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Biologia cellulare Appunti scolastici Premium

Appunti di biologia cellulare basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Zuccotti dell’università degli Studi di Pavia - Unipv, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali, Corso di laurea magistrale in biologia sperimentale ed applicata. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Biologia cellulare avanzato docente Prof. M. Zuccotti

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ESTRATTO DOCUMENTO

La figura in alto permette di osservare le interazioni

reciproche delle code dei lipidi dei vari foglietti. I due

foglietti non sono indipendenti l’uno dall’altro, ma a

seconda della lunghezza delle code, ci può essere una

maggiore o minore interazione delle code di un foglietto con

quelle dell’altro, contribuendo a rafforzare o disturbare

l’ordine dei foglietti. I lipidi molto saturi tendono a formare

strutture molto ordinate dalla consistenza di gel; se viene

aumentata l’agitazione termica, è possibile cambiare le

strutture gelificate rendendole più disordinate (indipendentemente dalla presenza o meno di

legami doppi). Quindi le membrane riscaldate diventano più fluide e allo stesso tempo

diminuiscono di spessore.

Tutte le membrane hanno strutture più o meno ripiegate e più o meno solide. Gli studiosi delle

membrane stanno cercando di capire come si organizzano i lipidi insieme al colesterolo a seconda

del fatto che siano lipidi saturi o meno. Per esempio, la sfingomielina essendo satura ed avendo

catene molto lunghe, forma strutture molto ben organizzate fra loro e la presenza di colesterolo in

mezzo, non altera organizzazione di queste catene; la presenza o meno del colesterolo non ha

dunque ripercussioni sullo spessore della membrana.

Invece nella fosfatidilcolina ad esempio, la presenza

degli anelli steroli, costringe le code ad essere più

dritte ed ordinate; a seconda della quantità di

colesterolo in queste membrane con questo tipo di

lipide, si avrà uno stato di gel e di spessore maggiore.

Ciò dà l’idea che la miscela di lipidi di membrana e la

presenza o meno di colesterolo, ha importanza.

A seconda della dimensione della testa, la forma dei lipidi è diversa fra loro. La fosfatidilcolina ha

forma cilindrica perché la testa grande ha più o meno lo stesso spessore di quello delle code,

mentre i lipidi piccoli hanno una forma a cono rovesciato; quando i due tipi sono insieme, tendono

a formare dei ripiegamenti. E’ possibile trovare gradi di ripiegamenti diversi.

Molti processi vitali della cellula sono basati sulla formazione di vescicole che sporgono in un lato

o nell’altro o vescicole che si separano e quindi bisogna indurre in certi momenti delle curvature in

modo da formare queste vescicole. I processi dell’endocitosi, ad esempio, richiedono che si formi

delle curvature che poi portano alla fusione delle membrane con le vescicole che avranno destino

diverso a seconda della sostanza contenuta. Questo è un processo che tutte le cellule utilizzano.

Anche la fusione delle vescicole che gemmano dal Golgi con la membrana plasmatica o con i

lisosomi, è un processo del genere. Chi sta studiando tutte le proteine che costringono la

membrana a formare vescicole (che sono diverse: dal Reticolo al Golgi di un tipo, dal Golgi al

reticolo di un altro tipo e nell’ambito del Golgi ancora di un altro tipo), sta coniugando queste

ricerche con ricerche che definiscono il tipo di grassi di queste vescicole; sarà infatti il tipo di

grasso a promuovere l’accumulo di recettori che portano sostanze da una zona all’altra. C’è una

selettività da parte di questi recettori che prendono le sostanze dal Reticolo e le portano al Golgi e

da qui la proteina trans membrana avrà delle preferenze in base al tipo di lipidi. Il discorso

sull’etereogeneità di lipidi di membrana, diventa sempre più importante. Anche gli studi che

riguardano sintesi e smistamento del colesterolo in proporzioni diverse nelle varie membrane

cellulari (sia plasmatica che le altre degli organelli) si sa che è basata su lipidi spesso ricchi di

sfingomielina e colesterolo, quindi queste vescicole hanno una dotazione non casuale ma specifica

di lipidi. La funzione del Colesterolo va vista in funzione dei lipidi con cui si mescola e questo avrà il

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ruolo di definire dei micro domini nella membrana che hanno una struttura relativamente più

ordinata delle altre; questi microdomini nella membrana plasmatica saranno piattaforme di

segnalazione con ruoli molto diversi.

A seconda dei tipi di lipidi che si mescolano nella membrana si possono avere 4 tipi di spessore di

membrana. Il tipo di organizzazione dei lipidi dipende da come sono organizzati fra di loro. La

fosfatidilcolina è rappresentata come una struttura a cilindro, la fosfatidiletanolamina come cono.

Vi sono anche lipidi particolari con una coda sola. Quando si parla della dotazione lipidica della

membrana, bisogna considerare che non vi sono solo glicerolipidi o sfingolipidi completi (con parte

idrofobica e parte polare), ma ci sono dei prodotti che sono come precursori o risultato dell’azione

di enzimi vari (in particolare lipasi) che sono presenti con compito di segnalazione (per esempio il

DAG derivato dal fosfatidil-inositolo 4,5-difosfato, un fosfolipide di membrana) o altro. Molti lipidi

derivati dall’azione di fosfolipasi specifiche per tagliare una delle code, formano lipidi chiamati

lisolipidi che restano con una coda sola; la concentrazione dei lisolipidi è importante per la

forzatura del ripiegamento. Gli studiosi dell’endocitosi per esempio, o dei processi di traffico fra

Golgi e reticolo endoplasmatico, sono abituati a ragionare anche su questi lipidi incompleti che

hanno un compito che va oltre al fatto di essere molecole di segnalazione (come lo è il ceramide

derivato dalla degradazione della sfingosina), in quanto sono importanti per formare i

ripiegamenti.

Le lipasi hanno specificità diversa sui lipidi: alcuni tagliano la testa, altre rompono le code. In

risposta a segnali diversi, sarà attivata una diversa fosfolipasi ed i lipidi di membrana verranno

degradati in un modo o un altro.

Nei lavori più recenti sull’effetto dei lipidi nel ripiegamento della membrana, si sente spesso

parlare di uno strano composto che ha una configurazione particolare, completamente diversa

dalla maggior parte dei lipidi di membrana e che è presente anche in concentrazione

particolarmente elevata in certe strutture della cellula. Per esempio nelle cellule che formano il

surfattante, sostanza che permette agli alveoli di distendersi, sono presenti molecole di questo

strano lipide che deriva dall’azione della fosfolipasi sulla fosfotidilcolina. I lisosomi spesso non

sono in grado di degradare questo lipide e quindi questo fenomeno si associa a malattie da

accumulo lisosomale anche grave e negli ultimi anni si è visto che questa struttura è importante

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nei processi di separazione del recettore, che ha catturato una sostanza per endocitosi, dalla

stessa sostanza catturata.

Nell’endocitosi mediata da recettori, accade questa progressione di eventi:

-La cellula inserisce sulla membrana il recettore (per esempio per lipoproteine o trasferrine);

-il recettore si lega alla lipoproteina o alla trasferrina e

cambia conformazione;

-il recettore si sposta nella membrana e si associa alle

fosse rivestite di clatrina che si stanno formando;

-la fossa rivestita da clatrina si chiude in una vescicola

(che contiene i vari recettori che hanno legato la

sostanza) che si stacca dalla membrana;

-dopo aver perso il rivestimento di clatrina, la vescicola si fonde con l’endosoma precoce;

-si trova un ambiente in un primo momento simile a quello del citoplasma in cui il recettore ha

affinità verso la sostanza catturata(questo è il primo endosoma).

Ma la cellula ha bisogno dei recettori per continuare a catturare altre lipoproteine ad esempio.

Così inizia un processo che comincia ora ad essere svelato, che prevede:

-un abbassamento relativo del ph (quindi la pompa comincia a rendere il ph intorno a 6);

-in questo modo il recettore perde affinità verso la sostanza (endosoma tardivo);

-le molecole vengono poi rilasciate, degradate nei lisosomi o riciclate dagli endosomi precoci verso

la membrana plasmatica attraverso vescicole di trasporto.

Ma il recettore che fine fa? Si sa da molti studi recenti, che esiste un processo all’interno di questi

lisosomi, modulato da proteine che hanno la sigla ESCORT. Le ESCORT sono delle proteine, che

nell’ambito della membrana dell’endosoma che ha lasciato andare la sostanza, selezionano i

recettori, li inseriscono in sottoregioni di questa vescicola e queste sottoregioni formano piccole

vescicole che vengono inviate in superficie. Le rimanenti si fondono con i lisosomi e la sostanza

viene degradata.

A quanto pare, lo strano composto di cui si parlava prima, è fondamentale per lo smistamento tra

la sostanza trasportata e il recettore negli endosomi e anche per il controllo della concentrazione

di colesterolo. Questi composti sono sempre più studiati anche perché, molto spesso, i gruppi

legati sono acidi grassi di quelli che si sanno essere modulatori dell’infiammazione come ad

esempio l’acido arachidonico. Nell’attivazione dei macrofagi nel polmone per esempio, questa

sostanza diventa importante come modulatore.

Una delle ultime scoperte è che questo strano composto è fondamentale nel processo di fusione

di vescicole con altre membrane; sarà un problema collegato al cambiamento del ripiegamento

della membrana, modulato da questi composti. 6

Proteine di membrana: Tutto ciò che verrà affrontato sulla struttura del

citoscheletro, che è altamente dinamica, è basata sul legame di vari monomeri

proteici che possono stabilizzarsi e formare lunghe catene anche ramificate e

hanno spesso punti di collegamento indiretto con la membrana; quindi hanno

un ruolo funzionale che si riflette sul comportamento della membrana e viene

propagato anche all’ambiente esterno.

