Biologia dello sviluppo Prof. Luzzati

Biologia dello sviluppo

Prof. Luzzati - Anno 2014/2015

Cosa rende diversa una cellula da un'altra?

L'espressione dei geni. Possono essere geni molto diversi e sparpagliati nel cromosoma. Le cellule hanno specifiche funzioni e dei geni specializzati. L'idea che dalla singola cellula si ha la produzione di diverse cellule viene affrontata con la teoria cellulare. Secondo Weismann, questi meccanismi avvengono all'interno del nucleo, dopodiché le cellule si dividono e danno origine a dei lineaggi. Per capire il meccanismo bisogna immaginare che questi lineaggi delimitino dei determinanti nucleari; questi ultimi segregano in diversi lineaggi.

Esperimenti di Roux e Driesch

Un collaboratore di Weissman, Roux, decise di verificare questa ipotesi: “l'immisione di un ago incandescente all'interno di un blastomero ne provoca la morte. Lo sviluppo non si interrompe ma abbiamo comunque la crescita di metà embrione”. Successivamente Driesch volle estenderne i risultati: per avere un sistema più pulito voleva far sviluppare pezzi dell'embrione. Centrifugandoli riesce a separare i primi due e poi i primi quattro, ottenendo così che ciascuna delle 4 cellule è in grado di procedere autonomamente nello sviluppo.

Conseguenze fondamentali

• Lo sviluppo deve essere regolativo.
• Questi zigoti sono totipotenti.
• Il potenziale prospettico di un blastomero è più grande del destino di un embrione intatto.

Questo destino è regolato da fattori che possono essere intrinseci ed estrinseci. Alcuni embrioni hanno all'interno dell'uovo fattori che ne determinano il destino. Destino e potenziale sono due cose diverse e questa differenza dipende dal fatto che il destino è regolato.

Genomica equivalence e clonazione

Nella genomica equivalence il DNA perde di potenzialità. Per cercare di capire cosa si perde quantitativamente bisogna far riferimento ad un esperimento fatto da Briggs e King. Provano a fare dei trapianti di nuclei (primissimi esperimenti di clonazione), trapiantando la cellula in un citoplasma non ancora sviluppato. Tolgono il nucleo originale e iniettano i nuclei a diversi stadi dello sviluppo. Successivamente calcolano la frequenza. Notano che se prendono la cellula dalla late blastula, c'è una frequenza dell'80%. Tra la fine della blastula e la early gastrula si ha un crollo drastico della frequenza. Andando ancora avanti si vede come allo stadio di neurula la frequenza sia ancora più bassa. Quindi si nota che in questi nuclei c'è qualcosa che ne inibisce la plasticità e la capacità di rispondere alla riprogrammazione.

Successivamente Gourdon vinse il premio Nobel rifacendo l'esperimento di Briggs e King con uno xenopus. Prende dei nuclei e li sostituisce con quelli delle cellule a diversi stadi di sviluppo ottenendo sempre una linea che va a diminuire, ma andando avanti con l'esperimento prende alcune cellule da un individuo non sviluppato ottenendo così una clonazione notando di aver clonato un individuo adulto. Nei mammiferi i nuclear-transfer funzionano con un'efficienza molto alta.

Scoperta delle IPS

Poco tempo dopo Gurdon e Yamanaka prendono il Nobel per aver scoperto le IPS. Yamanaka prende alcuni fattori di trascrizione nelle cellule staminali e li posiziona all'interno di fibroblasti in coltura ottenendo cellule pluripotenti (Induced Pluripotent Stem-cell). Il vantaggio di queste cellule è che sono naturalmente potenti, crescono in vitro all'infinito e mantengono questa potenzialità intatta. Un qualunque fibroblasto è in grado di possedere tutti i geni per riprodurre un intero organismo.

Teoria della pluripotenza e modello di Waddington

Gli embrioni stem cell sono cellule che vengono isolate dalla inner cell mass della blastocite. Possiamo vedere questa pluripotenza come una fase metastabile. Immaginiamo la nostra cellula pluripotente come una cellula che ha un potenziale metastabile più alto, cioè è stabile ad un livello di energia più alto rispetto al suo livello di energia a riposo. Dallo stato metastabile si può procedere oltre verso uno stato più stabile, la cellula differenziata. La stem cell è in grado e ha un potenziale differenziativo maggiore.

