Biologia e genetica

Medicina genetica

Finalità del corso

Fornire gli strumenti per poter utilizzare in medicina le nuove conoscenze della genetica → portare in ambito clinico quelle che sono le novità nell’ambito della ricerca.

Abituare a ragionare in termini di prevenzione per quanto riguarda una malattia genetica (rischi, prevenzione, etc.).

Il corso è diviso in una parte di medicina genetica e in una di genetica medica:

• Genetica medica: si basa sullo studio di malattie genetiche rare (cioè malattie con una frequenza pari o inferiore a 1/2000 nella popolazione) ereditate in modo mendeliano, monogeniche.
• Medicina genetica: implica il fatto che la genetica abbia invaso un po’ tutte le discipline della medicina. Per molte malattie comuni (ipertensione, cancro, etc) hanno una forte componente genetica (geni di suscettibilità + influenza ambientale → determinano l’insorgenza della patologia).

Genetica medica: alberi genealogici e analisi di segregazione

Questo albero genealogico mostra:

• Una coppia in cui il marito è malato e la donna no.
• Questa coppia ha avuto 10 figli, di cui 3 sono malati, sia maschi che femmine.
• In ogni generazione ci sono sempre individui malati.

Una figlia malata della prima coppia ha avuto due mariti e ha generato una figlia affetta con il primo e una affetta anche con il secondo → trasmissione di tipo autosomico dominante, basta una copia alterata del gene per avere la manifestazione della malattia (rischio di trasmissione alla prole di un individuo malato del 50%, se un figlio è sano, non ha ricevuto l’allele e non trasmetterà più la malattia).

Questo albero genealogico mostra:

• 5 individui malati, tutti maschi → legato al cromosoma X, maschio ha un solo cromosoma X, se eredita un cromosoma malato, manifesta sicuramente la patologia, risulta malato.

Il maschio della prima generazione ha una malattia legata al cromosoma X (es. daltonismo), i suoi figli maschi sono sempre sani, perché trasmette loro un cromosoma Y (N.B: nelle patologie legate al cromosoma X non c’è MAI trasmissione da padre malato a figlio maschio).

La figlia della prima coppia è sicuramente portatrice obbligata, correrà perciò il rischio di generare figli maschi ammalati, e infatti lo trasmette alla prima figlia, che ha due figli malati (delle altre non posso sapere perché non hanno figli, hanno un rischio del 50% essendo la madre portatrice obbligata).

Come si stabilisce se una donna è portatrice obbligata di una patologia legata all’X?

• È figlia di un individuo malato.
• Ha almeno un fratello e un figlio con la stessa malattia (deve avere anche un fratello affetto, perché se solo il figlio è affetto e la storia familiare negativa, potrebbe avere una mutazione nel nonno del bambino, mentre se ha anche un fratello malato, è sicuramente la nonna ad essere portatrice, ne deriva che lei è portatrice obbligata).

Questa donna ha il 50% di probabilità di generare figli malati e il 50% di generare figlie portatrici.

Questo albero genealogico mostra:

• Tutti gli affetti sono maschi → si tratta di una patologia legata al cromosoma X.

Posso determinare le femmine portatrici con i criteri di prima.

Con un’analisi di segregazione posso trarre molte informazioni da questo albero genealogico:

• Come si trasmette la malattia.
• Stato di portatore/portatrice degli individui.

Anche in questo caso tutti gli affetti sono maschi, ma il terzo individuo della prima generazione trasmette la patologica al figlio maschio (trasmissione da maschio a maschio), quindi non è legata all’X, è autosomica ad espressività limitata al sesso maschile; non è legata al cromosoma Y perché ci sono femmine che trasmettono la malattia e perché il cromosoma Y è molto piccolo e se ha geni alterati normalmente l’uomo è infertile.

Patologie autosomiche recessive

Nelle patologie autosomiche recessive accade che per diverse generazioni non vi siano segnalazioni di individui affetti → patologia ricompare improvvisamente.

Servono entrambi gli alleli alterati per manifestare la patologia: la mutazione può o meno essere la stessa su entrambi i geni, con medesimo effetto finale (omozigote recessivo ed eterozigote composto).

