Biologia e genetica

B

C A 2

A

B

C 3

B

C

Individuo 1: eterozigote

Individuo 2: omozigote per A

Individuo 3. omozigote per B

Prendiamo l’individuo 3: ha la sequenza GAATTC in tre siti di restrizione che viene tagliata da

EcoR1 ed essendo omozigote, facendo la Southern Blot, la sonda (barra rossa nel disegno)

evidenzia che l’individuo è omozigote per un frammento di dimensioni B che indica esattamente

che su entrambi gli alleli ha gli stessi tre siti di restrizione (una sola banda).

L’individuo 2 ha una variante in una delle sequenze GAATTC nel tratto di DNA considerato, che

quindi non è più riconosciuta dall’enzima di restrizione, su entrambi gli alleli (è omozigote per la

variante): facendo la Southern Blot sempre con EcoR1 e utilizzando la stessa sonda, questa mostra

l’omozigosi per un frammento A più lungo dell’individuo 3 (manca un sito di restrizione

intermedio→ una sola banda, ma più pesante).

L’individuo 1 è eterozigote: su un allele, ha la sequenza normale con tre siti di restrizione, mentre

sull’altro ha il polimorfismo, e perciò manca la sequenza di restrizione intermedia.

Facendo la Southern Blot con la solita sonda, trovo sia il frammento A che il frammento B, quindi

l’individuo è eterozigote per questo polimorfismo (due bande).

Questi sono gli RFLP, cioè POLIMORFISMI DI LUNGHEZZA DI FRAMMENTI DI

RESTRIZIONE: noi possiamo dire che 3 è omozigote per la presenza del frammento di restrizione,

che 2 è omozigote per l’assenza del frammento di restrizione e che 1 ha due lunghezze diverse,

quindi è eterozigote.

Con la PCR, si è reso possibile amplificare un tratto di DNA che contiene la sequenza di interesse

per lo studio degli RFLP, senza l’impiego delle settimane di lavoro e delle sonde radioattive

necessarie per la Southern Blot. 10

Es: per fare diagnosi di anemia falciforme

L’anemia a cellule falciformi è una patologia dovuta a una mutazione a livello della sequenza del

gene betaglobinico; in particolare, nella porzione iniziale c’è una sequenza che normalmente è

riconosciuta dall’enzima MST2 (CCTAGG) → nell’anemia falciforme, questa sequenza è mutata

per sostituzione di A con T, quindi non è riconosciuta dall’enzima di restrizione

→ si crea un unico frammento da 1,4kb

R → soggetto normale presenta solo il frammento dal 1,2kb, il soggetto eterozigote

IQUADRO

portatore presenta sia il frammento da 1,2kb che quello da 1,4kb, mentre il soggetto omozigote

malato presenta solo il frammento da 1,4kb.

Quindi, questi polimorfismi possono essere utilizzati non solo per gli studi di linkage, ma anche in

casi per cui la variante che perde o riconosce un sito nuovo di restrizione è una mutazione

responsabile di una malattia genetica, può essere utilizzato questo metodo per la diagnosi di

malattia genetica.

VNRT

Ulteriori passi avanti nello studio dei polimorfismi sono stai fatti con l’analisi dei VNRT,

minisatelliti e microsatelliti.

Sono in numero minore rispetto agli RFLP, ma presentano un numero maggiore di alleli (RFLP

sono sistemi a due soli alleli) e perciò sono più informativi.

Sono ripetizioni di 2,3 o 4 paia di basi in tandem: possono essere ripetuti tre volte, cinque, sette…

etc.

A seconda del numero di ripetizioni, ovviamente, questi frammenti possono essere più o meno

lunghi e possono essere evidenziati tramite scorrimento dell’amplificazione di quel tratto di DNA

su gel di agarosio. 11

R C → segregazione di un microsatellite in una famiglia: il padre ha due alleli molto

IQUADRO

distanti tra loro, mentre la madre ha due alleli più vicini sul gel di agarosio. Si nota che i figli

prendono sempre un allele da un genitore e uno dall’altro.

E’ importante negli studi di linkage (di concatenazione) che i marcatori siano informativi, cioè che

si riesca sempre a capire qual è l’allele che un figlio prende da un genitore e quale dall’altro: questo

si può fare se i genitori sono doppi eterozigoti per alleli diversi, perché per esempio

→ entrambi i genitori sono omozigoti 1,1: i figli saranno tutti 1,1, ma non so dire quale hanno

ereditato dal padre e quale dalla madre perché non sono marcatori informativi.

I microsatelliti sono molto polimorfi e vengono usati nella genetica forense, nel riconoscimento di

paternità: questo poiché, analizzando un certo numero di questi microsatelliti, l’impronta genetica

che ne ricaviamo è praticamente unica.

Uno dei microsatelliti più usati è il CA-repeat, che si trova molto spesso nel DNA e viene utilizzato

per l’analisi di segregazione → numero particolare di ripetizioni di CA differenzia i vari genomi.

Oggi è possibile vederli facilmente marcando uno dei primer della PCR con un fluorocromo che

correndo su un sequenziatore automatico il prodotto di PCR permette di distinguere i frammenti di

DNA anche per una differenza di una sola base: 12

Famiglia informativa →

la madre è malata di una patologia dominante

che ha trasmesso al figlio, ma noi non sappiamo

ancora di quale gene si tratti. Però sappiamo

che sta su un determinato cromosoma.

In questa regione dove noi abbiamo mappato il

gene malattia c’è un marcatore polimorfico,

quindi io studio la segregazione di questo

marcatore polimorfico nella famiglia.

