Biologia cellulare molecolare e genetica

BIOLOGIA CELLULARE E MOLECOLARE

I costituenti degli organismi viventi sono le cellule. Esse hanno dimensioni diverse: un corpo cellulare che

varia dai 10 ai 30 micrometri, mentre gli altri componenti cellulari nell’ordine dei nanometri.

Da un punto di vista storico la scoperta delle cellule è stata attribuita a Robert Hooke, un microscopista

inglese, che analizzò delle fettine di sughero e notò sulle loro superfici dei pori, che non erano altro che le

cellule separate dalle pareti delle cellule vegetali.

Il nome cellula deriva dal fatto che ad Hooke essa ricordava la cella nella quale i monaci dormivano.

Mentre Antonie Van Leenwenhock costruì una lente che gli permetteva di avere una risoluzione in

micrometri e con essa analizzò delle goccioline d’acqua prese da uno stagno e notò la presenza di corpi

brulicanti che non erano altro che microrganismi e batteri.

Si accettò quindi l’idea dell’esistenza di organismi microscopici chiamate cellule e nel 1839 uno zoologo

tedesco, Theodor Schwann formulò i primi due principi della teoria cellulare:

-tutti gli organismi sono composti di una o più cellule

-la cellula è l’unità strutturale della vita

Nel 1855 un patologo tedesco, Ruolf Virchow, formulò, grazie a delle prove, il terzo principio della teoria

cellulare: le cellule possono avere origine solo per divisione di cellule preesistenti.

LE COLTURE CELLULARI

Le cellule possono essere inoltre tenute nelle cosiddette “colture cellulari”, nelle quali cresceranno e si

riprodurranno per lunghi periodi di tempo.

La prima coltura di cellule umane fu ottenuta nel 1951: le cellule furono isolate da un tumore maligno

dell’utero e chiamate HeLa (dal nome della donatrice Henrietta Lacks) e sono ancora oggi utilizzate nei

laboratori di ricerca di tutto il mondo.

Ormai le cellule cresciute in coltura/vitro sono uno strumento indispensabile per i biologi molecolari e

cellulari poiché sono un modello molto semplice sul quale poter fare scoperte scientifiche, infatti:

• è facile ottenerle per dissociazione di tessuti o tumori

• è facile farle riprodurre e crescere

• ogni coltura contiene un solo tipo cellulare e questo permette di studiare in modo specifico le

caratteristiche di quel tipo cellulare (es. posso fare cocolture fra motoneuroni e cellule muscolari,

oppure fra motoneuroni e astrociti, che sono cellule gliali)

• ogni coltura permette di poter studiare bene molte attività cellulari fra le quali la riproduzione e il

differenziamento (cioè è possibile seguire la cellula dallo stato staminale al differenziamento)

• ogni coltura permette anche di studiare in che modo le cellule rispondono ad un trattamento eseguito

con farmaci, ormoni, fattori di crescita e altre sostanze attive.

Le colture però per permettere la crescita cellulare hanno bisogno di mezzi di crescita, contenenti miscele

definite di nutrienti e vitamine insieme a proteine, fattori di crescita, ecc.. I mezzi cellulari quindi

rappresentano un habitat invitante per i microrganismi.

Le cellule devono però essere mantenute in condizioni sterili, attraverso l’uso di guanti, la sterilizzazione

degli strumenti e l’uso di antibiotici per evitare la crescita di batteri.

DMEM

Fu inventato da Renato Dulbecco ed è uno dei terreni di coltura più usati per far crescere in vitro molti tipi

cellulari. Ha una composizione chimica caratterizzata da: acqua, sali ed è privo di endotossine e

amminoacidi. A questo terreno di base vengono aggiunti fattori di crescita contenuti nel siero fetale

bovino, che viene immesso nelle colture cellulari in quantità variabile rispetto al tipo cellulare (5-20%).

SIERO FETALE BOVINO

Il siero fetale bovino è il supplemento più utilizzato per il mantenimento in vitro di colture cellulari di cellule

eucariote.

Si ottiene dal sangue che viene raccolto dal feto di bovine gravide durante il processo di macellazione. Il

sangue raccolto dal feto viene raffreddato tramite una puntura intracardiaca e viene fatto coagulare in un

bagno a 0°C. Successivamente avviene la centrifugazione (separazione di parte cellulare e siero) e il siero

viene aspirato e filtrato per essere reso sterile. Prima di essere imbottigliato viene verificata l’assenza di

endotossine.

Il siero bovino è formato principalmente da una proteina globulare, l’albumina, e da una miscela con

proteine plasmatiche, fattori di crescita e minerali.

