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FORMAZIONE DEGLI ASSI EMBRIONALI
FORMAZIONE DELL'ASSE DORSO-VENTRALE (*):
Uovo di Xenopus La gastrula presenta il labbro dorsale del blastoporo (che determina il futuro lato dorsale) dal quale iniziano ad entrare le cellule per involuzione.
Il futuro lato dorsale si forma sul lato opposto al sito di penetrazione dello spermatozoo (sarà il polo ventrale) come risultato di ridistribuzione di fattori materni dorsalizzanti:
Spermatozoo feconda la cellula uovo delle proteine si spostano scivolando e si dispongono di fronte al punto di penetrazione dello spermatozoo secernono un segnale per dire che questa sarà la regione dorsale: fattore dorsalizzante Proteine del WNT pathway regione, si sviluppa nella parte più anteriore un'altra l'organizzatore Da questa regione importante della gastrula: di nel futuro lato dorso/ventrale dell'embrione. Spemann (posizionato sopra il labbro dorsale del blastoporo)
NB.: Questi passaggi appena
descritti avvengono nello stadio di blastula, alla fine della segmentazione per preparare tutti gli eventi di gastrulazione durante il quale le cellule devono entrare dal labbro dorsale del blastoporo.
Esperimenti di Spemann: ("facendo Preso un embrione di Xenopus allo stadio di 4 cellule e diviso a metà un nodo con un capello"): → Una metà conteneva il punto di ingresso dello spermatozoo polo ventrale → Una metà che darà origine al polo dorsale
Questo consente la progressione dello sviluppo: • →Polo ventrale embrione amorfo, senza ventre • →Polo dorsale embrione comparabile ad uno normale con prevalenza di territori di origine dorsale
A seconda della porzione di blastula considerata, ci sono dei determinanti citoplasmatici (RNA messaggeri e proteine) che vengono segregati, compartimentalizzati nelle varie porzioni della blastula e danno diversi destini cellulari (destino ventrale e dorsale). Tutto è regolato da
accensione/spegnimento di specifici pathway.→ PATHWAY DELLA FAMIGLIA WNT nell'ambiente extracellulare
Le proteine della famiglia WNT sono glicoproteine secrete che attivano molti processi cellulari e di sviluppo.
Nell'evoluzione, le proteine WNT sono altamente conservate in tutti i Metazoi. Nei Mammiferi, la complessità del segnale è ottenuta con 19 ligandi WNT (devono incontrare un recettore per far partire la cascata).
I ligandi di WNT sono proteine ricche di cisteine di circa 350-400 aa con un dominio N-terminale glicosilato per la secrezione.
In aggiunta alla glicosilazione, le proteine WNT, a livello post traduzionale, vengono palmitolate.
Le proteine WNT possono agire con interazioni a breve o lunga distanza unendosi con particelle lipoproteiche per il trafficking intracellulare.
NB.: Più la via di segnalazione è mantenuta identica anche a livello evolutivo (già presente negli anfibi, ecc.).
funzionante,→mantenuta) semplicemente cambiando il ligando (19 diversi) che agisce sulla via, rendendolo più specifico, si rende→la via modulata finemente si agisce sulla variabilità.I recettori (a cui si legano i ligandi) che attivano la via sono di due tipi diversi:
- →Recettori frizzled proteine transmembrana;nell’adulto) e (attivo durante l’embriogenesi, codificato e portato in
- →Recettori LRP LRP5 (attivo LRP6dell’organismo),membrana durante lo stadio embrionale proteine transmembrana.
La palmitolazione di WNT serve per il legame con i recettori.β-cateninaA. Nello stato inattivo la viene sequestrata dal complesso di proteine Axin e APC.La β-cat viene fosforilata da GSK3 e CKI (2 chinasi) in sequenza su varie serine e smaschera siti di legame perβ-Trcpuna E3-ubiquitina-ligasi che la ubiquitina e la degrada nel proteasoma.β-cateninaIn questo modo la non può agire da fattore trascrizionale, entrare nel
β-catenina quando defosforilata da una fosfatasi è libera e può andare ad agire.
NB.: Il processo è altamente dinamico perché una via di segnalazione deve essere accesa/spenta molto rapidamente, quindi deve essere modulata in maniera efficace. Più sistemi di controllo, più il sistema funziona bene.
B. Il legame di WNT con i recettori LRP5/6 e Frizzled (che hanno dimerizzato) attiva il reclutamento di Dishvelled e β-catenina.
La fosforilazione di LRP6 da parte di GSK3 e il reclutamento di Axin che non legherà più la β-catenina.
La β-catenina non più sequestrata dal complesso di Axin, si accumula nel citoplasma, trasloca nel nucleo e attiva i geni responsivi di WNT = TCF.
