Biologia dello sviluppo

Lezione 1

Testi di riferimento

• Lewin et al. - Cellule - Zanichelli
• Gilbert et al. - Biologia dello sviluppo - Zanichelli
• Slack JMW - Fondamenti di biologia dello sviluppo - Zanichelli
• Purves WK, Sadava D, Orians GH, Heller HC - La biologia dello sviluppo ed i processi evolutivi - Zanichelli

Di cosa parleremo in questo corso?

La biologia cellulare studia fondamentalmente la struttura della cellula, come è formata dal punto di vista morfologico una cellula e come questa funziona. Quindi si avvale fondamentalmente di strumenti di biologia molecolare. Perché la biologia molecolare non è uno studio, ma è uno strumento per studiare la biologia cellulare, non è il contrario.

Anche se l'impostazione, come vi dicevo, è ormai quella che i biologi molecolari; siccome prima si studiava la biologia molecolare in maniera demodé c'è la citologia, l'immunologia senza andare a vedere quali erano i processi alla base, poi c'è stato l'avvento della genetica prima e poi della biologia molecolare dopo e poi della biochimica.

Queste tre materie, che sono diventate i "geni", si sono appropriate dello studio della biologia cellulare; tanto è vero che se voi andate a vedere i programmi stessi di biochimica, di biologia molecolare ecc... sembra la biologia cellulare riprodotta in chiave molecolare. La biochimica, la biologia molecolare e la genetica sono degli strumenti per studiare la biologia cellulare! La visione d'insieme ce l'ha il biologo cellulare, perché conosce più sistemi. La conoscenza generale poi ci aiuta anche nella biologia dello sviluppo e la biologia dello sviluppo ci aiuta nella biologia cellulare e ci aiuta nella ricostruzione/rigenerazione dei tessuti, nello studio del tumore.

Il tumore è una cellula indifferenziata, una cellula che è tornata indietro proprio come deve succedere nella rigenerazione; nella rigenerazione delle cellule o perché sono staminali o perché devono tornare indietro e devono passare in uno step trans-differenziamento per differenziarsi. In pratica ritornano all'utilizzo di programma embrionale e così fondamentalmente per certi versi fa la cellula tumorale. Sulla biologia dello sviluppo tocca anche le cellule tumorali.

Cosa è la biologia dello sviluppo?

La biologia dello sviluppo studia fondamentalmente i processi morfologici, biochimici, biomolecolari e genetici che sono alla base dell'evoluzione della forma. La genetica dello sviluppo studia come un gene interviene nello sviluppo. La biologia dello sviluppo studia come un gene, una molecola, quali sono tutti gli approcci, cosa succede prima, dopo e cosa induce tutta la serie di processi, vi dà una visione a 360 gradi e non puntiforme.

Questa è la biologia dello sviluppo cioè partire da una cellula omozigote ed andare a vedere quali sono le motivazioni varie che la portano a diventare un individuo con i suoi organi, tessuti e dopo, ancora, andare a studiare come si possono rigenerare questi organi e tessuti.

Una branca della biologia molecolare è la Proteomica. La Proteomica è qualcosa che sta al confine tra un biochimico e il biologo molecolare. La biologia molecolare è nata in America nel 1980 con il famoso libro di Watson "Biologia molecolare del gene". La biologia molecolare è esplosa tra gli anni ‘90 e 2000, i biologi molecolari si sono impadroniti dell'evoluzione del genoma.

Il biologo dello sviluppo o biologo cellulare, sono molto vicini nelle cose, in pratica ha usato gli strumenti della genetica e della biologia molecolare e della biochimica per spiegare tutto. Quali sono i modelli oggi utilizzati? Siccome fondamentalmente l'ontogenesi ricapitola la filogenesi, vale a dire che lo sviluppo embrionale nelle varie parti grazie l'accensione dei geni omeobox; in pratica ricapitola quello che era l'evoluzione.

Se ci pensate l'embrione umano a 3 settimane di gestazione è un verme che poi assomiglia un po' ad un pesce e poi comincia ad assomigliare ad un vertebrato tetrapode vero e proprio. Fondamentalmente lo vediamo anche nella nostra specie e proprio per questa ragione andare a studiare come i geni omeobox intervengono in tantissimi processi.