I TIPI DI COLTURE CELLULARI

• coltura primaria (deriva dalla dissociazione di un tessuto): il tessuto viene prelevato e può essere

digerito in modo tale da liberare le cellule che lo compongono. Le cellule però interagiscono e sono a

stretto contatto fra loro, quindi i punti di contatto e di adesione fra cellule dovranno essere digeriti

attraverso un enzima proteolitico specifico chiamato tripsina.

Le cellule vengono poste in una fiasca alla quale aderiscono e viene aggiunta la tripsina che digerisce

sia i punti di adesione fra le cellule stesse che quelli fra le cellule e la fiasca. In questo modo si ottiene

una coltura di sospensione che viene poi centrifugata, la tripsina viene rimossa, si aggiunge un terreno

nuovo e infine le cellule vengono divise/”splittate” in varie fiasche. A questo punto esse cominceranno

a riprodursi dando origine ad un’altra coltura chiamata secondaria.

• coltura secondaria: le cellule si ottengono da una fiala di cellule precedentemente coltivate o

congelate.

• linea cellulare: cellule capaci di dividersi un numero “infinito” di volte, anche se in realtà le cellule

vanno incontro ad un processo di senescenza, cioè non possono riprodursi infinitamente perché

invecchiano a causa dell’accorciamento dei telomeri (sequenze di DNA che formano cappucci sulle

estremità dei cromosomi eucariotici e che non hanno geni codificanti per proteine), ovvero perdono

informazioni ad ogni ciclo cellulare. Per ovviare questo problema e rendere le cellule immortalizzate è

possibile attivare la telomerasi, che permette l’allungamento dei telomeri.

COME GENERARE CELLULE IMMORTALI

Vari modi, mediante:

-isolamento di cellule a partire da un tumore, dato che esse si dividono infinitamente avendo perso il

controllo (come nel caso di HeLa Cells)

-introduzione di un gene virale, ad esempio il gene E1 dell’adenovirus che agisce sui sistemi di controllo

del ciclo cellulare, oppure del Simian Virus 40 (SV40) che va a spegnere 2 pathway che regolano la

senescenza cellulare, agendo sul retinoblastoma e sul p53 (fattore di trascrizione coinvolto in apoptosi,

senescenza e regolazione del ciclo cellulare).

-stimolazione della telomerasi che permette l’allungamento dei telomeri, quindi l’immortalità, evitando la

perdita progressiva di informazioni genetiche. L’enzima telomerasi è una trascrittasi inversa e permette di

creare una linea cellulare immortalizzata.

CELLULE IN COLTURA E CELLULE TRATTATE CON TRIPSINA

In coltura le cellule sono le une molto adese alle altre, come un tappeto di corpi traslucidi.

Quando invece viene aggiunta la tripsina, che digerisce i punti di adesione, le cellule diventano più

tondeggianti. Esse verranno messe in sospensione, una piccola parte verrà prelevata ed inserita in una

“cameretta” chiamata “Fuchs-Rosenthal” con l’aggiunta di una sostanza detta Trypan Blue che colora in blu

solo le cellule morte. In questo modo posso contare le cellule traslucide, ovvero vive, e le cellule blu, morte.

Contare le cellule è fondamentale per utilizzare una quantità nota di cellule, come ad es. in coltura per

evitare che le cellule raggiungano la densità massima molto rapidamente.

STEP DEI PROCEDIMENTI DI COLTURE CELLULARI

• scongelamento fiala

• inserimento delle cellule in coltura

• (giorno seguente) analisi al microscopio: se la densità è troppo elevata le cellule verranno

trattate/dissociate con la tripsina

• conteggio delle cellule

• due possibilità: congelarne una parte per il futuro oppure riporle nuovamente in coltura per scopi di

ricerca

PROPRIETA’ FONDAMENTALI DELLE CELLULE

1. Le cellule sono molto complesse ed organizzate. Più complessa è una struttura e maggiore è il numero

di parti che devono trovarsi nella loro precisa posizione e maggiore è il controllo che deve essere esercitato

per il mantenimento del sistema.

Gli organelli hanno inoltre la stessa forma e disposizione in tutti gli individui della stessa specie.

Es. considero una cellula epiteliale dell’intestino: a livello apicale possiede i microvilli apicali che servono

per facilitare l’assorbimento dei nutrienti. Ogni microvillo apicale è sostenuto da una struttura con fasci di

microfilamenti di actina. All’interno delle cellule epiteliali intestinali ci sono i nuclei centrali e nella regione

basale molti mitocondri. Essi sono organelli formati da 3 creste, nelle quali svolgono la loro funzione

principale che è quella di sintetizzare l’ ATP mediante respirazione cellulare o catena di trasporto degli

elettroni e da una doppia membrana: una esterna e una interna.