Questo ha ispirato Waddington che sostenne che una cellula posta sopra un piano inclinato rotola, e lo sviluppo corrisponderebbe a prendere queste cellule e indirizzarle verso specifici lineage. La cellula tende spontaneamente a procedere verso il differenziamento. Ci sono molte possibilità e il punto sta nel prendere la cellula nel momento giusto e indirizzarla.

Fattori che regolano la trascrizione

Il fattore di trascrizione è un fattore che può regolarsi a sequenze regolative in vari posti nel gene modulando l'espressione del gene stesso facendo sì che quest'ultima aumenti, si riduca o reprima l'espressione di un gene impedendo così che questo venga espresso. I fattori di trascrizione sono a loro volta dei geni e possono agire in modo combinatoriale, non hanno una loro sequenza e possono essere condizionati da altri fattori di trascrizione. A seconda del tipo di fattore presente si ha un effetto diverso.

Netowrk di espressione genica

Ci sono degli eventi che fanno cambiare via alla cellula, ovvero dei fattori trascrizionali chiave. Questi fattori, in parte rimangono, in parte vengono regolati e alcuni di essi condizionano il destino di una cellula. Sulla specificazione di diversi tipi cellulari esistono codici di fattori di trascrizione che possono attivare un particolare tipo di sviluppo e specifica un particolare tipo cellulare.

Developmentale program

È un particolare programma di sviluppo all'interno della quale bisogna coordinare l'espressione di tantissimi geni. In questo programma il termine “sviluppo” si riferisce all'inizio del programma stesso e per specificare una cellula devono essere presenti particolari programmi di sviluppo. Ci sono dei casi in cui si dimostra che questi fattori riescono a fare la Direct Lineage Conversion: un meccanismo dove la cellula differenziata si trasforma a partire direttamente da un'altra cellula differenziata. È un meccanismo molto rapido.

The epigenetic landscape

Nel modello di Waddington la cellula può andare dall'alto verso il basso, o in ogni altra direzione. Sempre sulla base di questi studi si è anche cominciato a capire qualcosa sull'evoluzione che ha portato ad un tipo cellulare. È proprio per questo che l'evoluzione e la biologia dello sviluppo collaborano. Per quanto riguarda le cellule, tutti questi studi, hanno cominciato a far capire che alcuni di questi geni sono organizzati in dei moduli la cui espressione può essere controllata dai master G. Si pensava che ci fossero cellule sensoriali e contrattili, queste cellule esprimevano determinati moduli per far contrarre la cellula e altri che ci occupavano della parte sensoriale. Questi moduli venivano controllati da particolari fattori di trascrizione. Con l'evoluzione queste funzioni si sono segregate e distinte in particolari tipi cellulari ma sono rimaste controllati da questi master G. Questa organizzazione modulare è responsabile della segregazione di tipi diversi di cellulari nel nostro corpo.

Tutti questi risultati hanno portato a proporre uno schema diverso per spiegare lo sviluppo e la specificazione di diversi tipi cellulari: the epigenetic disc model. Questo modello (fatto proprio a disco) può creare delle pendenze a seconda di come viene inclinato. Le forze che portano la cellula al differenziamento ci sono sempre ma sono modulabili. Anche qui sono presenti i fattori trascrizionali e ognuno delle varie coppette rappresenta un tipo di cellula.

Stem cells (cellule staminali)

Il potenziale di una cellula è più grande del suo destino. Qualunque cellula è totipotente. Bisogna capire quali elementi e quali fattori risultino determinanti alla cellula per far una scelta e quindi prendere un destino piuttosto che un altro e mantenerlo. C'è una categoria di cellule che viene studiata proprio per il suo potenziale. Sono cellule capaci di generare cellule differenziate ma hanno proprietà anche particolari e sono le Stem Cell (cellule staminali). I passaggi che permettono alle stem cell di dare origine ad altre cell riguardano altre stem cell. È una cellula che presenta determinate proprietà.

Che cos'è una stem cell?

È una cellula capace di fare self-renew: oltre alle capacità di ridare se stessa (progenitore), da cellule differenziate. La cellula staminale è una cellula che ha un fenotipo e ha una sua funzione. Viene chiamata indifferenziata, ma bisogna tenere sempre presente che la cellula madre ha delle funzioni specifiche e un fenotipo specifico.

Queste cell si dividono ma non lo fanno in unico step, sono accompagnate da altri step che vengono chiamati intermediate progenitor step.

Come si dividono le stem cell?