Fra le proteine di membrana vi sono proteine con residui di zuccheri che

ritroveremo anche nella matrice extracellulare. Diversi domini delle proteine

svolgeranno ruoli diversi ma complementari. Conviene sempre pensare alle

proteine come una sequenza di domini ciascuno con il suo ruolo. Nelle

proteine della matrice extracellulare, si trovano domini (o moduli) con

struttura simile che si ripete varie volte, che possono venire aggredite da proteasi della matrice in

modo specifico, per cui vengono staccati dalla proteina originaria diventando dei segnali. E’

dunque importante ricordare il concetto dei vari tipi di struttura delle proteine e che cosa sono i

vari moduli che si possono formare nella struttura.

Alcune proteine transmembrana possono attraversare la membrana una o due volte. Altre

proteine sono periferiche e le troviamo o nell’ambiente interno della cellula o in quello esterno

associate con legami non covalenti ad altre proteine che attraversano la membrana. Poi ci sono

proteine legate covalentemente ad un gruppo che

può inserirsi nella membrana, quindi con code

lipidiche. Si cerca di descrivere una proteina a

partire dalla sua struttura primaria, che è data

dalla sequenza di amminoacidi determinata dal

gene. Alcune zone della proteina possono avere

una struttura secondaria (alfa elica o beta

foglietto): l’alfa elica può dare origine ad

avvolgimenti di un’elica su un’altra; i foglietti sono

formati da strutture che si aggregano formando

“barilotti” che formano pori. La struttura terziaria

della proteina, in maniera sommaria, è descritta

come la struttura tridimensionale complessiva che la proteina assume. E’ costituita da domini

particolari talvolta con strutture ben ordinate ad alfa elica o foglietto e spesso con sequenze di

amminoacidi che permettono flessibilità (punto chiave per le proteine che devono essere

piuttosto plastiche) e alcune strutture che si ripetono nella proteina formando domini particolari.

Quindi la struttura terziaria è basata sull’interazione dei gruppi laterali degli amminoacidi o anche

sul legame peptidico quando si formano queste strutture. Alcune proteine hanno struttura

quaternaria ed in questo caso si pensa sempre all’emoglobina ma tante altre proteine ce l’hanno;

è proprio la collaborazione di tante subunità diverse che rende una proteina specifica per un ruolo.

Alcuni domini si possono ripetere e alcuni svolgono compiti particolari. Uno degli aspetti della

struttura quaternaria, è che le varie parti sono collegate fra loro con legami che ritroviamo anche

nella struttura terziaria. Ci sono subunità per esempio legate fra loro da ponti S-S come nella

fibronectina e nelle proteine che formano anticorpi; oppure ci sono subunità collegate in modo

non covalente, quindi con interazione molto più

debole. A seconda del numero e del tipo di

subunità, si hanno strutture quaternarie diverse.

Molte proteine enzimatiche hanno il sito attivo nei

punti di giunzione delle varie subunità; quindi c’è un

grado di plasticità e di complementarietà fra

molecole che richiede la formazione di aggregati di

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subunità diverse. Infatti la struttura quaternaria è importante per modulare l’attività di molti

enzimi; proprio alla base della regolazione allosterica di molti enzimi, sta la loro struttura

quaternaria, in quanto i legami provocano cambiamenti di conformazione e questo puo’

aumentare o diminuire l’attività di questi enzimi. C’è un collegamento quindi fra struttura

quaternaria e versatilità della funzione della proteina.

(Le proteine glicosilate verranno trattate nel capitolo del glicocalice)

Il legame degli zuccheri alle proteine della membrana plasmatica, è svolto nell’apparato di Golgi ed

inizia in molti casi nel Reticolo endoplasmatico. Questi zuccheri finiscono nella membrana

plasmatica nell’ambiente esterno dove saranno dei segnali di riconoscimento della cellula e

promuovono il contatto con altre proteine su altre cellule o con la matrice e possono servire anche

come protezione della membrana perché gli zuccheri sono molto rigidi e formano una sorta di “filo

spinato” intorno alle cellule proteggendole dai detergenti (questo è fondamentale nell’intestino ad

esempio). Molte delle proteine che devono funzionare in corrispondenza della membrana,

sfruttano, non solo le teste cariche negativamente della serina o lisina ad esempio (sfruttando

sequenze di amminoacidi carichi negativamente per essere attratte), ma avranno anche un tipo di

lipide collegato che può inserirsi nel foglietto interno o in quello esterno. Queste sono tutte

proteine che hanno compito importante nel differenziamento e nella risposta a segnali che

inducono proliferazione; un esempio è la proteina G. Il sistema di avere la proteina vicina alla

membrana serve per ottimizzare la risposta a segnali diversi. (In seguito si vedrà che la diversità di

queste code, in termini saturazione o insaturazione, contribuirà a tenere certe proteine più

nell’ambito dei Rafts lipidici e altre invece che hanno code con molti legami doppi coniugati che le

tengono fuori dai Rafts. Questo è importante se si vuole impedire che queste proteine

interagiscano con la traduzione di segnali che si svolgono nei Rafts e quindi si possono tenere

separate proteine con attività enzimatica diversa inserendole con code diverse nella membrana.

Le alfa eliche possono attraversare la membrana una o diverse volte. Ci sono poi sistemi di

formare strutture a forma di barilotto per attraversare la membrana basati sul beta foglietto;

questi ultimi possono avere un ambiente esterno che può essere acquoso e scherma il passaggio

di molecole attraverso il doppio foglietto, nascondendole dalle code. Molti sistemi di

attraversamento della membrana sono basati anche sui beta foglietti associati diverse volte che

danno strutture a barilotto.

Ancore lipidiche: Alcune proteine vengono coniugate nell’apparato di Golgi. La coniugazione può

avvenire con legame tioestere ad un acido grasso spesso saturo e molto lungo; queste sono

chiamate proteine Palmitoilate e sono di solito quelle che si trovano nei Rafts lipidici. Altre

proteine vengono coniugate covalentemente ad

amminoacidi che hanno strutture piuttosto

sature. Poi ci sono composti con legami doppi

intervallati simile al precursore del colesterolo e

sono ancore fluide che finiranno nelle zone più

fluide della membrana. (Non importa conoscere i

tipi di legami, ma bisogna sapere che sono

legami covalenti). Queste sono le ancore delle

proteine a ridosso del foglietto interno della

membrana plasmatica. Il legame ai lipidi, non solo permette alle proteine di ancorarsi alla

membrana, ma stabilisce anche dei siti di riconoscimento per alcune di esse. Alcune proteine si

legano alla testa di lipidi ed hanno sequenze di amminoacidi che riconoscono alcuni lipidi

particolari. Per esempio le proteine che si legheranno ai lipidi basati sull’inositolo, spesso,

riconoscono l’inositolo fosforilato (tramite sequenza ph) e quindi un’attrazione della proteina

verso la membrana è basata sul riconoscimento di questi lipidi. Questo permette ad una proteina

periferica di essere specificamente legata solo ad alcuni lipidi. 8

Anche molte proteine fondamentali per la struttura della membrana, come

succede nei globuli rossi, riconoscono teste basate sulla serina e si formano

legami in certe zone che promuovono la formazione dell’impalcatura della

membrana del globulo rosso.

Alcune proteine sono invece associate al foglietto esterno. Spesso sono proteine

attive nell’ambiente extracellulare; queste sono collegate con un’ancora molto

particolare basata su diversi zuccheri, diversi gruppi fosfato anche una testa di

inositolo; questa àncora è chiamata GPI (vedi immagine a destra). Il gruppo

fosfato si può collegare covalentemente ad una proteina. L’ancora può essere

degradata da enzimi (come le fosfolipasi) e in questo caso la proteina va in

soluzione. La complessità di gruppi, tiene la parte proteica molto distante dalla

cellula e questo facilita il comportamento della proteina nell’ambiente

extracellulare dove può degradare o influenzare molecole; è un sistema questo

che permette di proteggere la membrana dall’azione di enzimi.

Ci sono esempi di proteine che devono avere la parte amminoacidica lontana dalla membrana. Ci

sono ad esempio enzimi coniugati con processi come la fosfatasi alcalina (nell’osso), che

permettono la formazione di depositi di fosfatato di calcio e permette di degradare molti gruppi

fosfato da molte molecole, non solo quindi defosforilare in ambiente alcalino alcune sostanze. C’è

poi la 5’nucleotidasi che degrada l’ATP in ADP e AMP extracellulare che sono spesso segnali che

promuovono aggregazione piastrinica o attivano recettori colinergici (quindi è un enzima che

degrada nucleotidi sempre in ambiente extracellulare). Ci sono anche alcuni enzimi coinvolti nella

trasmissione di segnali nervosi e poi ci sono anche molecole di adesione che hanno lo stesso tipo

di àncora.

Glicocalice: E’ la tipica struttura che può essere messa in evidenza con la reazione di PAS.

Il fatto che il glicocalice sia in alcune specie più spesso ed in altre meno, indica che ci sono delle

molecole di zucchero che sporgono maggiormente e sono particolari. In microscopia elettronica

vengono messi in evidenza in cellule dell’intestino o dei tubuli del rene dove lo spessore è elevato

e sono dunque ben visibili. La struttura del glicocalice è dovuta a combinazioni di zuccheri molto

particolari che sono legati covalentemente non solo a proteine ma anche a lipidi della membrana

plasmatica. Ci sono diverse combinazioni di zuccheri che possono essere ramificate o lineari. Le

sequenze lineari sono quelle dei proteoglicani (con polimeri di glucosaminoglicani); ci sono poi

oligosaccaridi ramificati in numero maggiore o minore. L’importanza di questi zuccheri sta

crescendo sempre più perché le tecniche per identificarli stanno diventando sempre più precise e

sono nate branche della ricerca come la glicobiologia, la glicomica ecc. Si sa che condizionano la

superficie degli antigeni della cellula e sono modificati in situazioni patologiche, in particolare nei

tumori.

