Biologia cellulare molecolare e genetica

Il nucleolo: organello senza membrana

Le proteine ribosomali vengono sintetizzate nel citoplasma però poi vanno nel nucleolo, dove vengono assemblate insieme agli rRNA per formare i ribosomi. Quindi se noi marcassimo una proteina ribosomale vedremmo ribosomi a livello del citoplasma impegnati nella traduzione di proteine e ribosomi nel nucleolo dove vengono assemblati.

Il nucleolo è un organello senza membrana perché ha una composizione ben definita ma è fisicamente distinto dal resto del nucleoplasma e questo non è dovuto alla presenza di una membrana ma al fatto che questo organello si forma tramite una separazione di fase liquido-liquido.

Il nucleolo è formato da:

• centro fibrillare: ci sono le regioni del DNA che codificano per l'rRNA
• componente fibrillare densa: ci sono le molecole di rRNA precursore che sono sintetizzate partendo dall'informazione contenuta nell'rRNA
• componente granulare

AL MICROSCOPIO APPAIONO...

come catenelle di alberi di natale formati da un tronco centrale rappresentato dall'rRNA e da tanti ramoscelli con dimensioni progressivamente crescenti, rappresentati dai trascritti drRNA nascenti. Al termine di ogni ramoscello c'è un granulo che rappresenta una molecola di RNApolimerasi I che sta sintetizzando una molecola di rRNA. Da un punto di vista strutturale questo albero prende il nome di unità trascrizionale per rRNA e ognuna di essa è separata da quella successiva da una regione detta spaziatore non trascritto una regione di rDNA che NON codifica per l'rRNA ma che fa da spaziatore. Il gene presente in questa regione del DNA contiene l'informazione per sintetizzare 3 rRNA: 18S, 5.8S e 28S. MATURAZIONE DELL'rRNA PRECURSORE L' rRNA viene sintetizzato come precursore che contiene all'interno l'informazione per generare 3 tipi di rRNA. Si genera quindi un unico trascritto primario (pre-rRNA) nel nucleolo e

Capiamo che rRNA 5S ha un precursore diverso e viene sintetizzato al di fuori del nucleolo. Il trascritto primario viene sintetizzato, deve maturare cioè deve subire delle modifiche per eliminare quelle sequenze accessorie non necessarie e di liberare le molecole di rRNA. Avviene prima il taglio delle sequenze all'estremità 5' e 3' generando un precursore intermedio 41S. Successivamente viene liberato il 18S e il taglio può avvenire in due posizioni diverse: 2 o 3. In base a questa posizione, la maturazione avviene con meccanismi diversi. Nel primo caso si liberano 18S, 28S, 5.8S, nel secondo caso si forma un intermedio 32S dal quale verranno, per scissione, liberati 28S e 5.8S. Le tre molecole di rRNA vanno incontro ad ulteriori modifiche, dette post-trascrizionali, per diventare mature e sono catalizzate dalle cosiddette snoRNPs (piccole ribonucleoproteine nucleolari). snoRNA - sono molecole di RNA con una lunghezza che varia dai 60 ai 300 nucleotidi.

• →-svolgono una funzione di editing, ovvero di modificazione dell’RNA si basa su un appaiamento di basisnoRNA ha delle regioni complementari alle molecole di rRNA precursori e questo serve per guidare losnoRNA verso la molecola di rRNA e di reclutare proteine che catalizzeranno le modificazioni post-trascrizionali del rRNA: metilazione del ribosio, deaminazione di basi e addizione di pseudoridine.
• MATURAZIONE DELL’rRNA PRECURSORE
• La maturazione dell’rRNA precursore comprende varie modificazioni come lametilazione di gruppi di circa 100 molecole di ribosio e la conversione di circa 95uridine in pseudouridine. Queste modificazioni avvengono in siti specifici→riconosciuti da molti snoRNA snoRNA per appaiamento di basi si lega ad unpre-rRNA e catalizza la metilazione di un ribosio (per esempio).
• →BASE-PAIRING DUPLEX RNA: RNA A DOPPIO FILAMENTO
• 1. ciascuno snoRNA si lega ad una porzione specifica del pre-rRNA per formare un duplex RNA-DNA
• 2. lo snoRNA legato

giuda poi un enzima, una metilasi o pseudouridilasi, in modo da modificare unospecifico nucleotide nel pre-rRNA. La prima modificazione che avviene è la rimozione dell'estremità 5' del trascritto, reazione catalizzata dal snoRNA U3. Successivamente prendono parte al processo altri due tipi di snoRNA: - snoRNA box C/D o U20: catalizza la metilazione del ribosio, si lega ad una porzione specifica del pre-rRNA per formare un duplex RNA-RNA. Lo snoRNA legato guida una metilasi che metila il ribosio in posizione 2'. - snoRNA box D: contiene la sequenza CUGA che è presente in tutti gli snoRNA che guidano la metilazione del ribosio. - snoRNA box H/ACA o U68: catalizza la pseudouridinazione, si lega ad una porzione specifica del pre-rRNA per formare un duplex RNA-RNA, che porta alla conversione di una uridina in una pseudouridina. Per effettuare questa conversione, avviene una serie di modificazioni che sono catalizzate da dyskerin, un componente.

proteico delle snoRNA. SnoRNA box H/ACA terminano sempre con la sequenza ACA. Ma a cosa servono tutte queste modificazioni post-trascrizionali?

