune meccanismo di regolazione dell'attività delle proteine). Sebbene la proteina prodotta dal gene cdc2 sia una proteina chinasi, questa è attiva solo quando è legata ad una ciclina. La proteina prodotta dal gene cdc2 è quindi una chinasi ciclina-dipendente (Cdk).

Le cicline coinvolte nel passaggio da G2 a M sono dette cicline mitotiche, e le molecole di cdk a cui si legano sono dette cdk mitotiche. Analogamente le cicline coinvolte nel punto di controllo di G1 e nel passaggio alla fase S sono dette cicline G1 e le molecole cdk a cui si legano sono dette cdk G1.

Un livello di controllo di queste proteine chinasi è dato dalla disponibilità delle cicline necessarie per l'attivazione delle cdk, e un altro è basato sulla fosforilazione delle stesse molecole di cdk. Ora possiamo renderci conto che il MPF e il complesso cdk-ciclina mitotica sono la stessa cosa.

Appena la ciclina mitotica si lega alla cdk mitotica, il complesso è inattivo. Per attivarsi, il complesso deve ricevere un gruppo fosfato su un particolare amminoacido della molecola cdk. Prima dell'aggiunta di questo fosfato, tuttavia, una chinasi inibitoria fosforila la cdk in 2 altre porzioni, bloccandone il sito attivo. A questo punto una chinasi attivatoria aggiunge il gruppo fosfato attivatore. L'ultimo passaggio delle sequenza di attivazione è la rimozione dei fosfati inibitori da parte di una fosfatasi specifica. Quando la fosfatasi inizia a rimuovere i fosfati inibitori, si instaura un processo di retroazione positiva, per il quale il complesso cdk-ciclina attivato generato da questa reazione stimola la fosfatasi, causando una accelerazione del processo di attivazione.

Una volta attivato, il complesso cdk-ciclina svolge le funzioni di MPF attivo e, con la sua attività di protein-chinasi, induce l'entrata in mitosi. Per quanto riguarda la disgregazione dell'involucro nucleare, MPF attivo fosforila e induce altre chinasi a fosforilare le lamine della lamina nucleare (proteine a cui è associata la membrana nucleare interna). La fosforilazione induce la depolarizzazione delle lamine che porta alla disgregazione della lamina nucleare. La perdita della lamina nucleare destabilizza l'involucro nucleare, che si disperde in piccole vesicole membranarie.

La condensazione cromosomica è indotta dalla fosforilazione di alcune proteine cromosomiche, tra cui l'istone H1 e il complesso multiproteico della condensina. La fosforilazione delle proteine associate ai microtubuli può facilitare la formazione del fuso mitotico.

Operazioni relative al punto di controllo G1: il bersaglio principale è la proteina Rb, una molecola che controlla l'espressione di geni i cui prodotti proteici sono necessari per poter oltrepassare il punto di controllo G1 e entrare nella fase S. La proteina Rb esercita questo tipo di controllo legando il fattore trascrizionale E2F, una proteina che, quando non è legata ad Rb, attiva la trascrizione dei geni che codificano per enzimi ed altre proteine necessarie per iniziare la replicazione del DNA. Finché la proteina Rb è legata a E2F tale molecola è inattiva, e questi geni restano inespressi, impedendo l'entrata della cellula in fase S.

Nelle cellule che hanno ricevuto uno stimolo proliferativo (per esempio da parte di un fattore di crescita), la via del segnale mediata da fattori di crescita porta alla produzione e all'attivazione di complessi cdk-ciclina che catalizzano la fosforilazione della proteina Rb. Le molecole di Rb fosforilate perdono così la capacità di trattenere E2F, e E2F libero attiva la trascrizione dei geni i cui prodotti sono necessari per l'ingresso in fase S.

La proteina codificata dal gene p53 svolge un ruolo cruciale nell'impedire che le cellule con il DNA danneggiato superino il punto di controllo G1 con un meccanismo di azione che si basa in parte sulla inibizione della via che porta alla fosforilazione di Rb. L'inizio dell'anafase invece, è indotto da una via di degradazione delle proteine attivata verso la fine della mitosi ad opera di MPF (il complesso mitotico cdk-ciclina che agisce al punto di controllo G2). MPF consente il superamento del punto di controllo dell'assemblaggio del fuso catalizzando una o più reazioni di fosforilazione di proteine che portano all'attivazione del complesso che promuove l'anafase. Il ruolo di questo complesso è quello di segnare il destino degradativo di alcune proteine bersaglio, legandole alla ubiquitina, una molecola il cui legame a una proteina ne induce la distruzione.