Uno dei compiti importanti del glicocalice, è quello di servire come sito di riconoscimento per altre

cellule o per proteine della matrice e questo può permettere anche l’adesione o meno fra cellule

diverse che purtroppo è stato identificato come punto di possibile entrata nella cellula di patogeni

che sfruttano questa combinazione molto specifica di zuccheri per invadere la cellula. Uno degli

aspetti studiati per primo, è stato come distinguere una cellula alterata da una normale, che

potesse segnalare al sistema immunitario la sua dovuta distruzione; purtroppo no tutte le cellule

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modificate sono identificate dal sistema immunitario e possono via via essere anche distrutte

cellule normali. Questo è dunque un campo di ricerca ancora aperto.

La possibilità di identificare le cellule è dovuta al fatto che molti zuccheri coinvolti nel glicocalice

possono combinarsi fra loro non solo in modo lineare ma anche ramificato. Anche se i

monosaccaridi coinvolti sono solo 15, ci sono migliaia o milioni di possibilità di combinarsi. Questo

crea il codice degli zuccheri che bisogna cercare di identificare e riconoscere. Ogni zucchero nella

sua combinazione può avere una struttura ad anello con diversi gruppi OH messi sopra o sotto

l’anello. C’è la possibilità che questi gruppi si leghino fra loro formando

legami glicosidici che sono o fra gruppi OH dello stesso lato dell’anello,

oppure fra un gruppo OH che sta sopra ed uno che sta sotto che

inducono torsione nelle molecole che sono quelle che conferiscono alla

cellulosa una forma particolare e resistente; quindi anche il legame

glicosidico può essere di vario tipo anche fra gli stessi OH e se poi si

prendono in considerazione tutti i tipi di zuccheri che possono essere

coinvolti nel legame, già si vede che il numero di combinazione è

immenso. Spesso l’ultimo zucchero verso l’esterno è un acido sialico che

ha carica elettrica negativa quindi più molecole di acido sialico ci saranno

sulla cellula, maggiore sarà la carica negativa sulla sua superficie. Gli zuccheri possono essere

legati a gruppi amminici dell’asparagina (i più frequenti) e l’inizio della glicosilazione di questi

zuccheri avviene nel Reticolo Endoplasmatico; ci sono poi diversi gruppi di zuccheri legati all’

ossigeno degli amminoacidi che hanno gruppo OH (per esempio treonina). Gli

zuccheri del primo gruppo sono chiamati O-linked, quelli del secondo gruppo

sono chiamati N-linked.

Gli oligosaccaridi possono formare delle classi diversi soprattutto dagli

immunologi in: oligosaccaridi con elevato numero di residui di mannosio o

quelli complessi che sono più vari e dove si trova l’acido sialico.

Guardando le immagini si vedono indicati legami con alfa o con beta: gli alfa

sono quelli fra gruppi OH dello stesso lato

dell’anello e beta quando i gruppi sono uno

sopra ed uno sotto.

Molte proteine hanno elevatissimo numero di zuccheri per

conferire alle cellule indipendenza da altre cellule. Si può vedere

questo in proteine specifiche dei globuli rossi, altamente glicosilate,

che contribuiscono ad evitare che i globuli rossi si attacchino l’un

l’altro perché ciò provocherebbe dei trombi. Molti degli zuccheri O-

linked, hanno una conformazione che si estende parecchio

all’esterno del doppio strato per permettere alla proteina di lavorare lontano dal foglietto (vedi

immagine a destra).

Molecole di adesione: Fra le molecole di adesione va ricordato un tipo di proteina di membrana

chiamata Mucina, proteina altamente

glicosilate che formano un film viscido sulle

cellule. Anche la placca batterica di alcuni

microrganismi è formata da un film di mucina.

Sono proteine con numero elevatissimo di

zuccheri che formano strutture estese perchè

contengono gruppi sialici che si respingono. Gli

zuccheri possono formare legami a ponte di

idrogeno con l’acqua e quindi questo aumenta

la solubilità delle proteine alle quali sono

legati. Questo legame degli zuccheri alle 10

proteine, serve anche alle proteine come protezione dagli enzimi che

riconoscono solo il legame peptidico.

Gli zuccheri hanno diversi compiti. Ad esempio la maggiore o la minore

glicosilazione può indirizzare le proteine alla degradazione o facilitare il

riconoscimento da parte dei vari recettori. Queste proteine spesso agiscono

su altre aumentandone o meno l’affinità verso i recettori. Quindi spesso il

fatto che la proteina abbia residui di zuccheri, la fa interagire con altre

proteine.

Molte cellule coinvolte nell’immunosorveglianza dell’organismo, hanno

membrana rivestita da molte ondulazioni dove sono concentrate proteine coinvolte

nell’interazione con altre cellule. Molte di queste proteine, sono altamente glicosilate. Dalla figura

a destra, che fotografa macrofago e linfocita, si può notare come sembra che stiano testando il

terreno.

Ritornando alle mucine.. Sono proteine con un elevatissimo numero di zuccheri che si ritrovano

nel muco e le cellule per esempio dell’intestino che hanno

forma a “bicchiere di vino” sono specializzate per secernere

queste proteine che servono a lubrificare certe zone dove

c’è necessità di diminuire l’attrito (nel caso dell’intestino),

ma può servire anche per intrappolare particelle che sono

finite nell’albero bronchiale (dove il muco che è poi

spazzato via dalle ciglia dell’apparato bronchiale, ha la caratteristica data dalla quantità di

zuccheri). Da un punto di vista molecolare si può notare che queste proteine hanno delle

caratteristiche ripetizioni di amminoacidi che vengono poi riconosciuti nell’apparato di Golgi per

ricevere gli zuccheri. Nelle cellule tumorali si verifica alterata ed estrema glicosilazione delle

cellule, che conferisce dei vantaggi per il distacco delle cellule da quelle vicine e per l’adesione

all’endotelio dei vasi per la disseminazione metastatica. C’è interesse quindi a bloccare l’adesione

di questi zuccheri all’endotelio dei vasi. La diversità di queste cellule è dovuta anche al tipo e al

numero di acido sialico. Le mucine possono in certi casi essere individuate come mattatori delle

cellule tumorali. Il ruolo dei carboidrati nell’infiammazione permette di selezionare i vari globuli

bianchi che devono uscire dai vasi per arrivare ai tessuti danneggiati. 11

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DETERMINAZIONE DEL SESSO 17 ottobre 2014

L uo o, da sempre, si è interessato alla differenza che contraddistingue il maschio dalla femmina di

organismi della stessa specie, per capire che cosa determinasse il sesso.

Aristotele, nel 335 a.C., affermava che la femmina era un maschio mutilato, il cui sviluppo si è fermato

poiché il freddo ventre materno ha prevalso sul calore del seme del maschio. Passano 2000 anni e la storia

non cambia, bisogna arrivare alla fine del 1800 affinché Geddes e Thompson, affermano che la

dipe de e dal se e ate o a a he dall a ie te.

determinazione può In effetti, è ancora vera la causa

ambientale, in quanto le tartarughe e i coccodrilli hanno questo tipo di determinazione del sesso. Dodici

M Glu ha o fe ato l i po ta za dei fatto i a ie tali.

anni dopo, Stevens e Wilson, osservando il

modello animale, ovvero le cellule di una Drosophila maschio e di una femmina, hanno notato delle

differenze nelle strutture cromosomiche. Infatti la femmina aveva due cromosomi XX il maschio X0 o XY.

Finalmente, Morgan riesce a prendere il premio Nobel agli inizi del 900, studiando in Drosophila il numero

dei cromosomi X, il cui rapporto tra i numeri di questo cromosoma determina il sesso.

Meccanismi di determinazione del sesso

Vi sono diversi meccanismi in diverse specie, che si classificano sostanzialmente in tre grandi categorie:

 Materno;

 Ambientale, Enviromental Sex Determination, ESD;

 Genetico, Genetic Sex Determination, GSD.

Tra quelli materni il più noto è quello delle api. Le uova fecondate si sviluppano in operaie sterile o in

regine, questo dipende dal nutrimento che viene dato alla larva. Invece le uova non fecondate che si

sviluppano partogeneticamente, svilupperano delle api di sesso maschile. Esempi di meccanismi genetici ce

ne sono tanti, ad esempio il DSD, Dosage-dependent Sex Determination (rapporto X:A) che determina il

sesso in Drosophila, in cui la presenza del cromosoma Y, nel rapporto con X, sviluppa un maschio.

L importanza del cromosoma Y è che porta dei geni che guidano il differenziamento del gamete maschile e

vengono espressi a livello del testicolo, fondamentali per organizzare lo sviluppo del gamete maschile. Sono

stati studiati degli organismi modello per quanto riguarda la determinazione del sesso di tipo ambientale

sia per gli invertebrati, come nel caso della Bonellia viridis, che per i vertebrati, come i coccodrilli e le

tartarughe. Bonellia viridis è un echiuride marino o oliva di mare. La femmina è un animale abbastanza

sifo e he si ap e all este o o

grosso, ha un una sorta di ombrello,

e questa è la regione dalla quale viene filtrata l acqua per la

nutrizione. Il maschio non è nelle proporzioni giuste, in genere la

femmina arriva anche ad essere lunga 15 cm, mentre un maschio

arriva ai 3 mm. Questo vive simbionte nel corpo della femmina, dove

feconda le uova, che si sviluppano a formare la larva, poi esce dal

Questa è una larva indifferenziata non

sifone e diventa larva natante.