La popolazione è un serbatoio di geni recessivi → progetto di sequenziamento del genoma di mille individui: ognuno di noi è portatore sano di circa dieci geni malattia.

Nel 98% dei casi i figli nascono comunque sani, il rischio di un’anomalia congenita alla nascita di figlio di una coppia “sana” è di 1-2%.

Vi sono alcune malattie più frequenti, come la fibrosi cistica (1 su 2500) → circa 1 individuo su 25 è portatore del gene recessivo per la fibrosi cistica. La probabilità che incontri un altro individuo con tale mutazione è 1/25 x 1/25, poi, come in tutte le malattie recessive, la probabilità che da due portatori nasca un individuo malato è di 1/4; 1/25 x 1/25 x 1/4 = 1/2500 → frequenza della malattia nella popolazione.

Più una malattia genetica è rara (es: 1/100000), più è facile che i genitori di un individuo malato siano tra loro consanguinei (albero “e”: matrimonio tra cugini di primo grado).

Omozigoti recessivi in questo caso vengono detti omoziogoti per discesa, perché è lo stesso allele che viene trasmesso all’individuo passando per due vie diverse.

Es: vengono in consulenza due fratelli di un individuo morto nei primi mesi di vita in conseguenza a una patologia recessiva. Chiedono qual è la loro probabilità di essere portatori del gene recessivo. L’individuo morto era sicuramente aa:

A a/♀/A AA Aa aa

Loro non sono sicuramente “aa” perché non sono ammalati, quindi la loro probabilità di essere portatori è 2/3.

Se fosse venuta la madre in gravidanza, le probabilità del bambino sarebbero state:

• 25% completamente sano.
• 25% malato.
• 50% portatore sano.

Una volta nato il bambino, se non è malato, la sua probabilità di essere portatore sale a 2/3, perché essendo sano si esclude l’aplotipo aa.

Polimorfismi

Human Genome Project → progetto di sequenziamento dell’intero DNA umano dal 1 ottobre del 1990 al 30 settembre del 2005: fu terminato con 5 anni di anticipo, nel 2000.

Occorre chiarire alcune definizioni:

• Gene: unità di ereditarietà. Produce una proteina che svolge una funzione all’interno dell’organismo.
• Genetica: scienza che studia l’ereditarietà nell’uomo.
• Genoma: deriva da genes e chromosomes, è il set completo di geni e cromosomi di un individuo.
• Genomica: studio strutturale e funzionale del nostro genoma.

Catalogo di tutte le malattie genetiche mendeliane → MIM (Mendelian Inheritance in Man), dal ’98 solo in forma elettronica (OMIM, on-line – MIM).

Solo 13.693 geni sono stati completamente sequenziati. Vi sono 3-4000 malattie di cui si conosce perfettamente l’anomalia genetica.

Il genoma umano è stato paragonato a quello di altri esseri viventi:

• Microbes 1 gene / kb 90% Coding
• S. cerevisiae 1 gene / 2 kb 70%
• C.elegans 1 gene / 5 kb 40%
• A. thaliana 1 gene / 5 kb 20%
• D. melanogaster 1 gene / 13 kb 20%
• H. sapiens 1 gene / 40 kb 3%

Genomica comparativa → paragona esattamente la sequenza del nostro genoma con quello di altre specie animali. Questo ci consente di individuare il ruolo di alcuni geni → es. esiste un mutante spontaneo di Drosophila, chiamato eye-less, cioè cieca, dovuta a mutazione del gene Pax-6. Nell’uomo, mutazioni di Pax-6 danno aniridia (assenza dell’iride) e altre mutazioni importanti che compromettono lo sviluppo embrionale dell’occhio.

Con la genomica comparativa si può individuare meglio il ruolo di alcuni geni umani. Non più 1 gene = 1 proteina, ma circa 25000 geni che codificano per 1 milione di proteine → dogma rotto dal sequenziamento del genoma.

Inoltre, nell’era post-genomica, non è importante l’analisi del singolo gene, ma è importante capire l’interazione tra geni diversi, quindi devo comprendere il funzionamento di più geni.