Noi ci siamo evoluti dai policheti tubicoli. Infatti dai policheti tubicoli abbiamo i policheti erranti, i quali hanno colonizzato la terraferma e sono diventati oligocheti. Dagli oligocheti si sono avuti i primi crostacei, tipi di artropodi e dall'altra parte si sono evoluti aracnidi. Stiamo parlando di 700 milioni di anni fa di evoluzione.

Sistemi di numerazione genetica

Il sistema che si sono inventati i policheti è davvero ingegnoso per numerare i metameri; ad esempio sono un animale metamerico (anellide), se ogni metamero ha una "bandierina", quel metamero in tutto quel segmento da dorso a ventre ogni cellula avrà la bandierina del rispettivo metamero e si comporterà come il metamero vuole. Se questo è un gruppo di metameri dove si forma il cuore, non si potrà formare più a valle perché c'è tutta un'evoluzione di quel metamero e basta.

Questo significa che tutti i metameri sono controllati da geni omeobox che sono simili, forse si sono modificati in quanti ci sono altri geni omeobox che si accendono successivamente, ma all'inizio quei metameri che erano quelli dei policheti, sono fondamentalmente controllati dallo stesso gene omeobox e siccome tutti deriviamo dai policheti, sia le Drosophile che noi abbiamo almeno per una certa parte gli stessi geni omeobox. Quindi squadra che vince non si cambia!!!, perché deriva tutto dall'evoluzione e siccome andava bene questo sistema di numerazione dei geni omeobox è stato mantenuto semplicemente.

NB: Andare a vedere come sono fatti i policheti e gli Anellidi nel libro di Zoologia. I policheti hanno un sistema circolatorio ribaltato, i... hanno un sistema circolatorio pulsante e il sistema nervoso ventrale, proprio il contrario di come siamo noi. Ci sono alcuni policheti che hanno parti pulsanti, ma ci sono dei molluschi che hanno un cuore vero e proprio non presentano un pericardio ma qualcosa di simile.

È interessante perché andando a vedere come certe cellule si sono sviluppate, si sono collegate, sotto quali geni omeobox sono controllati e in quali metameri stanno possiamo andare a scoprire tante patologie. Per esempio molte delle patologie neonatali si potrebbero spiegare e confrontare con i geni omeobox, in un futuro sarà possibile intervenire in tempo nel feto se si vede che c'è una cosa che non sta funzionando in modo corretto, ad esempio aggiungendo dei fattori di trascrizione che gli fanno "costruire" un cuore sano o un organo sano. Ciò sarà possibile ed è tutto automatizzato.

Organismi modello

Questi sono gli organismi utilizzati come modelli e sono conosciuti completamente dal punto di vista del genoma, cioè di tutto l'insieme dei geni. Una cellula contiene 2 metri di DNA e tutti questi due metri di DNA sono stati sequenziali. I geni sono parti del genoma. Oltre a questi organismi modelli poi si sono associati altre specie di cui sono conosciute completamente genomicamente tra cui: Spigola, Ceracanto, Protoptipus (Dipnoo polmonato progenitore degli anfibi) e via dicendo.

I più utilizzati in laboratorio sono: Mouse, Pesce Zebra, Drosophila Melanogaster, Homo Sapiens, C. Elegans, Xenopus, Pollo. Storicamente quelli usati sono gli Echinodermi e l'Anfiosso ma tutt'ora comunque usati in laboratorio. Infatti in laboratori a Napoli sono presenti due Anfiossi, fanno esperimenti su di essi. Anche lo Xenopus sta scemando come modello.

Perché utilizzare questi modelli?

Ovviamente l'economicità fa da padrone, la semplicità. Perché zebrafish è tanto utilizzato? Perché è un vertebrato, essendo un vertebrato avendo studiato anatomia comparata sappiamo che un pesce avrà quasi tutto quello che avrà un mammifero fondamentalmente. Quindi studiare su un pesce vuol dire avere la storia più semplice rispetto alla Drosophila.

Poi ha un ciclo riproduttivo, specialmente la zebrafish, molto veloce, infatti è adulto già ad 8/9 mesi mentre la spigola è adulta dopo un anno e mezzo o altri pesci dopo due anni. Ad un anno la zebrafish è nel pieno della sua maturità, quindi quanto un topo, ciò ci consente di avere cicli molto veloci. Io ho delle zebrafish che sono transgenici nell'arco di un paio di anni ho una progenie notevole ed avere tanti mutanti.