è né maschio né femmina. Il fatto di diventare maschio o femmina

dipe de dall a ie te i ui vive. In particolare è stato visto che se

questa larva si trova in un ambiente in cui non vi sono altri esemplari di femmine, si sviluppa in femmina; se

fe i e, o sull

questa si deposita in prossimità di ombrello del sifone, questo si svilupperà in maschio. I

i e ato i ha o dedotto he la dete i azio e del sesso dipe de da u o sti olo i esso ell a ie te

ell

dalla femmina stessa. Per verificare sperimentalmente che questo fattore emesso ambiente derivasse

espe i e to: ha o p eso dell l ha o

dalla Bonellia femmina, hanno fatto questo acqua di mare e

suddivisa in tanti beckerini e hanno preso tante Bonellia femmine e ne hanno fatto una pappetta, hanno

diluito uesta pappetta all dell

interno dei beckerini con acqua di mare, partendo da una concentrazione

molto alta, diluendo fino ad arrivare all acqua di mare pura. Infine, hanno preso le larve indifferenziate e le

ha o esse all i te o di uesti beckerini. Così dove era presenta molto estratto di Bonellia femmina, le

ell

larve si sono sviluppate tutte in maschi dove la quantità di femmine era bassissima, acqua di mare

pura, le larve erano tutte femmine, naturalmente decrescendo la quantità di maschi e aumentando quella

di femmine a seconda della concentrazione. Così, i ricercatori hanno dimostrato che il fattore inducente il

e i esso dalla fe i a ell

sesso è dato da ciò che vie ambiente. In questo caso il meccanismo di

determinazione del sesso non è geneticamente determinato, non vi sono geni specifici ma il genoma

risponde ad uno stimolo, quello dato dalla Bonellina.

Per quanto riguarda i Rettili, vi sono varie specie sia tra le tartarughe che tra i coccodrilli che rispondono a

uale l

questo meccanismo di determinazione ambientale, che dipende dalla temperatura alla embrione si

sta sviluppa do. Questa te pe atu a espo sa ile di u attività enzimatica che determina la produzione

di ormoni. Il meccanismo importante nel determinare il sesso, è controllato dalla quantità di ormoni

l e io e

circolanti. Se questi ormoni sono maschili, testosteroni, si sviluppa in maschio, se predominano

gli o o i fe i ili, l e io e si sviluppa in femmina. A regolare i livelli di questi ormoni è un enzima che

si chiama Aromatasi, responsabile della conversione del testosterone in estradiolo. Nel caso di questi Rettili

è sensibile alla temperatura. Per cui per quanto riguarda gli studi fatti sul genere Emis, è stato descritto un

di effetto, ui di l

momento dello sviluppo embrionale in cui la temperatura non ha alcun tipo embrione è

ancora in una condizione indifferenziata in particolare ad essere indifferenziati sono le gonadi degli

embrioni, che possono diventare tanto testicoli quanto ovari. La gonade indifferenziata sia nella sua

componente germinale che nella sua componente somatica a seconda degli stimoli ambientali dati o dai

geni espressi, può seguire due vie differenziative diverse, diventare un testicolo o diventare un ovario,

o p odu e ovo iti. È l

produrre spermatozoi unica condizione cellulare che permette questa diversa

opposta possibilità di differenziamento, non esiste un altro esempio in tutti gli organismi, che abbia questa

potenzialità. Man mano che la gonade si abbozza diventa differenziata, nel caso di Emis, se la temperatura

alta, l attività aromatasica è alta e il testosterone verrà convertito in Estradiolo specifico, e tutto il

differenziamento della gonade indifferenziata prenderà la via per divenire un ovario, se la temperatura è

assa l attività a o atasica rimane bassa, i livelli di Estrogeni bassi e quelli di Testosterone alti, così la

gonade indifferenziata si differenzierà in Testicolo. A seconda delle specie, è la proteina stessa ad essere

sensibile alla temperatura o è il gene che esprime la proteina che può essere diffenziamente attivata dalle

he o solo dell attività

alte temperature. Esiste una variabilità, una differenza possibilità di controllo,

p otei a a può esse e a o te di uesta sull espressione del gene. Questo giustifica il fatto che in alcune

specie, la temperatura alta, porta allo produzione di maschi e, la temperatura alta, alla produzione di

femmine. Interessante è che il gene della Aromatasi è controllato positivamente da due geni Sox9 ed

he so o due ge i i po ta ti a he pe la dete i azio e del sesso ei a ife i, ui di u

Dmrt1

percorso in termini di geni che vengono coinvolti nella determinazione del sesso, essi sono evolutivamente

o se vati, a i e a is i he egola o l esp essio e di uei ge i o, ta t he se si esa i a il o do

vivente i meccanismi di determinazione del sesso sono incredibilmente diversi, e insorgono varie volte nella

storia evolutiva dei vertebrati. La tabella indica

questa variabilità, i più semplici sono gli uccelli e i

mammiferi, in cui la determinazione del sesso è di

tipo genetico e dipende dal corredo cromosomico,

nel caso dei mammiferi il sesso con bimorfismo

cromosomico è maschile (XY), nel caso degli uccelli

è femminile (XW). Anche gli anfibi hanno questo

tipo di determinazione del sesso, i coccodrilli hanno

una determinazione del sesso che è esclusivamente

legata alla temperatura, ma se si esaminano specie

diverse di tartarughe si trovano meccanismi diversi,

ci sono tartarughe come Emys che hanno una determinazione del sesso legata alla temperatura e altre che

hanno la determinazione del sesso maschile in cui gli eterocromosomi sono maschili, e altre in cui il sesso

eterocromosomico è femminile. I pesci, oltre ad avere una determinazione del sesso di tipo genetico e

legata alla temperatura, hanno addirittura ciò che viene definito Behavioural, cioè che dipende dal contesto

i ui l o ga is o si t ova el g uppo. Vi so o i a ila spe ie des itte di pes i, e all i te o di ueste

i ui la dete i azio e del sesso ge eti a, a all i te o di uesti i so o situazio i

si trovano dei gruppi

estremamente complesse in cui la determinazione del sesso dipende anche dal rapporto e dal numero dei

cromosomi, nel caso del maschio il rapporto fra il numero dei cromosomi tra X e Y, sistemi complessi in cui

a determinare il sesso sono dei geni presenti su dei cromosomi sessuali ma anche sugli autosomi, in alcune

situazioni sono i B-cromosomi ad essere importanti. La determinazione del sesso di tipo ambientale,

ovvero legata alla temperatura, è più semplice, ma ci sono situazioni legate al fenotipo, come il colore degli

animali, agendo su un asse di tipo endocrino, il pH, la densità della popolazione, lo stato sociale, la velocità

dell a ua, e

di crescita, il pH situazioni in cui questi due meccanismi si trovano insieme, quindi vi sono

dete i a ti ge eti i a so o i flue zati a he dall a ie te. All i te o di uelle ila spe ie, ad oggi,

si è appurato che la determinazione del sesso legata alla temperatura, riguarda solo 13 famiglie e 60 specie.

Come nel caso dei rettili, il momento critico per la determinazione del sesso è quello che riguarda lo stadio

larvale, in cui le gonadi si sono formate ma sono in uno stato indifferenziato, non è quindi precoce, non è

e io ale a già posti ipato al o e to vi i o all o ga oge esi. U aspetto he deve esse e

considerato, da un punto di vista evolutivo, è che naturalmente le variazioni di temperatura hanno una

rilevanza ecologica ed evolutiva incredibilmente importante, perché mentre nel caso della determinazione

del sesso genetica, il rapporto dei sessi alla nascita è 1:1, in questo caso il rapporto sessi può cambiare

tantissimo. Le strategie riproduttive dei pesci sono numerose, si possono trovare delle popolazioni

gonocoriche, di maschi e femmine, o anche specie in cui la riproduzione è esclusivamente legata alla

ovve o lo spe atozoo pe et a all i te o

femmina, quindi una situazione di partenogesi o gimnogenesi,

dell uovo a o o t i uis e o il proprio genoma, non si fonde con il pronucleo femminile e viene

oppu e l

eliminato, questo ha quindi una funzione di attivatore; ibridogenesi, in cui avviene la fecondazione

ma alla meiosi, il genoma paterno viene eliminato, uno straordinario esempio per gli studi epigenetici. Poi

e ui si può t ova e u po di tutto, dal tipo

esistono delle specie che sono ermafrodite seriale, in cui

l i dividuo si it ova o e fe i a, dive ta as hio e poi ito a fe i a, sotto o dizio i della

composizione del branco, oppure può essere di tipo sequenziale e qui si trova una sequenzialità

proterogina, da femmina diventa maschio, o proterandria, da maschio diventa femmina, oppure possono

all i te o dello stesso i dividuo si it ova o sia le ovaie he i testicoli,

essere simultanei o sincroni, in

questo caso la riproduzione può essere autosufficiente, o non autosufficiente, quindi deve esserci lo