Inoltre, eravamo abituati a pensare che un DNA sano portava forzatamente a un soggetto sano e un DNA mutato portava all’espressione della malattia genetica → in realtà, ognuno ha molte mutazioni all’interno del DNA (circa 20000 a testa), quindi vi sono molte varianti che non sono di per sé patogene, ma sono i cosiddetti polimorfismi, variazioni all’interno della sequenza del nostro DNA con una frequenza nella popolazione superiore almeno all’1%.

Questi polimorfismi hanno aperto un nuovo concetto: quelle variazioni non danno un individuo malato, ma possono creare una proteina che può funzionare un po’ di più o un po’ di meno, che può favorire lo sviluppo di una malattia complessa o può proteggere da tale patologia, oppure possono concorrere a modificare l’espressività di malattie monogeniche.

Sequenziamento del genoma e polimorfismi

Ora è possibile sequenziare tutto il genoma di un individuo in poche settimane (contro i 10 anni del primo) grazie alle nuove strumentazioni. Si sta facendo l’esoma, la sequenza di tutta la porzione codificante del genoma. Da questi esperimenti, si vede che all’interno degli esoni ci sono circa 20000 o più varianti, molte di queste sono dei polimorfismi di un singolo nucleotidi, alcune sono mutazioni → vanno interpretati.

Il DNA è pieno di varianti e tutte queste varianti, alcune sono collegate a malattie mendeliano, altre sono loci di suscettibilità, etc. e possono anche determinare l’espressività di malattie mendeliane.

Polimorfismi del DNA e loro applicazioni alla genetica clinica

Definizione di polimorfismo: un polimorfismo è definito dalla presenza in una popolazione di una o più varianti (alleli) di un gene. Per essere definite polimorfismi, queste varianti devono avere una frequenza nella popolazione di almeno l’1%. I polimorfismi possono essere:

• Silenti: non hanno alcun effetto sulla proteina prodotto del gene in cui si trovano (non hanno effetto fenotipico).
• Dovuti a sostituzioni di basi (SNPs).
• Dovuti a inserzioni di basi.
• Dovuti a delezioni di basi.
• Dovuti a ripetizioni in tandem e variazioni nel numero.

Storicamente, i polimorfismi considerati erano i gruppi sanguigni, HLA, etc. Ora l’approccio ai polimorfismi è differente.

RFLP: restriction fragment length polymorphism

VNTR: variable number of tandem repetition (minisatelliti, microsatelliti)

Sono sistemi più lunghi, ma molti più polimorfi, quindi con più alleli e più informativi.

RFLP: polimorfismi di lunghezza di frammenti di restrizione

Ci sono enzimi che tagliano il DNA in determinate regioni specifiche, sequenze dette “palindromi” (uguali in un senso e nell’altro): per esempio, EcoR1 taglia la sequenza GAATTC → endonucleasi che taglia il DNA in presenza della specifica sequenza GAATTC riconosce la sequenza.

Il taglio può essere netto, o può creare due estremità dette “appiccicose”, utili per il clonaggio del DNA e la biologia molecolare → se una base muta, l’enzima non digerisce più quel tratto, polimorfismo fa perdere il sito di restrizione → poso analizzare i polimorfismi basandomi sui tagli effettuati da questi enzimi.

Tecnica del Southern Blotting

Riguarda l’analisi del DNA genomico: analizza sequenze tagliate dagli enzimi di restrizione. DNA dell’individuo viene tagliato dagli enzimi di restrizione; lo si fa migrare su gel di agarosio (i frammenti si divideranno a seconda della loro lunghezza); viene trasferito il tutto su membrana di nitrocellulosa utilizzando un sistema di soluzione salina e carta assorbente che trasferisce il DNA; membrana viene poi ibridata con una sonda che riconosce una sequenza specifica del DNA.

Individuo 1: eterozigote

Individuo 2: omozigote per A

Individuo 3: omozigote per B

Prendiamo l’individuo 3: ha la sequenza GAATTC in tre siti di restrizione che viene tagliata da EcoR1 ed essendo omozigote, facendo la Southern Blot, la sonda (barra rossa nel disegno) evidenzia che l’individuo è omozigote per un frammento di dimensioni B che indica esattamente che su entrambi gli alleli ha gli stessi tre siti di restrizione (una sola banda).