Questo è un microsatellite: il padre ha

frammenti di 150 e 154 paia di basi, quindi è

eterozigote in questa regione del DNA che sto

esaminando (i due cromosomi di differenziano

per 4 paia di basi, cioè per due CA-repeat). La madre invece ha due alleli che si differenziano per

sei paia di basi, 140 e 146, quindi per tre CA-repeat.

A questo punto vado a vedere la segregazione nei figli: la prima figlia prende l’allele 154 dal padre

e il 146 dalla madre, la seconda figlia prende il 150 al padre e il 146 dalla madre e il figlio malato

prende l’allele 150 dal padre e 140 dalla madre.

Se questo marcatore polimorfico è strettamente concatenato al gene-malattia, sebbene io non

conosca il gene-malattia o la sua mutazione che causa la malattia, io posso seguire la segregazione

degli alleli a questo determinato polimorfismo per capire chi nella famiglia prende il cromosoma

malattia e quindi svilupperà la patologia.

Cioè → se questo marcatore è molto vicino al gene che determina la malattia in questa donna,

significa che ogni volta che trasmette l’allele con 140 paia di basi di quel marcatore,

automaticamente insieme trasmette anche il gene malato e i figli presenteranno la patologia.

QUESTO E’ IL LINKAGE → eccezione alle leggi di Mendel: a volte qualche esperimento non

rispondeva all’idea della segregazione mendeliana, e lui scartava questi esperimenti → erano

esperimenti dove era avvenuto il linkage, o concatenazione.

La seconda legge di Mendel dice che due caratteri segregano indipendentemente: questo è vero se

due caratteri si trovano su cromosomi diversi oppure sullo stesso cromosoma ma molto distanziati

tra loro. Ma se due caratteri sono molto vicini sullo stesso cromosoma, questi tenderanno a

segregare insieme → LINKAGE.

Più vicini sono due caratteri, più è facile che i due caratteri alla meiosi vadano insieme, cioè è più

facile che non avvenga un crossing over che li divide.

E’ per questo che, pur non conoscendo il gene-malattia ma solo un polimorfismo vicino, posso

studiare la segregazione del microsatellite per determinare la presenza o meno del gene mutato,

perché questi due caratteri segregheranno sempre assieme.

N.B.: il linkage serve per mappare i difetti genetici sul nostro genoma, si parte da questo concetto di

concatenazione per arrivare a identificare la regione genomica nella quale c’è il gene-malattia

SNPs

Sono polimorfismi di un singolo nucleotide → SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM

In alcune sequenze del genoma, almeno nell’1% della popolazione una base è mutata.

Es: CCATTGACTT

CCTTTGACTT

Possono esserci persone omozigoti per la A, per la T o eterozigoti.

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Questi polimorfismi di un singolo nucleotide sono facilmente studiabili oggi con i sistemi di

microarray etc, sono sicuramente meno informativi dei microsatelliti, ma siccome sono in numero

molto maggiore, se ne studiamo tantissimi tutti assieme arriviamo ad avere la stessa informazione

che avremmo con meno microsatelliti.

Con il progetto Genoma Umano è stata costruita una mappa di SNPs → dbSNP: SNPdatabase

Racchiude tutti i polimorfismi che sono stati identificati nella sequenza del nostro genoma fino ad

ora (aumentano con l’analisi di nuovi genomi).

Si pensava che ci fossero circa 3 milioni di SNPs, ma ora si è visto che sono più di 4 milioni.

Il database degli SNPs fornirà la cura appropriata al paziente appropriato: se per esempio, testiamo

un farmaco su una popolazione che risponde molto bene alla terapia, mentre un’altra reagisce in

maniera negativa allo stesso farmaco, posso, comparando i diversi SNPs, capire quali sono i

polimorfismi che inducono una buona o una pessima risposta alla terapia presa in considerazione (e

quindi adattare la terapia).

Inoltre, può fornire informazioni sulla suscettibilità o la protezione verso malattie multifattoriali.

LINKAGE EQUILIBRIUM: indica una combinazione casuale di alleli a loci associati.

Consideriamo per esempio il caso di due loci associati 1 e 2 con 2 possibili alleli ciascuno (A e a

per il locus 1 e B e b per il locus 2) Gli aplotipi possibili in una determinata popolazione (AB, Ab,

aB, ab) si verificheranno con una frequenza che è il prodotto delle frequenze dei singoli alleli per

ciascun aplotipo.

LINKAGE DISEQUILIBRIUM (LD) è un termine dell'ambito genetico che indica la presenza di

associazione statistica tra specifici alleli relativi a due o più loci, che costituiscono di solito un

particolare aplotipo ancestrale, diffuso nella popolazione in cui è rilevato perché trasmesso lungo la

discendenza da un comune progenitore. Per questo motivo il linkage disequilibrium è maggiore in

popolazioni omogenee, cioè originate da un nucleo di individui fondatori come le popolazioni sarda

o finlandese. Infatti le migrazioni recenti generano substruttura ed eterogeneità genetica e aplotipi

differenti associati allo stesso tratto tendono ad abbassare i valori di significatività.

Il linkage disequilibrium è un importante strumento per individuare regioni cromosomiche di

limitata ampiezza in cui si collocano i geni per una data malattia (mappaggio ad alta risoluzione) e

si avvale dell'analisi molecolare di varianti alleliche (per lo più di SNPs o STRs) che costituiscono

aplotipi in pazienti t