L e af oditis o u a o dizio e he si it ova f e ue te e te t a gli i ve te ati, a

scambio di gameti. pes i, all este o dei pes i u a o dizio e patologi a he p ovo a

tra i vertebrati è presente solo nei

sterilità. ta t che anche negli organismi con

La determinazione del sesso non è un processo conservato,

determinazione di tipo genetico, possiamo distinguere situazioni come quelle di Drosophila rispetto al topo

o all uo o, i ui Drosophila dipende dal numero di cromosomi X ma è cell-autonomous, cioè il corredo

o oso i o di og i ellula he o po e l e io e fo da e tale a defi i e il desti o differenziativo di

quella cellula. Quindi, non vi sono ormoni circolanti che modulano o influenzano il destino differenziativo

delle cellule. Nel caso dei mammiferi, il cromosoma chiave è quello Y, ma un aspetto fondamentale è che il

fenotipo finale maschile dipende dagli ormoni circolanti, non è quindi sufficiente il corredo cromosomico,

ma è essenziale anche la quantità e la tipologia di ormoni circolanti. La determinazione del sesso è stata

studiata da va i i e ato i all i izio dell 9 , da Mo ga a B idge, il quale con la bilancia, indicava il

dosaggio tra gli autosomi e i cromosomi X. XY è maschio, X0 è maschio sterile, XX è femmina, ma anche XXY

fe i a. L Y i po ta te pe il diffe e zia e to dei ga eti as hili, o e ad ese pio i X il uale,

ste ile. Se l i dividuo o oso i a e te fe i a, ovve o XX,

non avendo cromosomi Y, è un maschio

ma se nelle primissime fasi della segmentazione per errori di segregazione un X viene perso, in quella

ellula e ei suoi de ivati l assetto o oso i o X , X si svilupperà e la cellula porterà in se un

programma di sviluppo di sesso maschile. Il

risultato sarà quindi un individuo che avrà

caratteristiche sia maschili che femminili e verrà

definito ginandromorfo. Il moscerino,

rappresentato in figura, ne è un esempio, perché

non ci sono ormoni circolanti che influenzano e

mediano lo sviluppo di quella cellula primigenia in

ui avve uto l e o e mitotico. Questo avviene

a he i alt e situazio i o e elle fa falle, he ha o l ete o o oso a fe i ile, a ha o la stessa

l a i ale se a ostituito da due disti te età, a he i uesto aso u e o e

situazione, anche qui

mitotico nelle primissime fasi della segmentazione ha portato una cellula a perdere un cromosoma, sempre

pe l ife i, i ui l a uisizio e del fe otipo

assenza degli ormoni circolanti. Diversa è la situazione dei ma

de iva dall i teg azio e di t e fatto i, l’assetto cromosomico

ovvero (XX o XY), il quale è determinante a

differenziare le gonadi, quindi, nello sviluppo fetale sono le gonadi che si formeranno a seconda del sesso;

gli ormoni prodotti da esse, determineranno il sesso fenotipico, quindi lo sviluppo in maschio o in femmina.

Quindi, il sesso genetico forma il sesso gonadico, e il sesso gonadico determina il sesso fenotipico.

La storia delle determinazioni del sesso nei mammiferi è molto recente, solo nel 1959 si è capito che nella

ost a spe ie la dete i azio e dipe de dall asse za o dalla p ese za del o oso a Y, ui di si apito

che ogni gamete avrà lo stesso tipo di corredo nella femmina, gli ovociti portano solo il cromosoma X e gli

posso o po ta e o il o oso a X o l Y. E u a sto ia he o i ia el o e to i ui stato

spermatozoi

possi ile defi i e l assetto o oso i o della ost a spe ie, o p i a pe h el aso dell uo o, a

differenza degli invertebrati, in cui le cellule venivano bloccate in mitosi con la tecnica dello squash e poi si

facevano scoppiare, era molto difficile ottenere dei buoni cromosomi. A un certo punto nel 1959 Tiseishu si

interessò di studiare la citogenetica degli umani, e dà a un tecnico il compito di preparare i cromosomi, il

quale si accorge di aver formato delle cellule con dei cromosomi meravigliosi, pur avendo seguito lo stesso

p o edi e to, allo a si e ò di ipe o e e i passaggi. I uesta i e a dell e o e, he in realtà aveva

portato a un miglioramento della ricerca, si accorge che il tecnico aveva sbagliato la pesata iniziale,

preparando una soluzione ipotonica, e non isotonica. Il primo passaggio di ipotonia, che fa entrare acqua

nelle cellule e le fa gonfiare, e a quel punto quando si prende il fissativo, che è alcolico, le cellule scoppiano,

e scoppiando si separano i cromosomi il più possibile. In questo modo si è permesso di fare dei balzi in

avanti incredibili nella citogenetica, e nel 1959 si arrivò a stabilire che il numero cromosomico della nostra

spe ie 6. Il sesso dello zigote ui di dete i ato dall assetto o oso i o sessuale dello spermatozoo

fe o da te, e il appo to sessi sa à i a : , a isog a o side a e l i po ta za della egolazio e

uo o,

ormonale. Nei mammiferi ci sono specie monoovulatorie o poliovulatorie. L come il bovino, è una

specie monoovulatoria, partoriscono quindi un cucciolo alla volta, incidentalmente possono essere ovulati

due ovociti che fecondati daranno origine a due impianti e quindi a due feti. Nei bovini, grazie alla

o fo azio e della pla e ta, t a i due feti i olazio e di sa gue e uesto po ta a u o dizio a e to

fe i a e l alt o sia as hio, la ua tità di

degli ormoni, infatti nel caso in cui un feto sia testosterone

circolante sarà molto elevata e ciò porterà a una mascolinizzazione del feto femmina, in questo caso la

l i po ta za degli o o i i ola ti el dete i a e

femmina sarà pure sterile, free martin. Questo mostra

il sesso. Nel caso della nostra specie abbiamo anche casi di alterazione cromosomica. Ad esempio, le

monosomie degli autosomi sono mortali, le uniche monosomie sono quelle legate ai cromosomi sessuali,

ed è quindi possibile avere delle situazioni di tipo X0 45, ovvero la sindrome di Turner, in cui vi è un solo

cromosoma X e sono persone fenotipicamente femmine, perché manca il cromosoma Y, ma sono sterili e

con delle patologie associate alla sindrome. Ma ci sono anche casi di trisomia, la più nota è XXY la sindrome

di Klinefelter, in cui vi è un cromosoma Y i soggetti sono effettivamente fenotipi maschi ma con dei caratteri

di femminilizzazione fenotipica, queste persone presentano, ad esempio, ginecomastia, sono glabre ed

hanno un tono di voce più alto. Esistono casi di mosaicismo come XXXY, e qui il fenotipo finale dipende

sostanzialmente dalla prevalenza degli ormoni circolanti. Quello che deriviamo da queste informazioni è

che il parametro critico è la composizione cromosomica delle gonadi. Il nostro cariotipo è formato da 22

atte zio e sui o oso i sessuali,

coppie di autosomi, più i cromosomi sessuali XX o XY. Se si pone l si nota

come sono diversi tra di loro, X è molto grande e ricco di geni, Y è più piccolo, tendenzialmente

eterocromatico e con pochi cromosomi. Ci sono molti gruppi di studio che hanno focalizzato la loro

attenzione sulla derivazione del cromosoma Y, e hanno messo in evidenza che il sistema cromosomico XY è

olto giova e i te i i evolutivi, o data, all i te o dei a ife i, di i a 6 ilio i di a i. Si ritiene

che la storia evolutiva sia la seguente, negli individui ancestrali i due cromosomi originali erano identici, e si

comportavano come tutti i cromosomi, come ad esempio con il crossing-over in meiosi, a un certo punto su

uno dei due si genera una mutazione molto importante, e si genera un gene che adesso viene chiamato

SRY, il quale, poiché è importante nella determinazione del sesso ed è selezionato positivamente,

determina delle differenze tra i due cromosomi, una differenza primigenia che ha portato nel tempo

all a u ulo all i te o di uesto o oso a di e o i he ha o eso uesto o oso a se pre più

diverso dal cromosoma X. Questo ha causato grandi differenze perché nella meiosi i due cromosomi

avevano sempre minori punti di contatto. La meiosi, oltre ad essere il meccanismo che garantisce lo

scambio di porzioni cromosomiche tra i cromosomi, è un meccanismo di riparo del DNA e utilizza tutta

uella atte ia e zi ati a he a atte isti a del ipa o del DNA, a a o he l appaia e to t a punti di

rottura del DNA e cromosomi avviene questi punti di rottura del DNA vengono chiusi e ogni chiusura è un

controllo della bontà della sequenza del DNA, quindi la meiosi è uno dei meccanismi più efficienti nel

controllo della bontà del DNA. Perciò la mancanza di appaiamento ha portato nel tempo a far divergere

sempre di più quei cromosomi tanto che si è creato un accumulo di porzioni di DNA che non è codificante, o

di geni che avevano perso funzione, e queste porzioni nel tempo sono andate perse, venendo eliminate

fisicamente, ciò giustifica le dimensioni ridotte di Y. Dal cromosoma ancestrale da cui si pensa che potesse

avere circa 1000 geni, al momento in cui è cominciata la divergenza tra X Y, mentre X fa tutto ciò che gli

altri cromosomi fanno in meiosi e quindi il numero dei cromosomi è rimasto invariato, il cromosoma Y è

andato via via perdendo geni, tanto che da circa 1000 geni oggi sono stati mappati circa solo 45 geni. Se si

ammette una perdita lineare di geni, alcuni gruppi di ricercatori hanno stimato che il cromosoma Y sparirà

di l appa izio e di uesto

in circa 4 milioni e mezzo di anni. Questa divergenza, qui sex determinal locus, ha

prodotto una serie di eventi tra i quali una riduzione o una perdita totale di ricombinazione, una perdita di

o ati a, l espa sio e dell ete o o ati a, e olt e a igua da e il o oso a Y dei a ife i, igua da

anche il cromosoma W delle specie che hanno un sistema eterocromosomico femminile, è quindi

caratteristico del cromosoma che non ha un omologo. Questo studio della progressiva degradazione cui è

caratterizzato anche il cromosoma W è stato sostenuto, nel 1914, da un zoologo di nome Muller, che definì

Muller’s ratchet.

questa progressiva degradazione Ci sono due laboratori leader, sostenuti da Jennifer

la p i a u aust alia

Marshall-Graves e Jennifer Hughes, a che pensa che il cromosoma Y sia destinato a

u a e i a a,

morire, a differenza della seconda, che pensa che non lo sia. Alle due ricercatrici è stato

chiesto di dare cinque motivazioni per sostenere la propria tesi, la prima afferma che sparisce perché è

tasso di va iazio e e ad u i effi ie te selezio e, io pe de po zio i, fa e do degli

soggetto ad un alto u evide za di uesto deg

studi comparati attraverso il regno animale, ado sia del cromosoma Y che del

so o a he ei a ife i delle evide ze he l Y o i sia più, i fatti i so o spe ie i

cromosoma W. Ci

ui o ed il sesso dete i ato da ge i SRY o o ologhi ad essi che sono presenti su degli autosomi.