Vengono riconosciuti classicamente e abbiamo due tipi di divisione:

• Simmetrica: dove espandiamo i nuclei dei progenitori. Questo tipo di divisione cambia il numero di cellule staminali.
• Asimmetrica: mantiene costante il numero di cell ma inserisce nel sistema altre cellule differenziate.

La cellula quando si divide fa la mitosi e le cellule figlie non rimangono uguali ma sono diverse.

Tipi di cellule staminali

Di cell staminali ce ne sono moltissime. Vengono suddivise sulla base della loro potenzialità:

• Lo zigote è totipotente ma non è una stem cells perché non si rigenera.
• Le cellule delle inner self mex, vengono chiamate pluripotent stem cell, ma non sono pluripotenti. Qst cell messe in vitro possiamo tenerle in qst condzione per sempre, in vivo invece scompaiono e danno origine a cellule un po' più complesse.

Fisiologicamente questo potential è regolato in una piccola fase dello sviluppo. Quando pensiamo a una stem cell pensiamo a qualcosa di tessuto specifico che dura per tutta la vita dell'animale ma soprattutto pensiamo a qualcosa di adulto. Dai tessuti adulti possiamo isolare delle cellule che in vitro fanno self-renew. Possiamo togliere poi i fattori di crescita, metterla in condizione di differenziamento e vedere cosa succede sia in vitro che in vivo. In questo modo sono state isolate una serie di cell staminali: ad esempio dal tessuto adiposo, dal sangue ecc.

Sistema staminale delle cellule del tessuto ematopoietico

Sono state isolate dal midollo rosso delle cellule che non si sapevano coltivare in vitro, quindi venivano coltivate in vivo e le trapiantavano nei topi. Nella milza del topo queste cellule creavano delle colonie. Loro fecero uno studio per capire se queste colonie erano dei cloni delle cellule. Dopo varie dimostrazioni essi hanno capito che tutte queste colonie erano tutte cellule che derivavano da cellule madri che potevano essere ritrapiantate.

Dopo un bel po di anni, si scoprì che in questo sistema c'era una vera e propria cellula che ricreava l'intero tessuto ematopoietico di un organismo: Long term HSC stem cell. C'è un set di molecole espresso solo da questa cellula. Questa cellula da prigenie a una short term HSC stem cell che si divide poco, ma se viene trapiantata ripopola il sistema solo per un po'. Da questa stem cell vengono fuori altri progenitori multipotenti che danno origine ai diversi lineage che costituiscono il sangue. Questi danno origine ai commited precursor. Abbiamo quindi una perdita di potenziale mano a mano che andiamo nel differenziamento.

Mantenimento delle cellule staminali

Queste cellule come fanno a essere staminali? Ci devono essere dei segnali che regolano l'attività di queste cellule. Queste cellule si trovano in delle nicchie e quindi ricevono dei segnali che dipendono dalla progenie della cellula stessa. Un caso reale e molto studiato è il testicolo di Drosophila. È un tubo a fondo cieco al termine del quale abbiamo le Hub cell che fanno da aggancio alle cell staminali. Le cell staminali degli spermatozoi si trovano agganciate e danno origine agli spermatogoni che iniziano a proliferare dando origine a cellule mitotiche. Si formano degli spermatociti. Tutto questo lo possiamo seguire in modo molto lineare.

Vediamo quindi un grumo di cell (hub cell) e le staminali sono agganciate a queste hub cell in modo simmetrico o asimmetrico. I gonioblasti (GB) sono progenitori intermedi cioè cellule che si dividono ancora e le loro cellule figlie danno origine a dei cloni. Il GB si divide e da origine a cisti che contengono spermatogoni e spermatociti che faranno la meiosi. Il marcatore Vasa e E-Cad: c'è un rapporto di giunzioni aderenti tra le GB e le Hub. Il fatto che la stem cell è l'unica ad avere questo contatto ha un significato funzionale. Le cell più avanti nel lineage esprimono il gene chiamato Bam. Prendono quindi una via differenziativa. Un altro elemento che ci aiuta ad immaginare la via di differenziamento è l'esperimento in cui sono state eliminate le cellule staminali dei gonioblasti. Se le elimino in modo selettivo creo un vuoto quindi nessuno è attaccato al lab.

The hair cycle

La matrice generativa che produce il pelo dopo vari cicli tende a spegnersi. Il pelo cade ma altri ne ricrescono. Nel topo, nelle prime fasi dello sviluppo, la crescita dei peli è molto coordinata, ci sono momenti di crescita chiamati Anagen, momenti di distruzione chiamati Catagen e un periodo di riposo chiamato Telogen, dopodiché riparte la fase di crescita. Che cosa produce l'accensione di questo sistema? C'è un cellula madre che da origine a dei progenitori intermedi che ad un certo punto si spengono. La cellula staminale rimane sempre attiva e fa ripartire il nuovo pelo mettendo in piedi un sistema di sviluppo.