L’individuo 2 ha una variante in una delle sequenze GAATTC nel tratto di DNA considerato, che quindi non è più riconosciuta dall’enzima di restrizione, su entrambi gli alleli (è omozigote per la variante): facendo la Southern Blot sempre con EcoR1 e utilizzando la stessa sonda, questa mostra l’omozigosi per un frammento A più lungo dell’individuo 3 (manca un sito di restrizione intermedio→ una sola banda, ma più pesante).

L’individuo 1 è eterozigote: su un allele, ha la sequenza normale con tre siti di restrizione, mentre sull’altro ha il polimorfismo, e perciò manca la sequenza di restrizione intermedia. Facendo la Southern Blot con la solita sonda, trovo sia il frammento A che il frammento B, quindi l’individuo è eterozigote per questo polimorfismo (due bande).

Questi sono gli RFLP, cioè polimorfismi di lunghezza di frammenti di restrizione: noi possiamo dire che 3 è omozigote per la presenza del frammento di restrizione, che 2 è omozigote per l’assenza del frammento di restrizione e che 1 ha due lunghezze diverse, quindi è eterozigote.

Con la PCR, si è reso possibile amplificare un tratto di DNA che contiene la sequenza di interesse per lo studio degli RFLP, senza l’impiego delle settimane di lavoro e delle sonde radioattive necessarie per la Southern Blot.

Esempio: diagnosi di anemia falciforme

L’anemia a cellule falciformi è una patologia dovuta a una mutazione a livello della sequenza del gene betaglobinico; in particolare, nella porzione iniziale c’è una sequenza che normalmente è riconosciuta dall’enzima MST2 (CCTAGG) → nell’anemia falciforme, questa sequenza è mutata per sostituzione di A con T, quindi non è riconosciuta dall’enzima di restrizione → si crea un unico frammento da 1,4kbR → soggetto normale presenta solo il frammento dal 1,2kb, il soggetto eterozigote portatore presenta sia il frammento da 1,2kb che quello da 1,4kb, mentre il soggetto omozigote malato presenta solo il frammento da 1,4kb.

Quindi, questi polimorfismi possono essere utilizzati non solo per gli studi di linkage, ma anche in casi per cui la variante che perde o riconosce un sito nuovo di restrizione è una mutazione responsabile di una malattia genetica, può essere utilizzato questo metodo per la diagnosi di malattia genetica.

VNRT

Ulteriori passi avanti nello studio dei polimorfismi sono stati fatti con l’analisi dei VNRT, minisatelliti e microsatelliti. Sono in numero minore rispetto agli RFLP, ma presentano un numero maggiore di alleli (RFLP sono sistemi a due soli alleli) e perciò sono più informativi. Sono ripetizioni di 2, 3 o 4 paia di basi in tandem: possono essere ripetuti tre volte, cinque, sette… etc. A seconda del numero di ripetizioni, ovviamente, questi frammenti possono essere più o meno lunghi e possono essere evidenziati tramite scorrimento dell’amplificazione di quel tratto di DNA su gel di agarosio.

Segregazione di un microsatellite in una famiglia: il padre ha due alleli molto distanti tra loro, mentre la madre ha due alleli più vicini sul gel di agarosio. Si nota che i figli prendono sempre un allele da un genitore e uno dall’altro.

È importante negli studi di linkage (di concatenazione) che i marcatori siano informativi, cioè che si riesca sempre a capire qual è l’allele che un figlio prende da un genitore e quale dall’altro: questo si può fare se i genitori sono doppi eterozigoti per alleli diversi, perché per esempio → entrambi i genitori sono omozigoti 1,1: i figli saranno tutti 1,1, ma non so dire quale hanno ereditato dal padre e quale dalla madre perché non sono marcatori informativi.

I microsatelliti sono molto polimorfi e vengono usati nella genetica forense, nel riconoscimento di paternità: questo perché, analizzando un certo numero di questi microsatelliti, l’impronta genetica che ne ricaviamo è praticamente unica.

Uno dei microsatelliti più usati è il CA-repeat, che si trova molto spesso nel DNA e viene frequentemente utilizzato in questi studi.