Sono molto simili di specie in specie, infatti molti processi fondamentali per la vita di una cellula, come ad

esempio la sintesi di proteine, avvengono in ogni organismo in modo simile (in modo conservato),

permettendo così lo studio di molte patologie umane.

Inoltre le cellule hanno fra loro morfologie molto complesse in base alle funzioni che devono svolgere:

hanno, in generale, un corpo cellulare di grandezza compresa fra 10 e 30 micron, però la dimensione

globale della cellula può essere molto diversa. Ad esempio il motoneurone ha un corpo cellulare piccolo ma

l’assone che innerva il muscolo può essere lungo svariati metri.

Infatti esempi di cellule molto complesse sono il neurone corticale e il neurone di una cellula di Purkinjie,

famoso per la sua arborizzazione dendritica. Invece il neurone corticale possiede un corpo cellulare che è

collegato ad un assone molto lungo, dal quale si estendono i dendriti. A livello dei dendriti ci sono le spine

dendritiche che sono caratterizzate da un’elevata plasticità, perché non sono rigide e immobili ma vanno

incontro a formazione ed eliminazione. Questo fattore dipende però dall’attività neuronale, quindi la

morfologia è complessa ma può subire delle modifiche in base all’attività cerebrale.

2. Le cellule possiedono un programma genetico e i mezzi per utilizzarlo

L’informazione genetica nelle nostre cellule è costituita dalle cellule del DNA, a loro volta formate dai

nucleotidi (adenina, timina, guanina, e citosina). Triplette di nucleotidi danno origine al cosiddetto codice

di lettura e ad un amminoacido, ovvero ogni tripletta dal DNA viene convertita in una molecola di mRNA

(che corrisponde ad un amminoacido) e l’mRNA viene convertito in proteina con il processo di traduzione.

3. Le cellule sono capaci di riprodursi

Da una cellula madre, per divisione cellulare (simmetrica), si formano due cellule figlie che sono

generalmente identiche. La cellula madre va incontro ad una duplicazione degli organelli e ad una

replicazione del materiale genetico che viene redistribuito in maniere generalmente simmetrica fra le 2

cellule figlie.

Esistono però anche divisioni cellulari asimmetriche, come nel caso degli oociti umani, in cui durante la

prima divisione c’è 1 solo oocita che possiede la maggior parte del citoplasma e forma il primo corpo

polare, oppure come nel caso delle cellule staminali in cui da una per divisione simmetrica si originano 2

cellule staminali, mentre da una divisione asimmetrica si formano una cellula staminale e un’altra che

sarà “committed”, cioè indirizzata, verso il differenziamento e non potrà più tornare allo stadio staminale.

4. Le cellule acquisiscono energia e la utilizzano

La maggiore fonte di energia è presente sotto forma di glucosio che viene riversato dal fegato nel sangue,

grazie al quale arriva a tutte le cellule dell’organismo. Ad esempio nel muscolo viene usato per la

produzione di ATP utile al funzionamento del muscolo scheletrico stesso. Per ricavare ATP però le molecole

di glucosio devono essere scisse e questo può avvenire attraverso 2 processi: glicolisi e respirazione.

La glicolisi parte da 1 molecola di glucosio per produrre poche molecole di ATP, mentre la respirazione, o

catena di trasporto degli elettroni, da 1 molecola di glucosio produce 38 molecole di ATP.

5. Le cellule svolgono una varietà di reazioni chimiche

L’insieme delle reazioni chimiche che avvengono in una cellula prende il nome di metabolismo cellulare.

Queste reazioni prevedono la presenza di enzimi, che aumentano la velocità delle reazioni chimiche e

substrati: ad esempio nel caso delle proteine, quando gli amminoacidi entrano nei siti attivi, l’enzima

→

catalizza la formazione di un legame peptidico fra 2 amminoacidi reazione di condensazione con

liberazione di una molecola d’acqua e rilascio del dipeptide.

Altri esempi di reazioni sono quelle di fosforilazione che possono andare a modificare le attività delle

proteine.

In conclusione la cellula deve essere capace di adattare le proprie reazioni chimiche all’esterno.

6. Le cellule sono impegnate in numerose attività meccaniche

Ad esempio le cellule possono compiere movimento che dipende dal rimaneggiamento del citoscheletro.