Inoltre, laddove il cromosoma Y abbia avuto delle porzioni di cromosomi in aggiunta, queste sono andate

inesorabilmente in contro al degrado. Il primo motivo contro la teoria della morte del cromosoma Y è

legato al tempo in cui il cromosoma non è sparito, poiché se non è sparito in milioni di migliaia di anni

allo a o otivazio e pe ui de a spa i e, a u a otivazio e u po de ole. I olt e ve o he

non va in contro a ricombinazione ma anche il cromosoma Y ha dei sistemi di controllo, infatti se si

o uesti pu ti di ottu a di DNA all i izio della eiosi,

esamina si possono mappare anche sul cromosoma Y

i meccanismi che sono attivi nel mantenere efficiente il DNA nel cromosoma Y e tutti gli altri cromosomi

sono sufficienti anche se il cromosoma Y non va in contro a crossing-over. In 100mila anni di storia

evolutiva dell uo o il o oso a Y u a o va i o t o a u a purifying selection, ovvero i geni presenti in

questo cromosoma sono li da almeno 100mila anni, il che vuol dire che vi è un vantaggio selettivo a

a te e e uell asso iazio e di ge i. Se si gua da o a he i te pi evolutivi, 6 ilio i di a i, il o oso a

Y non ha perso geni. Quello che si sa sul cromosoma Y è che è costituito da un braccio corto e da un braccio

lungo, che ha pochi geni, ma che ha mantenuto due regioni di omologia col cromosoma X che sono

telomeriche e vengono chiamate par1 e par2, nel caso del topo si trova solo par2, e sono le regioni in cui

avviene il crossing-over. Vi sono pochi geni sul braccio corto e poi vi è una regione centrale in cui sono

presenti dei geni importanti per il controllo della spermatogenesi, chiamata AZF, Azoospermia factor, è

vero che alcune situazioni, delle delezioni di questa regione portavano a un mancato sviluppo degli

spermatozoi, il soggetto era quindi sterile per mancanza degli spermatozoi. Nel 1959 il cromosoma Y è il

pe ò sia ell uo o he el topo si vista u a situazio e di

cromosoma per la sex determination, sex

reversal, inversione sessuale, ovvero degli individui che erano cariotipicamente femmine, in realtà erano

fenotipicamente maschi. Quando si sono analizzati da un punto di vista citogenetico questi individui, si è

visto che uno dei cromosomi X portava un frammento del cromosoma Y, e questo era sufficiente a

determinare lo sviluppo delle gonadi in senso maschile. Attorno alla fine degli anni 80, Lovell-Badge e

Goodfellow hanno mappato il punto di rottura e hanno mappato questa regione che hanno chiamato TDF,

testis determining factor, si sono accorti quindi che

quegli individui, cariotipicamente femmine e

fenotipicamente maschi, avevano una traslocazione

dell i te o a io o to o di una porzione di esso nel

cromosoma X, questo era sufficiente a farli diventare

fenotipicamente maschi. La storia va dal 1959 al 1990

quando, sempre analizzando queste situazioni di sex

reversal, il punto di rottura e di traslocazione è stato

individuato con maggior dettaglio, fino ad individuare,

tramite una serie di mappature sempre più nello

specifico, che il fattore determinante è il SRY, Sex

determining Region of the Y, che si trova solo in una regione di 35 Kb, ed è solo questo a determinare un

sex reversal. Queste 35 Kb codificano per un fattore di trascrizioni formato da 223 aminoacidi ma per

essere sicuri che fosse questo un gruppo di ricercatori inglesi guidato da Koopman (che erano già in grado

di prelevare gli ovociti, prelevare gli spermatozoi, metterli in vitro, far avvenire una fecondazione in vitro, e

pe poi t asfe i li ell ute o

coltivare gli embrioni fino allo stadio giusto, di una topolina, che viene chiamata

pseudo-gravida) hanno portato avanti una fecondazione in vitro, e siccome molti ovociti vengono fecondati

da spermatozoi, ci si aspetta che gli embrioni siano maschi e femmine a seconda del corredo cromosomico,

ma in più hanno fatto un trasferimento del gene

SRY, hanno fatto un transgene su questi

embrioni e hanno quindi creato degli embrioni

che cromosomicamente erano XX, ma

L attesa

transgenici per SRY. era che una volta

transfettato questo

gene di 35 chilobasi

in un embrione XX,

se uest e io e si fosse sviluppato come maschio significava che questo

e a il ge e dete i a te il sesso, al e o ei a ife i. Ha o fatto uest espe i e to e hanno

pubblicato, il 9 maggio 1991, il loro lavoro su Nature, con la foto di due topini, uno cromosomicamente XY e

un altro col il gene SRY, e si può notare che fenotipicamente questi due topolini sono identici, per averne la

prova si può osservare lo spazio ano genitale, che nei maschi è più esteso rispetto alle femmine. Per avere

una prova più sicura si possono far arrabbiare i due topini, è risaputo infatti che i topi maschi non mostrano

i testi oli a li t atte go o ell addo e, a el o e to i ui ve go o fatti a a ia e li es o o fuo i, i

e t a i i topoli i ha o us ito i testi oli. U ulti a p ova a livello

questo caso appunto molecolare,

infatti si fa un Southern Blot, e si usa una sonda per mettere

in evidenza la presenza del gene SRY. Questa è la prova

determinante che SRY è il gene determinante nei mammiferi.

Il lavoro mandato a Nature, da Koopman, non fu inizialmente

accettato, perché gli chiesero di avere una dimostrazione del

fatto che questo topino fosse realmente maschio. Pensano

inizialmente di farlo accoppiare con le topoline, ma non

avendo avuto risultati decidono di prelevare il testicolo e

fa e u istologia, ed e e ge he el o f o to t a i due

maschi, a differenza del testicolo del maschio XY, non vi

erano spermatozoi nei tubuli seminiferi di cui è composto il

testicolo, il maschio è quindi sterile perché non vi è spermatogenesi. Si capì così che SRY è il gene della

determinazione gonadica del sesso, ovvero della trasformazione della gonade indifferenziata in testicolo,

a poi h a a l Y, la spermatogenesi non può

avvenire. La gonade indifferenziata è costituita

sostanzialmente da due tipi cellulari, le cellule

germinali e le cellule somatiche. Lo stadio di

lasto isti lo stadio el uale si a ida l e io e

sulla pa te e vi ale dell ute o, si app ofo da

ell epitelio e a a o he si approfonda la

regione della massa cellulare interna è solo quella, porta al differenziamento

dell e io e ve o e proprio, mentre le cellule del trofectoderma, ovvero

uelle he defi is o o l i volu o, o e t a o a fa pa te dell e io e a

sono degli annessi embrionali, quindi man mano che si annida questa regione

andrà in contro a quella che si definisce la trasformazione che porterà alla

formazione del nuovo individuo. Tutte le cellule somatiche deriveranno da

so o p ese ti all i izio della

uno solo di queste due strutture laminari che

e io l

gastrulazione epiblasto. Le cellule germinali non si originano

epi lasto a ve go o o igi ate

dall tramite dei segnali che derivano

dall e tode a ext ae io ale po ta o al u e ellule dell epi lasto

prossimale a seguire un destino differenziativo diverso. Questi segnali

cominciano a influenzare queste cellule, le quali migrano fuori dal corpo

dell e io e, va o a posizio a si fuo i dal o po e io ale, nel

mesoderma extraembrionale, dove cominciano a moltiplicarsi. Il segnale che

a a l espressione

diventa sempre più viola, nella figura accanto, di un gene chiamato che è uno dei

stella

geni che vengono espressi in queste quattro/

cinque cellule che vengono chiamate Primordial

Germ Cells, ovvero le cellule primordiali

segui e l e ig azio e

germinali. Si può, inoltre,

pe h si po ta o all este o del o po

dell e io e, si localizzano come a formare un

bottone vicino ad una struttura chiamata

Lantoide, di preciso vicino la gemma della

Lantoide, nella parte extra embrionale, tutto

questo avviene in 24 ore nel topo. I segnali che

ve go o dall e tode a ext ae io ali so o i po ta ti, l u i o ad oggi studiato dato da u a ole ola

Wnt4, secreto da queste cellule, che si legano a dei recettori di queste cellule portando alla formazione di

una cascata fosforilativa che porta questi due elementi SMAT1-5 e SMAT1-4, fattori di trascrizione, ad

attivare alcuni geni che determinano il destino differenziativo di queste cellule, che vengono quindi

specificate in termini di cellule germinali. Nella regione della

La toide a i fo za e il seg ale u alt a ole ole, ovve o

Wnt2. Nel momento in cui le cellule rispondono al segnale di Wnt4

il primo evento è un evento di polarizzazione, le cellule cambiano

fo a, uesta pola izzazio e l eve to o fologi o he i di a he

queste cellule sono pronte per la migrazione. Cominciano la

ig azio e, si po ta o ui di al di fuo i del o po dell e io e,

anche se ancora oggi non si sa come la polarizzazione avvenga a

livello molecolare. Il primo evento è quindi la migrazione

ell e dode a ext aembrionale, poi nei primi 7 giorni e mezzo fino a 10 giorni e mezzo dalla

fecondazione, dopo essersi moltiplicate cominciano di nuovo a migrare attraverso la struttura evidenziata

dalla uale si ge e e à l i testi o, e dopo ave att ave sato il ese te e do sale, si divido o

in arancione,

in due porzioni, una va a destra e una a sinistra, e queste regioni diverranno le future creste genitali dalle

quali si origineranno le gonadi. La regione che si affaccia al celoma viene chiamata cresta genitale, ma tutta

pe h da uesta egio e si ge e a tutto l appa ato es eto e.

la regione viene chiamata urogenitale,

Quando arrivano nelle creste genitali cominciano a proliferare e a moltiplicarsi, qui siamo a livello di una

di ellule, e a livello ge itale se e fo a o ilio i. Nell epitelio elo ati o a iva o le

decina o trentina

cellule, e anche lo stesso epitelio comincia ad inspessirsi,

sempre attraverso il fenomeno di duplicazione cellulare. Le

cellule germinali e somatiche si duplicano e vanno a costituire

mano a mano che i

la struttura del cordone sessuale primitivo,

cordoni crescono si approfondano sempre di più nella regione

mesodermica, nella quale si va organizzando il Mesonefro e

anche due strutture, evidenziata in rosso e in azzurro, che si

chiamano Dottomesonefrico o dotto di Wolff e dotto

Paramesonefrico o dotto di Muller. Questi due dotti sono

i po ta ti pe h da og u o dei due de ive à tutto l appa ato

genitale interno o maschile o femminile, da quello di Wolff

quello maschile, da quello di Muller quello femminile.

