Biologia cellulare e molecolare (parte 2 di 2 biochimica cellulare)

Biochimica cellulare

Introduzione all'oncogenesi

Parliamo di tumore come condizione patologica deregolata, e ci servirà per andare a vedere tutte le deregolazioni che avvengono in queste cellule. Quindi, vediamo cosa intendiamo per tumore, di per sé è un concetto astratto, perché con cancro si racchiudono tante malattie, che ricadono in deregolazioni di trasformazione neoplastica a carico di cellule derivabili da tanti tessuti diversi, quindi questo ci fa capire la complessità.

In primo luogo, perché ognuno ha un proprio background genetico personale, ma poi vedremo anche come la perdita del concetto di comunità di un tessuto viene perduta e quindi ovviamente l'accumulo di cellule che non hanno più una regola di vitalità fisiologica, come quindi regolazioni che fanno crescere un tessuto, oppure che permettono a un tessuto di regolarsi in morte e sopravvivenza, quindi in omeostasi.

Ovviamente ci sono tantissime cellule che possono andare incontro a trasformazione tumorale, e il comune denominatore alle cellule trasformate è una capacità di proliferazione autonoma e illimitata, ovviamente questo elemento a comune si arricchisce poi di altri fattori che però sono diversi in base al fatto che la cellula faccia parte a un tessuto o a un altro, quindi la diversa posizione, comportamento e ruolo biologico, quindi questi altri fattori arricchiscono la complessità della patologia e del contesto in cui la malattia evolve.

Condizioni e risposte cellulari

Ci sono condizioni in cui i tessuti crescono in modo importante in seguito a stimoli mitogenici e ci sono anche situazioni ancora non patologiche ma di risposta all'adattamento allo stress che prevedono un aumento iperplastico o ipertrofico delle cellule del tessuto. La caratteristica essenziale è che se è una risposta a uno stress o un adattamento significa che sarà una condizione limitata nel tempo per cui a un certo punto il tessuto torna alle condizioni di omeostasi fisiologica, tornando alla normalità.

Abbiamo una lista delle nomenclature a cui possiamo fare riferimento e a cui faremo riferimento effettivamente. Un aspetto fondamentale è di come ci sia una distinzione tra tumori benigni e maligni e il tratto che distingue queste due caratteristiche è essenzialmente il perdere il confinamento che il tumore primario ha in una sede e acquisire certe caratteristiche che gli permettano di invadere tessuti circostanti per via ematica o linfatica, e quindi non solo acquisire resistenza all'anoikis potendo quindi sopravvivere in sospensione, ma andare anche incontro alla possibilità di ripopolare una sede secondaria.

Questa distinzione è importante perché molte delle de-regolazioni che vedremo sono incentrate proprio intorno a questa caratteristica di sopravvivenza alla perdita dell'adesività e quindi capacità anche invasiva. Molto importante comunque è anche notare che queste definizioni, spesso scolastiche, trovano limiti per lo più in clinica, là dove anche più condizioni diverse le ritroviamo nello stesso tumore per esempio e spesso si parla proprio di un fenotipo estremamente plastico, ovvero un fenotipo che riesce bene ad adattarsi e a essere appunto adattabile all'ambiente che lo circonda.

Eterogeneità e complessità tumorale

Quindi uno degli aspetti importanti è quella che viene detta eterogeneità, sia fenotipica, genetica, e anche di profili molecolari che una cellula può avere all'interno della stessa massa tumorale. Quindi, pensando anche alle difficoltà di trovare una cura per il cancro, questo non deriva solo dal fatto che, come dicevamo, ognuno ha un proprio background genetico, ambientale e quant'altro, ma allo stesso tempo anche all'interno dello stesso tumore abbiamo un'eterogeneità tale che capire che tipo di patologia abbiamo davanti è importante ma non è risolutivo perché ci sono proprietà genetiche, epigenetiche e fenotipiche che possono farci perdere questa estrema eterogeneità.

Le caratteristiche tipiche della trasformazione neoplastica prevedono che ovviamente si parli di cellule di tessuti diversi e quindi anche le proprietà cambiano a seconda proprio dei tessuti di appartenenza. Storicamente le cellule le possiamo dividere in cellule labili, stabili e perenni dove quelle perenni sono tessuti che per definizione non vanno incontro a turnover, ma in qualche modo sappiamo che sotto opportuni stimoli e condizioni invece attivano quella capacità di andare incontro a sostituzione e turnover e ovviamente i tessuti in cui queste trasformazioni sono maggiori sono quei tessuti in cui le cellule sono definibili labili, in continuo rinnovamento, con altissimo turnover per cui ovviamente tanto più questo turnover aumenta e tanto più è probabile andare incontro a trasformazione neoplastica.