Le cellule staminali si trovano al lato del pelo sotto le ghiandole sebacee. In questa zona troviamo un piccolo bulge (grumi di cellule). Questi grumi di cellule sono il punto in cui si trovano le cellule staminali. Alla base del pelo c'è una papilla dermica. Inoltre sono presenti strati di cellule (in mezzo alla quale troviamo anche i melanociti) che proliferano e producono le cellule che costruiranno il pelo. Questa è una matrice germinativa. Le cellule del bulge sono state identificate e contengono anche cheratina e integrine.

Sistema tet-off

Questo è un sistema con la quale venne creato un transgenico all'interno del quale vi è un promotore che porta alla produzione di un trans-attivatore (molecola capace di regolare la trascrizione). Nel sistema tet-off questo trans-attivatore si lega al suo elemento 3 e blocca la traduzione di un gene. Il gene reporter Lac-Z è un gene che permette lo “spegnimento” di quest'ultimo. Mettendo, infatti, il gene insieme a un repressore del gene stesso studio un sistema per lasciarlo spento. Questo repressore voglio poterlo modulare. Per fare questo, il repressore è in grado di legare la tetraciclina, ne provoca il distacco dal suo elemento 3 (parte di DNA che viene legata) e il mio gene reporter comincia ad essere espresso: abbiamo quindi messo un promotore CMW.

Per fare questo transgene che ci interessa è stato preso un promotore specifico: cheratina 5 (K5). Questo inibisce l'espressione del repressore che va a legarsi all'elemento 3 inibendo l'espressione del gene H2B (istone)-GFP. Quando do la doxiciclina le cellule dell'epitelio esprimono tutte K5. Quindi se non do doxociclina i nuclei saranno verdi. Quando ho la doxociclina l'espressione della GFP viene interrotta ma non immediatamente. Tutto dipende dalla velocità di divisione. Se ho un nucleo verde e lo faccio dividere, il verde si diluirà perché ha molto meno istone. Dopodiché si dividerà ancora ma ad un certo punto dopo un tot di divisioni i nuclei diventeranno bianchi.

Come faccio a non avere la diluizione? Devo fare una modificazione genetica a livello del nucleo del marcatore cosicché tutte le cellule figlie continuino ad esprimerlo. La cellula staminali si divide poco e all'inizio del sistema rigenerativo. Quasi tutte le cellule, quando parte la formazione del pelo (P29), si dividono ma solo per un attimo e poi non si dividono più lasciando i progenitori intermedi a produrre il pelo, questi progenitori non sono self-renew, ma vivono solo per poco tempo fino a che questa matrice di progenitori intermedi si esaurisce e muore. Con il Catagen i progenitori si esauriscono e smettono di produrre cellule indifferenziate. La nicchia all'interno del quale sono contenute le stem cell sono in contatto la papilla dermica. Ci sono inoltre delle cellule a stretto contatto (congiunzioni aderenti). In questo caso le cellule staminali sono colorate in rosa. Nell'immagine si vede la sezione di un bulbo in telogen e la parte verde sono le cellule figlie delle cellule staminali ma che non sono staminali e ne modulano la quiescenza e impediscono alle cellule staminali di proliferare grazie alla produzione delle molecole FGF. Ci possono essere poi elementi che cercano di superare la quiescenza. Dall'esterno arrivano diversi tipi di segnali. La papilla dermica è uno degli elementi determinanti che produce gli inibitori delle BMP e attivatori della via di WNT e dà il via alla proliferazione. La telogen-anogen-transition è la fase in cui si ritorna alla formazione del pelo.

Cellule staminali neuronali in vitro

In un'esperienza sono state messe cellule di cervello in coltura che hanno fatto ottenere cellule, che in vitro sono capace di fare self-renew e se tolgo i fattori di crescita danno:

• Astrociti
• Neuroni
• Oligodendrociti

Queste le chiamiamo cellule staminali neuronali in un cervello adulto.

A-P specification and neuronal induction

(specificazione dell'asse antero posteriore) - Queste fasi sono determinate da varie popolazioni cellulari che hanno come caratteristica il fatto che il loro destino si restringa. Si parte dalla blastocisti dove troveremo un inter cell mass che conti...