Dopodiché si formano anche i glomeruli renali. Tutta questa

serie di eventi è regolata da una serie di geni, non si conoscono però le relazioni reciproche tra geni e quali

sono i pathway genici che determinano la realizzazione di un evento differenziativo. Al momento si sono

essi i elazio e po hi ge i, u gene target SF1 regolato da GATA4 che agisce su di esso ma anche su

o o o o all attivazio e di uest ulti o a s ate a e u a as ata

MX9, e MX2 che agisce su SF1. Tutti

molecolare di eventi non nota che porta alla trasformazione di questa regione, differenziandola verso la

go ade p i itiva. L eve to diffe e ziativo po ta a fo a e uesta egio e differenziata che si chiama

gonade primitiva, nella quale sono espressi molto marcatamente due geni, Fgf9 e Wnt4 se si marca, con un

l esp essio e di uesti ge i, si può ota e o e uesta sia olto sepa ata l u a

ibridazione in situ,

dall alt a. Questo bilanciamento quantitativo di queste due regioni, mantiene la gonade indifferenziata. Se

un evento esterno, che può essere la temperatura, o qualsiasi altra cosa, o nel caso dei mammiferi SRY si

l esp essio e di

esprime, SRY ha un azione su un altro gene che può essere Sox9, il quale iperattiva FGF9,

cosicché da un punto di vista quantitativo il prodotto di Fgf9 diventa rilevante rispetto Wnt4, inoltre

quantitativamente va a bloccare Wnt4. A questo punto la bilancia si squilibra verso il differenziamento del

sesso maschile, se non vi è questo segnale, nello specifico manca SRY, non vi è un up-regolazione di Fgf9,

perché non viene attivato Sox9 e il risultato è che avrà un predominio Wnt4 e a questo punto la bilancia

pende verso il differenziamento di sesso femminile.

IV LEZIONE

MEMBRANA PLASMATICA : da libro

Il termine rivestimento cellulare o GLICOCALICE è spesso usato per descrivere la zona ricca di

carboidrati sulla superficie cellulare. Questa zona può essere visualizzata con vari coloranti, come

rosso rutenio, oppure sfruttando la sua affinità per proteine che legano i carboidrati chiamate

il

LECTINE, che possono essere marcate con un colorante fluorescente o con qualche altro marcatore

visibile. Il glicocalice contiene anche sia glicoproteine che proteoglicani che sono stati secreti nello

spazio intercellulare e poi adsorbiti sulla superficie cellulare. Una delle funzioni del rivestimento

cellulare è quella di proteggere la cellula dal danno meccanico e chimico e di tenere corpi esterni e

altre cellule a distanza, impedendo interazioni proteina-proteina non desiderate. Le catene laterali di

delle glicoproteine e dei glicolipidi sono enormemente diverse nella loro

oligosaccaridi

disposizione degli zuccheri; sia la diversità che la posizione esposta degli oligosaccaridi sulla

cellulare li rendono particolarmente adatti a svolgere una funzione nei processi cellulari

superficie

di riconoscimento specifico.

Tutte le membrane plasmatiche e alcuni altri tipi di membrana interne contengono quantità

significative di carboidrati associati a lipidi e a proteine ( es. la membrana plasmatica del globulo

rosso consiste, in peso, in circa 40% di lipidi, 52% di proteine e 8% di carboidrati). I carboidrati

sono localizzati sulla superficie esterna e servono come sito di riconoscimento. Alcuni dei

carboidrati di membrana sono legati covalentemente ai lipidi formando i glicolipidi. Queste unità di

carboidrati spesso servono come segnali di riconoscimento per le interazioni fra cellule. Ad

esempio, la componente di carboidrati di alcuni glicolipidi, viene modificata quando la cellula

diventa tumorale. Questa modificazione potrebbe servire a identificare la cellula come cellula

cancerosa da distruggere da parte dei globuli bianchi.

Cosa IMPORTANTE da ricordare: fra gli zuccheri legati sia alle glicoproteine che ai glicolipidi c’è

spesso un gruppo acido che è il gruppo della famiglia degli acidi sialici che si trova anche nelle

1

molecole di adesione neuronali. Le molecole della famiglia della immunoglobuline dette N-CAM

durante lo sviluppo embrionale vanno incontro a un grado di SIALIZZAZIONE crescente e quindi

durante la fase in cui il neuroblasto sta ancora cercando la cellula con cui sinapsare, il numero di

il collo di crescita dell’assone venga

residui di acido sialico è molto grande e questo fa si che

respinto dalle cellule che trova e quindi finche non trova la zone giusta viene respinto da un

processo di repulsione basato su PSA (Poli Sialic Acid) de adesione.

Nella zona corretta in cui deve stabilire la sinapsi vengono attivate delle sialidasi, enzimi che

rompono il legame con acido sialico e la cellula stabilisce i contatti. L’ acido sialico è

l’ ADESIONE o la DE-ADESIONE.

FONDAMENTALE per promuovere Promuove in ogni caso,

REPULSIONE tra le cellule che hanno una gran quantità di residui dello stesso tipo, quindi le

cariche si respingono. Il tipo di glicosilazione sappiamo che può essere a una asparagina, chiamato

N-Linked oppure a una treonina. Importante perché poi i residui di zucchero legati hanno

conformazione diversa e in particolare quelli O-linked (ci sono molti residui di questo tipo nelle

proteine che si devono sporgere tra le cellule) è importante pensare a ritroso immaginando la sintesi

di queste glicoproteine o glicolipidi quindi l’aggiunta corretta del tipo di zucchero che la molecola

lipidica o proteina deve avere e deve avvenire nella sequenza e nel posto corretto. La

GLICOSILAZIONE avviene nel ER.

GLICOPROTEINE : La maggior parte dei carboidrati delle membrane è collegata covalentemente a

proteine, formando glicoproteine. I carboidrati legati sono catene oligosaccaridi che, che di solito

non eccedono 15 unità monosaccaridiche. Un piccolo numero di monosaccaridi può fornire un

alfabeto per generare una grande diversità di messaggi (11 modi diversi di combinare 2 unità di D-

glucosio). Si ottengono messaggi diversi quando tipi diversi di monosaccaridi si collegano in siti

diversi e in numero diverso. Ricordiamoci che i monosaccaridi si possono collegare a livello di

atomi di carbonio diversi per formare oligomeri ramificati. La possibilità di avere diversi quadri di

ramificazione già di per se aumenta enormemente la specificità e diversità dei segnali che gli

oligosaccaridi possono fornire. 2

Nei tessuti sono presenti due classi fondamentali di glicoproteine: quelle che contengono

oligosaccaridi legati mediante legame O-glicosidico agli aa serina e treonina; quelle che contengono

all’ aa asparagina.

oligosaccaridi legati mediante legame N-glicosidico

“O‐linked” “N‐linked”

Oligosaccaridi e

(a)Gli oligosaccaridi legati ad O‐ della glicoforina e di molte altre

glicoproteine, sono legati al gruppo ossidrile di residui di serina (Ser) o

treonina mediante la N‐acetilgalattosamina. I collageni contengono un disaccaride

caratteristico glucosio galattosio legato a residui di idrossilisina (Hyl)

(N.B. Il collagene verrà trattato nel capitolo della matrice extracellulare).

(b) Gli oligosaccaridi N‐legati che si trovano nelle glicoproteine seriche

dei Mammiferi esibiscono varie strutture, ma tutti contengono cinque zuccheri (evidenziati in

all’azoto amidico dell’asparagina

porpora), ramificati e legati (ASN).

Le proteine sintetizzate nei ribosomi che aderiscono al ER sono: proteine transmembrana della

membrana plasmatica, le proteine di secrezione, le proteine che lavorano nei lisosomi, le proteine

che lavorano nel reticolo e nell’apparato del Golgi tutte le altre sono tradotte sui ribosomi liberi e

vengono smistate attraverso processi diversi basati sui segnali amminoacidici che sono segnali di

indirizzamento. Queste proteine della membrana plasmatica a cui si fa riferimento e quelle della

matrice extracellulare che nascono tutte dai ribosomi che si legano al RER c’è una sequenza segnale

che le porta ad attraccare.