Epidemiologia e incidenza dei tumori

Ovviamente questa caratteristica e frequenza di trasformazione maggiore in tessuti labili, in qualche modo si riflette anche nell'epidemiologia dei tumori più diagnosticati annualmente. Sappiamo che il tumore alla mammella è la prima causa di morte nei soggetti femminili, e sappiamo anche che in generale la maggiore incidenza la abbiamo sempre in tessuti con cellule labili con alto turnover. I numeri sono alti e la cosa che fa ben sperare è il fatto che a fronte di una continua crescita di incidenza di tumore negli ultimi anni, abbiamo anche un decremento importante della mortalità globale. Ovviamente sappiamo bene che ogni tumore ha una sua storia e una prognosi diversa, e in queste statistiche conta molto l'incidenza dei singoli tumori, dove alcuni hanno visto un aumento notevole della loro incidenza, tra cui proprio il tumore alla mammella.

Cause e trasformazione cellulare

Cosa è che causa il tumore, ovvero il fenomeno che causa la trasformazione cellulare? In realtà potremmo dire che la causa è tutto ciò che causa un danno al patrimonio genetico, perché è qualcosa che potenzialmente può trasformare le nostre cellule. Ovviamente sappiamo che abbiamo tanti sistemi di sicurezza che consentono di proteggere e riparare i danni al DNA, proprio per salvaguardare il nostro patrimonio genetico.

Però ci sono una serie di agenti e stimoli che possono causare questi danni, come agenti mutageni e radiazioni ionizzanti, quindi mutageni fisici, ma anche specie ROS che alterano macromolecole nelle nostre cellule, nelle proteine, DNA e lipidi. C'è anche una parte importante correlata all'attività di mutageni biologici come virus e batteri, il microbioma o microbiota.

Circa il 20% dei tumori si stima sia correlato ad agenti virali e ci sono tanti studi che hanno messo in correlazione HPV e HCV come agenti inizianti al cancro alla cervice uterina e fegato, ma ci sono anche una serie di batteri che alterano i tessuti in cui si collocano favorendo la comparsa tumorale. Quindi, specialmente quando questi danni accadono su quei geni correlati al controllo del destino cellulare, come quelli che controllano la stabilità e la riparazione al DNA (geni del MMR, o p53, quindi fattori pro-apoptotici), si ha la possibilità da parte della cellula di acquisire la capacità di regolare importanti pathway cellulari che possono fortemente impattare sulle caratteristiche che la cellula può avere.

Geni ridondanti e caratterizzazione tumorale

Come è che la cellula si salvaguarda da questi aspetti? Spesso ci sono geni detti geni ridondanti che controllano attività cruciali della cellula, spesso quindi non è sufficiente una mutazione su uno solo di questi geni che controllano questi meccanismi, ma è importante infatti notare la presenza di questi geni ridondanti con funzioni sovrapponibili. Quindi, a parte rari casi, non è sufficiente e non è possibile alterare un solo gene per portare alla trasformazione neoplastica. Ovviamente, anche qui si entra in un percorso complesso in cui esistono una serie di possibilità di caratterizzazione di un tumore nelle sue caratteristiche genetiche per capire quali sono quelle alterazioni genetiche che possono caratterizzare certi tumori.

Spesso sappiamo che in quei tumori caratterizzati in un momento in cui siamo ben oltre la singola cellula mutata siamo in una condizione di instabilità genetica per cui man mano che si trasformano possono mutare sempre di più il loro patrimonio genetico. E sappiamo che la complessità del tumore è molto alta, tanto che uno dei primi studi omici sul tumore alla mammella furono condotti nel 2000 su soggetti con tumore mammario che furono profilati con metodica micro-array per il loro profilo trascrizionale, prendendo quindi i loro trascritti.

Quindi, fu preso il profilo trascrizionale di questi pazienti facendo un clustering, quindi raggruppando per caratteristiche simili, e fu visto che questo tipo di tumore è raggruppabile in 4/5 sottogruppi, ognuno identificato in un profilo trascrizionale specifico, quindi ad ogni gruppo corrisponde a ben diverse probabilità di prognosi ed esito della malattia. Per esempio grazie alle curve di Kaplan-Meier che ne derivano potremmo dire che se siamo in un tumore luminale A abbiamo l'80% delle probabilità di non andare incontro a metastasi nell'arco di 10 mesi dopo la diagnosi, mentre se siamo in Her2 like invece il rischio è molto più alto, quindi questo fa associare complessità genetica e complessità biologica del tipo di prognosi e diagnosi.