Il complesso che promuove l'anafase segna il destino degradativo di almeno 2 tipi di proteine. In primo luogo, induce la degradazione degli inibitori dell'anafase, che in condizioni normale impediscono l'inizio dell'anafase mantenendo legati i due cromatidi fratelli. Il secondo tipo di proteina a cui viene legata la ubiquitina è la ciclina mitotica, la cui concentrazione alla fine della mitosi si abbassa drasticamente. Essendo la ciclina mitotica una componente di MPF, anche MPF smette di funzionare. Il complesso che promuove l'anafase induce sia l'inizio dell'anafase, (attraverso la degradazione degli inibitori dell'anafase) sia il successivo completamento della mitosi (attraverso la degradazione della ciclina mitotica). Il completamento di questo passaggio è controllato dai cinetocori dei cromosomi che, fin quando non sono attaccati ai microtubuli del fuso, rilasciano una proteina, la Mad2. Mad2 inibisce il complesso che promuove l'anafase, impedendo quindi l'inizio dell'anafase. Quando tutti i cinetocori sono stati attaccati al fuso, Mad2 non è più rilasciata, il complesso che promuove l'anafase non è più inibito e l'anafase può avere inizio.

Gli organismi multicellulari utilizzano proteine extracellulari chiamate fattori di crescita, come segnali che contrallano il tasso di crescita cellulare. (fattore di crescita di derivazione piastrinica PDGF, fattore di crescita epidermico EGF). I fattori di crescita come PDGF e EGF agiscono legandosi a recettori di membrana situati sulle cellule bersaglio. I recettori dei fattori di crescita hanno attività tirosina chinasica. Il legame del fattore di crescita al recettore ne stimola l'attività tirosina chinasica, che provoca la fosforilazione di residui di tirosina situati nella regione intracitoplasmatica del recettore. In tutta la cascata di eventi che si relazza successivamente ha un ruolo chiave la via di Ras.

Il meccanismo con cui la via di Ras induce il superamento del punto di controllo di G1 e l'entrata in fase S ha sei passaggi:

1. Il fattore che stimola la crescita si lega al recettore di membrana.
2. Questo legame stimola l'attività tirosina chinasica del recettore, causando quindi la fosforilazione dei residui di trosina.
3. Le tirosine fosforilate servono come sito di legame per una serie di proteine adattatrici che, a loro volta, attivano una proteina G associata alla membrana, la proteina Ras. Come nel caso di altre proteine G, l'attivazione della proteina Ras è accompagnata al legame di GTP e al rilascio di GDP.
4. La molecola Ras attivata stimola una cascata di reazioni di fosforilazione, che inizia con la fosforilazione di una proteina chinasi detta Raf. Nella forma attiva Raf fosforila le serine e le treonine di una proteina chinasi chiamate MEK, che a sua volta fosforila le treonine e le tirosine di un gruppo di proteine chinasi dette MAP chinasi.
5. Le MAP chinasi attive entrano nel nucleo e fosforilano diversi fattori trascrizionali, cioè proteine che attivano la trascrizione di geni specifici. Tra le proteine attivate da questo meccanismo di fosforilazione vi è Jun (che fa parte del fattore trascrizionale AP-1) e alcune proteine della famiglia di fattori trascrizionali ETS. Questi fattori trascrizionali così attivati accendono la trascrizione dei geni precoci che codificano per altri fattori trascrizionali come Myc, Fos e Jun, che, a loro volta, attivano la trascrizione di alcuni geni tardivi: uno di questi codifica per il fattore E2F.
6. Tra i geni tardivi ci sono anche i geni per chinasi e cicline, la cui produzione porta alla formazione di processi di complessi ciclina-chinasi che fosforilano la proteina Rb e quindi inducono il passaggio da G1 a S.

Alcuni fattori di crescita in realtà inibiscono la proliferazione cellulare. Un esempio è il fattore di trasformazione-beta (TGF-beta), una proteina che, a seconda del tipo di cellula bersaglio, può avere sia funzione di inibizione che di attivazione della crescita. Tra le attività anti-proliferative di TGF-beta c'è un'azione antagonista nei confronti dell'effetto stimolante della crescita di altri fattori come PDGF e EGF. Quando agisce come inibitore della crescita, TGF-beta legandosi al suo recettore di superficie, stimola una serie di eventi che fanno aumentare i livelli della proteina p15, che sopprime l'attività dei complessi cdk-ciclina, bloccando quindi la progressione del ciclo cellulare. La proteina p15 funziona quindi come cdk inibitore. Un altro fattore che funzione come cdk inibitore è la proteina p21, che svolge un ruolo cruciale nell'impedire che le cellule che hanno danni al DNA superino il punto di controllo G1.

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Citoscheletro

L'interno delle cellule eucariotiche è organizzato attraverso il citoscheletro, che è strutturato come una rete proteica complessa di filamenti.