Le fasi del movimento cellulare sono le seguenti:

• le cellule aderiscono con sistemi di adesione alla lamina basale e alla matrice extracellulare

• la cellula protrude la propria membrana plasmaticae grazie ai lamellipodi, delle protrusioni, dà origine

ad un nuovo punto di adesione focale

• a questo segue il movimento del corpo cellulare e al sito opposto dell’adesione focale la contrazione e

→

la dissociazione avanzamento della cellula

In generale ogni cellula è composta da protrusioni: ruffle, filopodi e lamellipodi che sono sostenuti da

filamenti di molecole di actina, che polimerizzano e depolimerizzano.

FIGURA A: rappresentazione schematica della

complessità dell’organizzazione del citoscheletro a

ridosso della membrana plasmatica + esempio di

attività di contrazione dei complessi di actomiosina.

FIGURA B: rappresentazione molecolare dei componenti

che regolano l’attività meccanica della cellula. All’interno

della cellula ci sono le molecole di actina che

interagiscono con quelle di miosina che a loro volta

interagiscono con un’altra molecola, in questo caso Talin,

che permette ai filamenti di actomiosina di essere in

contatto con delle proteine integrali di membrana,

chiamate integrine. Le integrine poi a loro volta sono

legate alla matrice extracellulare (ECM).

Grazie a questa catena un segnale meccanico che giunge

dall’esterno della cellula viene trasmesso all’interno. Ma i

filamenti di actina arrivano fino al livello della membrana nucleare dove ci sono i link, complessi che

permettono di legare gli elementi del citoscheletro alle lamine nucleari (formano il nucleoscheletro).

Quindi una pressione o una trazione meccanica potrà essere, in nanosecondi, trasportata nel nucleo ed

essere convertita in un’alterazione dell’organizzazione della cromatina e quindi dell’espressione genica. Si

parla di mechanotransduction.

Quindi le cellule sono coinvolte in attività meccaniche perché sono capaci di muoversi e anche di

rispondere a stimoli meccanici.

7. Le cellule sono capaci di rispondere agli stimoli (che provengono dall’esterno)

Le cellule sono capaci di rispondere agli stimoli perché la loro membrana plasmatica è formata da una serie

di proteine transmembrana che hanno un dominio extracellulare, uno intracellulare e uno o più domini

transmembrana. Si possono organizzare costituendo i recettori che sono associati alle cosiddette proteine

G o costituendo canali ionici e canali per l’acqua, come ad esempio le porine.

Es. recettori + proteina G: un ormone interagisce

con il recettore attivandolo. La proteina G viene at-

tivata ed interagisce con un’altra molecola di mem-

brana, per esempio con l’enzima adenilato ciclasi.

Esso converte l’ATP in cAMP (ciclico AMP). Il cAMP è

un secondo messaggero, ovvero va ad agire su altri

componenti cellulari permettendo di trasferire il se-

gnale dall’esterno all’interno. Quindi mediante que-

sti recettori transmembrana (recettori accoppiati a

proteina G o canali ionici), le cellule sono capaci di

rispondere ad uno stimolo esterno.

Un altro esempio di recettori transmembrana è rappresentato dai recettori tirosin chinasi. Essi inizialmente

sono in forma monomerica inattiva, ma in presenza del ligando i recettori dimerilano e si autofosforilano. I

recettori tirosino-chinasi sono tutti i fattori di crescita, che possono indurre la cellula a stimolare il proprio

metabolismo e la propria crescita.

8. Le cellule sono capaci di auto-regolazione

Le cellule hanno la capacità di auto-regolare le proprie attività metaboliche e di controllare processi com-

plessi come la replicazione del DNA e il ciclo cellulare, mantenendo il cosiddetto “equilibrio basale o omeo-

stasi”. Quest’ultimo è fondamentale perché ad esempio la perdita di controllo del ciclo cellulare porta la

cellula a trasformarsi in una tumorale, con la possibilità di distruggere l’intero organismo.

Esistono vari tipi di omeostasi, come ad esempio:

• omeostasi proteica o proteostasi: capacità della cellula di rilevare la presenza di proteine danneggiate,

di degradarle mantenendo costante la concentrazione proteica e impedendo l’accumulo di proteine

aggregate e danneggiate che potrebbero essere tossiche per la cellula stessa

9. Le cellule evolvono

Alcuni bilioni di anni fa comparve la prima cellula, dalla quale si sono evolute quelle eucariotiche,

procariotiche e gli organismi multicellulari.

Come si è originata la vita e la prima cellula?

Si