Evoluzione e terapia personalizzata

Ovviamente questo studio fu seguito da tanti altri, e 12 anni dopo nel 2012 si evidenziò come non è solo il profilo trascrittomico che guida le caratteristiche biologiche e cliniche di questi tumori, ma si ha possibilità acquisire tante informazioni in più in cui in ogni raggruppamento abbiamo ulteriori sottogruppi, potendo mediante tecniche di NGS o sequenziamento su singoli geni, ritrovare alterazioni e mutazioni geniche che impattano in modo differente sulle caratteristiche di ogni tumore. E di fatto tante più informazioni abbiamo, tanto meglio potremmo calibrare la terapia su quel paziente, arrivando quindi ad avere le terapie personalizzate che altro non sono una calibrazione della terapia sulle caratteristiche biologiche del tumore e per fare questa terapia non è sufficiente una forma di caratterizzazione che si limita al momento della diagnosi, ma è necessario tenere a mente tutta quella serie di pressioni selettive che fanno sì che le caratteristiche evolvono, modificando il tumore biologicamente e impattando ovviamente anche nella terapia.

Per rimanere in questo argomento, oggi la maggior parte dei trial clinici non si fanno solo per tipo di tumore e sede distrettuale in cui il tumore compare ma anche per una serie di caratteristiche biologiche, potendo infatti distinguere due tipi di trial clinici, uno detto umbrella trial e uno invece che si dice basket trial, in cui i tumori sono trattati non su caratteristiche derivanti dal tessuto di origine, ma anche su caratteristiche e informazioni che abbiamo a disposizione. Quindi nel caso dell'umbrella trial potremmo caratterizzare tumori provenienti dallo stesso tessuto e calibrare un trattamento sulla base delle mutazioni genetiche che sono valutate nei tumori di quel tessuto. Nel basket trial invece non è il tessuto di origine a raggruppare il tipo tumorale, ma sono le aberrazioni geniche, quindi tutti i tumori, indistintamente dal tessuto di origine, sono trattati in un certo modo sulla base quindi delle sole caratteristiche genetiche.

Meccanismi di trasformazione tumorale

Ovviamente, come dicevamo, geni colpiti da queste trasformazioni avranno un effetto tanto più tumorale tanto più questi geni sono coinvolti in meccanismi di salvaguardia della cellula come i sistemi di controllo e riparazione dei danni al DNA. Ma come dicevamo, parlando della terapia personalizzata, non sono solo le mutazioni iniziative che possiamo trovare al momento della diagnosi che determinano lo sviluppo tumorale, bensì ogni passaggio proliferativo di ogni cellula caratterizzata da instabilità genomica è capace di generare nuove mutazioni.

Quindi arriveremo a quella popolazione policlonale con una popolazione di cellule tumorali con caratteristiche diverse. E ricollegandoci al concetto di plasticità, possiamo dire che tanto più una cellula riesce ad adattarsi all'ambiente in cui si trova, tanto più sarà una cellula in grado di diventare veramente aggressiva. E nel parlare della tipica evoluzione tumorale vediamo un modello moderno usato per spiegare l'espansione clonale di un tumore:

• Ci rifacciamo con questo modello a quella che viene chiamata anche Knudson Hypothesis, per cui si parla della teoria dei "two hits" per cui non è sufficiente una sola mutazione a far comparire il tumore, bensì è necessaria una seconda mutazione per la trasformazione neoplastica.
• Nella figura precedente possiamo ben vedere lo sviluppo del tumore dalla prima mutazione fino all'acquisizione di quelle caratteristiche tipiche di un tumore aggressivo.
• Con le croci sono rappresentate le mutazioni guida, le driver mutation che caratterizzano le capacità di questo tumore di evolvere in senso neoplastico, a fianco abbiamo invece le passengere mutation che non guidano lo sviluppo neoplastico, ma come dice il nome "guidano", quindi sono mutazioni di tipo somatico che impattano nella risposta agli stress successivi e anche che impattano nei trattamenti che si fanno nel paziente.