• Proteggere regioni del pre-rRNA dal taglio enzimatico
• Favorire l'avvolgimento dell'rRNA nelle strutture tridimensionali definitive
• Favorire le interazioni dell'rRNA con altre molecole

SINTESI E MATURAZIONE DELL'rRNA 5S

Ricordiamo che le sequenze di DNA sono localizzate in un altro cromosoma e si ritrovano al di fuori del nucleolo e i geni per l'rRNA 5S sono trascritti NON dall'RNA polimerasi I ma dall'RNA polimerasi III! Quest'ultima NON ha un promotore situato al di fuori, ma uno situato all'interno della parte del gene che viene trascritto internal promoter.

Differenza tra promotore interno ed esterno:

- promotore interno: es. nel caso dell'RNA polimerasi II e in particolar modo delle porzioni di DNA che codificano per l'rRNA 5S le regioni promotrici sono all'interno, quindi

A valle dello startpoint-promotore esterno: si trova all'esterno e a monte del sito di inizio (startpoint) della trascrizione. Quindi la sintesi dell'rRNA 5S avviene al di fuori del nucleolo e dopo che è stato sintetizzato, trasloca all'interno del nucleolo dove viene assemblato insieme agli rRNA 28S e 5.8S e alle proteine ribosomali per dare origine ai ribosomi e alle due subunità: 40S e 60S. Quest'ultime, dopo essere state assemblate, verranno trasportate attraverso i complesso del poro nucleare nel citoplasma dove potranno essere rese disponibili per l'assemblaggio dell'80S e quindi la sintesi proteica. Inoltre, come molte altre proteine, quelle ribosomali vengono sintetizzate nel citoplasma e devono essere retrotrasportate all'interno del nucleo, per arrivare al nucleolo, dove si assembleranno con gli rRNA per formare le subunità ribosomali.

SINTESI E MATURAZIONE DI tRNA

I tRNA catalizzano il trasporto dell'aminoacido nel

processo di sintesi delle catene polipeptidiche di nuova sintesi. Il tRNA ha una tipica struttura a trifoglio dovuta all'appaiamento di basi complementari, da un'estremità lega uno specifico aminoacido mentre nell'altra estremità è presente il cosiddetto anticodone, cioè una tripletta, una sequenza costituita da 3 nucleotidi che è complementare al codone che è invece presente nella sequenza dell'mRNA. Ad ogni codone corrisponde un determinato aminoacido. I geni che codificano per i tRNA sono più di 1300 e sono localizzati in vari gruppi o cluster sparsi in tutto il genoma e un cluster tipicamente contiene geni che codificano per vari tipi di tRNA e questi geni sono interrotti da sequenze spaziatrici, presenti ad intervalli irregolari in ripetizione a tandem, vengono tradotti simultaneamente geni che codificano per tRNA. I tRNA, come l'rRNA, viene sintetizzato in una forma "precursore" e quest'ultimodovrà andare incontro ad un processo di maturazione. Innanzitutto i tRNA sono trascritti dall'RNA polimerasi III, che catalizza anche la sintesi dell'rRNA 5S, e il promotore è situato all'interno della sequenza del gene che codifica per il tRNA (come per l'rRNA 5S). Il pre-tRNA può assumere per appaiamento di basi complementari delle strutture secondarie e in alcuni casi sia negli Archea che negli eucarioti può essere presente una sequenza endonica che verrà rimossa per permettere la maturazione dell'tRNA. Il tRNA comunque perde sempre sequenze alle estremità 3' e 5' e solo occasionalmente delle sequenze interne. La maturazione del tRNA richiede l'intervento di specifici enzimi come la ribonucleasi P che rimuove la sequenza leader al 5' permettendo di ottenere una molecola di tRNA attiva. tRNA: STRUTTURA A TRIFOGLIO Il processo di maturazione del tRNA prevede anche la modificazione a carico di singoli

nucleotidi e inoltre, aparte citosina, guanina, adenina e uracile, il tRNA contiene anche pseudouridina, inosina, metilinosina, metilguanosina, diidrouridina, ribotimidina.

SINTESI E MATURAZIONE DEGLI mRNA → Gli mRNA contengono l’informazione per sintetizzare le proteine: RNA polimerasi II apertura doppia elica → del DNA formazione di ibrido RNA-DNA perché l’RNA polimerasi II a livello della bolla di trascrizione comincia a catalizzare la sintesi della molecola di mRNA che progressivamente si allungherà.

TRASCRIZIONE DELL’mRNA E MATURAZIONE Entrambi i processi avvengono nel nucleoplasma dove agisce l'RNA polimerasi II. Essa sintetizza una serie di RNA (hnRNA) detti RNA nucleari eterogenei, alcuni dei quali dopo processamento daranno origine a degli GlimRNA mRNA maturi traslocheranno nel citoplasma, mentre gli hnRNA si trovano solo nel nucleo.

TRASCRIZIONE DELL’mRNA L’RNA polimerasi catalizza la sintesi di un mRNA a partire da

undeterminato sito di inizio della trascrizione. Tuttavia la sequenza del gene che codifica per l'mRNA è preceduta da una sequenza promotore, fondamentale per l'attracco di fattori di trascrizione e della polimerasi stessa e per permettere di collocare la polimerasi vicino al sito di inizio della trascrizione. Quindi l'RNA polimerasi lega il promotore con l'aiuto di una serie di fattori generali di trascrizione (GTF), formando il complesso di preinizio (PIC).

Ci sono diversi tipi di promotori che contengono una regione che si trova tra 24 e 32 basi a monte del sito d'inizio che a sua volta contiene una sequenza consenso (TATA box) estremamente conservata.

ASSEMBLAGGIO DEL COMPLESSO DI PRE-INIZIO O PIC

1. Una proteina detta TATA binding protein (TBP) riconosce il TATA box del promotore
2. Viene poi reclutato il fattore TDB che è una subunità di un complesso proteico chiamato TFIID (fattore di trascrizione per la polimerasi II, frazione D)
3. si legano

al