Inibitori di WNT:
o Molte molecole servono per modulare il pathway di WNT chiamate Secreted-Frizzled-related proteins (SFRP) e WNT inhibitory factors (WIF) che si legano sia a WNT che a Frizzled inibendo la
Trasduzione del segnale:
- Proteine della famiglia Dikkopf (DKK) e WISE/SOST che si legano al recettore LRP5/6 e lo distruggono.
- Proteine della famiglia Shisa agiscono sul recettore Frizzled sequestrandolo nel reticolo endoplasmatico non facendolo traslocare in membrana.
Attivatori di WNT:
Esistono anche molecole attivatori di WNT come le proteine che interagiscono con LRP5/6 e Frizzled e le proteine Norrin (simil-ligando di WNT) che interagiscono con Frizzled4.
Targets di WNT:
I fattori trascrizionali della famiglia TCF/LEF sono i partners β-cat principali della nucleare. L'espressione I TCF reprimono genica interagendo con il repressore Groucho (TLE1 in uomo), che promuove acetilazione istonica e compattazione della cromatina. TCF/β-cat Il complesso sposta Groucho e attiva la trascrizione genica. → traslocazione nucleare e attivazione dei geni responsivi al pathway regolati da TCF/LEF che solitamente è mantenuto in forma repressa da regolatori, anche epigenetici.
dellacromatina.β catenina legandosi al TCF permette l’espressione dei geniLaresponsivi al pathway di WNT.Patologie umane associate a mutazioni nel pathway di WNT β-catenina…i difetti possono essere gain/lossSono presenti mutati alcuni ligandi WNT, alcuni recettori, sequestratori,sono molto diverse tra loro perché l’organizzatore è usato inof function, over-espressione ecc. Anche le patologiemoltissimi processi di sviluppo.
Sindrome di Cornelia de Lange:
➢ Malattia genetica multisistemica. ▪ Incidenza 1 su 10.000/50.000(sopracciglia molto unite…)
➢ Dismorfismi facciali ▪ No differenza di sesso etnia
➢ Difetti agli arti superiori/inferiori ▪ Mutazioni sporadiche per lo più
➢ Ritardo mentale
➢ Difetti cardiaci e gastro-intestinali
Le mutazioni sporadiche sono a carico di geni diversi, il più frequentemente mutato è il gene→NIPBL (chr5) (50-70% dei casi) mutazione autosomica dominante.
Altri due geni
- Morfologia alterata rispetto al controllo: più piccolo, con SN formato male, difetti nei muscoli e nella coda;
- Analisi di espressione in un embrione wild type per capire dove è espresso il gene SN, testa, coda;
- Morte cellulare (saggio di Tunel, colora le cellule con DNA rotto, sintomo di apoptosi) o proliferazione embrioni iniettati con MO presentano apoptosi soprattutto nella regione della testa e un po' nella coda (NIPBL). No difetti di proliferazione o iper-proliferazione.
- Marcatori delle varie regioni del SN no alterazioni tra controlli e morfanti. Unico pathway alterato è quello di WNT.
- Usato un metodo chimico (somministrazione di litio cloruro agonista) per riattivare il pathway di WNT recupero in modo statisticamente significativo il pathway di WNT. A valle del ligando osservata
l'attivazione della β-cat β-cat→6. e sui ligandi in real-time su Zebrafish e fibroblasti dei pazienti.attivata espressione ridotta e target a valle ciclina B1 riduzione dell'espressione.→ Modello Zebrafish è un buon modello→ Uno dei pathway è quello di WNT che potrebbe essere recuperato farmacologicamente (nel modello, difficile nei pazienti.coinvolti →SEGNALI DORSALIZZANTI VIA DI SEGNALAZIONE DI NODAL:L'azione β-cateninacombinata di Wnt-11, Wnt5a e porta alla formazione di un altro centro noto come il Centro didell'embrione.Nieuwkoop nella regione dorso/ventrale β-cateninaNella regione del polo dorsale le cellule esprimono mentre le cellule adiacenti esprimono il gene VegT(diventeranno l'endoderma poi). l'espressioneLa combinazione dei due geni/segnali attiva di Nodal (e quindi la sua via di segnalazione) che induce il→mesoderma. Inizio determinazione dei foglietti
embrionali.l'induzione l'instaurarsiIl segnale di Nodal (che è il ligando) è importante per del mesoderma e per della SIMMETRIAdell'embrionenei primi stadi di sviluppo dei vertebrati.DESTRA/SINISTRA →Comprende sempre ligandi extracellulari e recettori transmembranasegnalazione intracellulare che segnala a diversi effettori che entrano nelnucleo e attivano la trascrizione di geni specifici.
Nodal è il ligando che si lega a due recettori di tipo diverso: 2 di tipo I e 2di tipo II.Se legati da Nodal i 4 recettori tetramerizzano e vanno ad attivare a livellointracellulare delle proteine SMAD.
SMAD formano un complesso, entrano nel nucleo attraverso i pori nuclearie vanno ad agire da attivatori trascrizionali.
Regolazione fine a più livelli:o Precursore inattivo, attivato da taglio proteolit
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