Ovviamente se vado a fare un campionamento in una biopsia di un campione quando siamo al time point X in figura, ottengo risultati che possono essere fortemente eterogenei e dipende proprio in realtà dalla biopsia che vado a campionare, perché potrei ottenere come risultato della caratterizzazione un certo tipo di cellule che sono però solo un gruppo di cloni di quella popolazione policlonale, quindi mi potrei perdere invece un certo tipo di clone che in quel momento non sono la maggior parte del tipo di cellule che compongono quella massa di cellule in quel momento, però che in seguito a un trattamento potrebbero dare quel fenomeno di outnumbering e diventare quindi principali.

Quindi io potrei fare una caratterizzazione di quel tumore studiando una terapia sulla base di quel clone, ma poi proprio anche sulla base della terapia potrei andare a promuovere il soppiantamento con un altro clone determinando allora la necessità di cambiare terapia, di fatto parliamo di una pressione selettiva. E questo fenomeno però ovviamente è tanto più complesso, perché per quanto possano essere le pressioni selettive che faccio dall'esterno per esempio con le terapie che somministro, esistono una serie di pressioni selettive anche interne, che fanno sì che si abbiano modifiche impattanti su genetica del tumore. E quindi facciamo riferimento a tutti quei fattori microambientali che sono fondamentali per l'evoluzione del tumore, tanto che una frontiera importante nella terapia antitumorale è proprio l'uso di farmaci che impattano nella componente immune, che è fondamentale per far sì che un tumore possa progredire o meno e infatti il tumore va ad adottare una serie di strategie per "hackerare" il sistema di riconoscimento al fine di eludere questi sistemi di riconoscimento che il sistema immunitario ha nei confronti di queste cellule tumorali che nascono con lo scopo di salvaguardare organismo e tessuti da questi eventi.

Importanza del microambiente tumorale

Un altro aspetto importante che vedremo, è anche che la cellula tumorale non è importante da sola, ma anche nel contesto, quindi è importante proprio per l'insorgenza delle metastasi e di sviluppi di tumori a distanza, capire quali sono le influenze del microambiente, non solo nella sede primaria, ma anche nella sede secondaria. Ci sono quindi una serie di forze esterne e interne, quindi sia dovute alla terapia che dal microambiente, che possono impattare sul genoma del cancro e sulle caratteristiche sub-clonali di questi tumori.

Quindi, per cercare di generalizzare questi discorsi, possiamo vedere cosa hanno in comune le cellule tumorali, soprattutto la capacità di diventare egoiste, ovvero perdere le caratteristiche di vivere in comunità, spesso questo si manifesta con capacità di proliferare in modo incontrollato, ma non è sempre vero, ci sono cloni che possono essere latenti e essere secondari per tanto tempo e poi invece esplodere solo in un certo momento a causa di vari fattori e pressioni selettive.

Teorie e studi sull'oncogenesi

Tutti questi discorsi che abbiamo detto finora, sono stati teorizzati da due studiosi agli inizi degli anni 2000, che sono Von Weinberg e Hanahan che sono dei pre-clinici, usando un approccio di ricercare le caratteristiche biologiche e biocliniche delle cellule tumorali, dando vita a una delle pietre miliari degli articoli biomedici nell'oncologia, ovvero quello che viene detto gli Hallmarks of Cancer in cui hanno teorizzato e messo per la prima volta per scritto quali sono le caratteristiche che una cellula tumorale acquista e deve avere per essere definita tale.

• Crescita incontrollata e l'indipendenza dagli stimoli mitogenici, come i GF;
• Capacità di evadere l'induzione di tutti quelli che possono essere i meccanismi che portano la cellula verso l'apoptosi, una morte che tutto è fuorché egoista, perché serve a cercare di preservare le caratteristiche del tessuto;
• Insensibilità a stimoli anti-proliferativi che in qualche modo impediscono al tessuto di dare espansione e perdita di omeostasi;
• Angiogenesi sostenuta, quindi formazione di nuovi vasi che facilitano l'accesso ai tessuti extratumorali.

Tutte queste sono caratteristiche definite come essenziali per far sì che la cellula vada incontro a un fenotipo così detto aggressivo. Sempre questo studio di questi due ricercatori ha teorizzato il concetto base per cui il tumore non è solo una sacca di cellule tumorali e sono loro responsabili della malattia, ma la capacità del tumore è di prendere contatto con il microambiente per far sì che quella cellula tumorale riesca ad adattarsi all'ambiente in cui si trovano. Quello che questi due ricercatori dissero è che negli anni successivi sarebbe stato definito il vero ruolo delle cellule stromali e l'importanza nel contesto nell'ambito tumorale, quindi in particolare cellule immunitarie e fibroblasti.