Altra caratteristica è che la zebrafish è trasparente, è vero che presenta dei cromatofori però è anche vero che trattandolo con un inibitore del passaggio della tirosina sui cromatofori, questi non diventano metanizzati ma rimangono trasparenti si blocca il passaggio della tirosina sulla melanina e si conseguenza questi sono trasparenti; perciò si possono studiare tutti i processi di morfogenesi senza uccidere il pesce, inoltre se ho dei marcatori fluorescenti io posso andare a vedere il tutto.

Per esempio, se io faccio dei transgenici, sappiamo che il pesce ha uno sviluppo esterno, ha una "cellulona" iniziale che è il tuorlo, su questa "cellulona" io posso iniettare quello che voglio, posso iniettare morfolino o fare la crispatamen ed ottenere dei mutanti che hanno l'espressione di certi geni quando si differenziano, per esempio legando il gene che io ho inserito con la GFP e quindi quando questo si esprime il gene si colora di fluorescenza.

Lo zebrafish è il modello più utilizzato per la medicina traslazionale, cioè traslare vuol dire tradurre. Per cui cosa vuol dire medicina tradizionale? Significa che io studio quali sono i processi molecolari/generali delle forma o della patologia e poi andare a vedere comparandoli con quello che succede in un mammifero, anche nell'uomo, e vedere cosa cambia nell'espressione. Per esempio, se vado a studiare il cuore scopro che alcuni microRNA sono fondamentali per il controllo dell'espressione di determinate proteine e poi vedo se quello che succede nel pesce succede anche nel mammifero e se c'è la stessa induzione, io intanto ho imparato tutti i processi sul pesce, e quindi poi devo sacrificare molti meno animali che mammiferi e anche per capire i processi quindi velocizzo; questa si chiama velocità traslazionale.

A Milano, c'è un dipartimento che si chiama medicina traslazione biotecnologica. Il biologo dello sviluppo è un biologo che parte dalla cellula, cioè il biologo dello sviluppo sa tutto di tutto e per cui deve sapere di genetica, di botanica, di biologia molecolare, di fisiologia ecc... la biologia dello sviluppo si occupa anche della biologia dello sviluppo vegetale, della biologia dello sviluppo animale. Tutte partono dalla cellula, cioè della sua staminalità/potenzialità, infatti staminale vuol dire potenziale; quindi anche degli organismi anche unicellulari.

La biologia molecolare è sinergica alla biologia dello sviluppo, sicché nella conoscenza dei meccanismi che ci sono alla base del cambiamento della forma anche di un eucariota unicellulare sta per esempio nella conoscenza del biologo dello sviluppo oppure la relazione tra sessualità ed evoluzione è materia del biologo dello sviluppo. La potenzialità ovvero la staminalità, è la potenzialità di costruire un organismo a partire da una cellula o differenziare anche un organismo unicellulare a partire da una cellula.

Le cellule staminali sono dotate di una potenzialità, cioè la capacità di differenziarsi in diverse forme. Le cellule staminali sono cellule primitive, non specializzate, dotate della capacità di trasformarsi in diversi altri tipi di cellule del corpo attraverso un processo denominato differenziamento cellulare sono oggetto di studio da parte dei ricercatori per curare determinate malattie, sfruttando la loro duttilità (embrionali, fetali, staminali adulte, tumorali).

Per esempio una cellula epiteliale/basale può diventare epitelio o pelo o ghiandole o ghiandola sebacea o ghiandola sudoripara, presenta una potenzialità. Questo significa che c'è un gruppo di geni che è "sensibile" alla trascrizione e un gruppo di geni che non sensibile alla trascrizione ma è un numero minore. Comunque più è staminale, cioè più può fare organi e tessuti o diventare qualunque altra cosa; quindi la potenzialità è grande la cellula più il genoma è poco metilato e poco bloccato.

Noi avremo vari livelli di staminalità e vari livelli di potenzialità, in base a quanto il genoma è bloccato cioè diventa in forma eterocromatica.

Cosa vuol dire cromatina?

DNA + proteine. Vedremo che i nucleosomi sono fondamentali per la regolazione del DNA stesso, in quanto hanno dei domini che escono dalla molecola che sono importanti per l'attacco di enzimi e per il riconoscimento di alcune proteine. L'eterocromatina è fondamentalmente una cromatina metilata, cioè che ha una forma di metilazione. La staminalità deriva proprio dalla capacità del nucleo e per cui della cromatina di essere attiva o attivabile.

Lezione 2

Le cellule staminali sono cellule con vari gradi di staminalità, la staminalità la possiamo vedere sotto forma di potenza, cioè di potenzialità di differenziamento che presenta una cellula. Quindi noi avremo le cellule staminali embrionali, che poi possono perdere la staminalità man mano che l'embrione va verso il differenziamento degli organi, diciamo che le cellule embrionali sono quelle più staminali di tutte quante.

Qual è la principale? La più staminale di tutte quante? Sicuramente i primi quattro blastomeri, essi sono al massimo della loro potenzialità. Perché nei Deuterosomi, i primi quattro blastomeri che hanno la divisione meridiana-meridiana ortogonale tra loro danno quattro blastomeri che se voi li separare con la tripsina e li mettete a sviluppare... nel caso di un mammifero prendete i quattro blastomeri li mettete separati e poi l'impiantate in quattro topoline o quattro donne otterrete quattro embrioni diversi, perché quelle cellule poi proliferano formeranno il trofoblasto e tutto quanto e si divideranno.

I primi quattro blastomeri, anche se vi ricordate nei mammiferi c'è la segmentazione rotazionale anche se qui i blastomeri sono girati nonostante questo sono ancora in grado di avere il massimo della potenzialità, in quanto questo è il principio chiave di tutti quelli che sono i Deuterosomi: i primi 4 blastomeri sono identici sempre e comunque, quello che fa la differenza nei mammiferi che essendo la segmentazione rotazionale, quindi la seconda segmentazione dei primi due blastomeri è girata quei due blastomeri proprio perché sono girati si comporteranno in maniera diversa rispetto a quegli altri due normali proprio perché la seconda divisione è meridiana, ma in realtà se li separate tutti hanno il massimo della potenzialità.

Questo direi che è la staminalità pura in quanto in quei blastomeri lì il genoma dello zigote non ha nessuna metilazione. Ma se io per esempio vado a prendere una cellula basale dell'adulto anche questa staminale perché quella continua a dividersi e solo una parte va in differenziamento, la parte basale quella che è legata alla lamina basale rimane sempre staminale anche se è limitata perché quella è una cellula basale dell'epidermide può dare tutto quello che sono i componenti dell'epidermide e le ghiandole sudoripare e sebacee volendo se stimolate adeguatamente.

Quindi la staminalità a diversi livelli di potenzialità che dipendono dal grado di differenziamento della cellula staminale e con la parola differenziamento cominciate a capire che vi è una restrizione di espressione genica. Quindi che vuol dire che noi abbiamo una vasta gamma di cellule a disposizione e sono quelle cellule che hanno una restrizione più o meno ampia dell'espressione, più c'è l'hanno ampia più sono staminali e più c'è l'hanno ristretta e più non sono staminali.

Allora noi lavorando per esempio sulle cellule tumorali, le cellule tumorali hanno una particolarità sono ritornate in un certo senso indietro, cioè dal differenziamento si sono sdifferenziate e vivono in uno stato sdifferenziamento perché una delle caratteristiche delle cellule staminali è la mitosi. Una cellula staminale è staminale fino a quando lei continua a dividersi e non si differenzia mai.

Possiamo avere diversi casi, cioè possiamo avere il caso della cellula staminale che si divide e che una resta staminale e l'altra va in differenziamento oppure che una cellula staminale si divide ed entrambi sono ancora staminali. Comunque sia almeno una delle due cellule originatesi rimane staminale e allora ciò è l'indice della staminalità. Una cellula tumorale fondamentalmente si comporta come una cellula staminale perché non si differenzia e rimane in uno stato di differenziamento e anzi continua a dividersi, proprio come fa una cellula staminale; ecco perché le cellule tumorali possono diventare un modello per il biologo dello sviluppo, cioè le cellule staminali insieme alle cellule tumorali possono essere dei modelli in vitro per lo studio di certi processi.

Perciò noi abbiamo modelli animali e modelli cellulari, i modelli cellulari possono essere tessuti embrionali, tessuti particolari che possono sdifferenziarsi e ridifferenziarsi e soprattutto cellule tumorali. Nel momento in cui noi riusciamo a stabilire un differenziamento di una cellula tumorale, oltre a aver trovato la "medicina" per bloccarla...