Nel RER esiste un controllo di qualità molto fine che è basato sullo svolgimento corretto di molti

processi:

Catalisi del legame S-S tra residui di cisteina, quindi formazione del legame disolfuro; questo

ambiente ossidante PERCHE’ nell’ambiente riducente del citosol le cisteine sono nella

richiede 3

forma SH. Nell’ambiente ossidante, nell’interno del RE che corrisponde all’ambiente fuori della

cellula degli enzimi che catalizzano la formazione dei ponti S-S hanno la possibilità di formare

legami covalenti che sono importanti per irrigidire la zona della proteina e collegare anche 2

monomeri di proteine diversi con struttura quaternaria. Quindi, la formazione dei ponti S-S e

l’inizio della glicosilazione di glicoproteine N-linked.

Ci sono lipidi chiamati DOLICOLO che è portatore di un alberello di zuccheri particolare che viene

inserito in asparagine che sono riconosciute ( non tutte hanno delle sequenza aminoacidiche laterali

con 14 residui di zucchero e all’interno del reticolo c’è

che sono segnali) viene aggiunto l’alberello

una potatura di alcuni zuccheri.

DOMANDA: perché prima se ne inseriscono 14 poi ne vengono tagliati 3? Perché sono importanti

per delle chaperonine che aiutano la proteina a ripiegarsi, per controllare che la forma sia corretta

progressivamente. Quindi c’è un importante controllo di qualità già nel reticolo è fatto da

chaperonine. Se non si riesce a ripiegare come si deve, adesso si sa che il reticolo prima fa dei

tentativi, poi butta fuori il peptide mal ripiegato nel citosol e viene degradato dal proteasoma. Solo

le proteine correttamente ripiegate passano al Golgi. Unfolded protein response è un processo

mediato da molte proteine ed alterato in molte patologie ( fegatosteatosi, fibrosi e diversi processi

tumorali): manca il controllo di qualità nel RE!

Le proteine arrivano al Golgi veicolate da vescicole e nelle cisterne le glicosiltrasferasi e glicosidasi

devono riconoscere quali zuccheri aggiungere e quali togliere e alla fine dopo i processi di

fosforilazione, di aggiunta di gruppi solfato importanti per i proteoglicani e nelle varie cisterne del

golgi c’è Dopo c’è un processo più

progressione di alterazione post traduzionale di proteine e lipidi.

specifico, di smistamento che si svolge nella parte trans golgi per riconoscere spesso tramite un

residuo di mannosio-6-fosfato che è un marcatore di proteine che lavorano nel lisosomi, altre

è sicuro, ma se non c’è

strutture basate su zuccheri ci dicono che è una proteina di membrana e non

nessun segnale particolare, il golgi le spedisce fuori la cellula. Questa secrezione va vista non solo

come i prodotti fuori dalle ghiandole, ma i prodotti delle proteine della matrice extracellulare e

diversi altri prodotti. Talvolta la secrezione viene vista come buttare via sostanze che alla cellula

non è così! E’ un processo che la cellula usa per produrre sostanze che servono o

non servono

fuori la cellula o altrove.

Queste proteine per svolgere il loro ruolo corretto non solo devono avere la sequenza di aa corretti,

ma la sequenza di zuccheri corretti; questo identifica l’apparato del golgi come una struttura chiave

per l’aggiunta corretta degli zuccheri alle proteine e ai lipidi. Molti sbagli di glicosilazione sono

4

associati a disfunzione del corredo enzimatico dell’apparato del golgi. L’aggiunta corretta di

zuccheri contribuisce non solo ad avere un’individuazione di segnale che caratterizzano il tipo di

cellula, ma anche molti altri compiti di tipo strutturale per esempio. Spesso questi zuccheri

interagiscono con proteine, con zuccheri di altre proteine, formano dei CO-RECETTORI, molecole

che collaborano o si respingono.

Molte proteine altamente glicosilate che hanno compiti, se sono proteine secrete di fornire una

struttura viscida che è lubrificante importante per molti apparati. Questo aumenta la possibilità di

interazione con endotelio e vasi sanguigni soprattutto infiammati, che hanno disposto sulla

superficie delle proteine di adesione chiamate Selettine che hanno un dominio extracellulare che

riconosce degli zuccheri. ( Abbiamo legame NON COVALENTE, tra aa e zuccheri, spesso

formando ponti H)

PROTEINE ALTAMENTE GLICOSILATE: PROTEOGLICANI

Proteoglicani

I proteoglicani sono una famiglia di glicoproteine altamente glicosilate, in cui le componenti

glucidiche sono principalmente glicosaminoglicani. Si conoscono le strutture solo di alcuni

proteoglicani, ed anche questi manifestano una diversità notevole.

Le proteine di membrana hanno relativamente poche catene di zuccheri legati, mentre quelli della

matrice extracellulare parecchi. Il compito delle proteine di membrana in ogni caso aiuta a capire il

compito di proteoglicani esterni.

I proteoglicani consistono in una proteina assiale (marrone) e una o più catene di glicosaminoglicani

legate covalentemente ([blu] HS; [giallo] CS/DS). I proteoglicani di membrana possono sia

attraversare la membrana plasmatica (proteine di membrane di tipo I) sia essere legati ad ancore

di GPI. I proteoglicani della matrice extracellulare (ECM) vengono di solito secreti, ma alcuni

5

possono essere scissi proteoliticamente e riversati dalla superficie cellulare (non illustrato).

Glicoproteine e proteoglicani sono entrambi composti in cui 1 catena polipeptidica è legata

covalentemente a diverse sequenze di zuccheri ma la somiglianza finisce qui. Nelle glicoproteine il

peso è dovuto a catene peptidiche perché solo alcuni aa sono legati a ramificazione

oligosaccaridica. Questi residui oligosaccaridici legati alla glicoproteina sono simili a quelli che si

trovano legati a lipidi, alla sfingosina e sono pochi e ramificati.

I p. svolgono compiti diversi. Esiste una proteina centrale ( core protein) a cui sono legati un

numero anche elevato per es. nella cartilagine di lunghe catene di polimeri di zuccheri lineari che

appartengono alla famiglia dei glicosaminoglicani. La DIFFERENZA legati a residui di

asparagina poi nella matrice c’è un residuo di innesco con quattro zuccheri che è lo stesso per tutti i

proteoglicani, il tipo di catena legata è diversa. Queste sono strutture polari che hanno carica

negativa, sono polianioni che contribuiscono a richiamare acqua ma anche peptidi o ioni ( compiti

che vanno dallo strutturale a legame in certe regioni dello spazio di ioni e peptidi.

DOMANDA: QUALI SONO I COMPITI DEI PROTEOGLICANI DI MEMBRANA? Sono

importanti corecettori per segnali diversi; senza la loro presenza il recettore per un determinato

segnale non si attiva. Il compito dei proteoglicani di membrana come corecettori è estremamente

importante. Esistono diverse tipologie di proteoglicani di membrana: quelli che hanno la proteina

centrale che è transmembrana ha il terminale che può interagire con le proteine che si trovano sotto

la membrana e questa ha 2 tipi diversi di glicosaminoglicani, anche se 3 catene di un certo tipo e 2

catene di altri tipi anche con poche catene diversa organizzazione; oppure proteine che già nel

loro nome hanno àncora lipidica che le inserisce nel foglietto esterno, Glipicano perché ha una coda

di GPIglicosilfosfatidilinositolo. Coda può essere rimossa da enzimi specifici e questo

proteoglicano può andare in soluzione. Queste code di GPI preferiscono stare tra i glicosfingolipidi

e colesterolo, quindi preferiscono i RAFT.

Questi GLIPICANI in poche catene di solito di eparan solfato hanno elevato numero di gruppi

solfato quindi polianionico,starà preferenzialmente nella zone dei raft. 6

Anche nella matrice extracellulare si trovano dei proteoglicani ma un numero diverso di catene;

queste di decorina è un proteoglicano che collabora con collageni; decorina perché decora le fibre

di glicogeno e altri hanno un numero di residui collegati che può essere elevato ed è fondamentale

per la quantità di acqua che richiama e quindi per la capacità che hanno i dischi intervertebrali di

attutire le compressioni perché questa acqua che viene richiamata forma una tensione di turgore che

bilancia le compressioni e con l’invecchiamento l’usura intervertebrale e la capacità di attutire gli

urti diventa sempre minore.

Proteoglicani

Sono costituti da un asse proteico a cui si lega covalentemente un elevato numero di

glicosaminoglicani, che costituiscono circa il 90% della molecola di proteoglicani.

Solitamente alla stessa proteina si lega un singolo tipo di glicosaminoglicani, ma può

essere presente anche più di un tipo, come ad es. nel proteoglicano della cartilagine,

che contiene quasi in uguale misura condroitin solfato e cheratan solfato.

all’asse

I glicosaminoglicani si legano proteico sia mediante legame N‐glicosidico

analogo a quello delle glicoproteine, sia mediante legame O‐glicosidico a cui può

partecipare il monosaccaride xiloso oltre a due molecole di galattosamina.

Il compito dei GLICOSAMINOGLICANO non è solo richiamare acqua altrimenti basterebbe per

es. solo l’acido ialuronico per fare questo. La diversità dei GAG indica che giocano un ruolo

importante e diverso tra di loro. La maggior parte di questi polimeri sono polimeri di dimeri ossia

l’unità che si ripete è un dimero. Possono essere legati a serina ma altri a residui di treonina (

possibilità di avere legami N-linked o O-linked)

I G. sono una classe eterogenea di macromolecole glucidiche di grande importanza biologica. Sono

semplici tra i quali i più importanti sono gli acidi uronici [quali l’acido

polimeri derivati da zuccheri

( in cui la funzione alcolica in posizione C2 è sostituita da una carbossilica) o l’acido

D-glucuronico

L-iduronico, un epimero del 1°] e gli amino zuccheri glucosamina e galattosamina ( in cui la

funzione alcolica in posizione C2 è sostituita da una funzione aminica la quale può a sua volta

essere acetilata come nella N-acetilglucosamina) o solforata, come nella N-solfatoglucosamina). Il

dalla ripetizione per un elevato numero di volte di un’unità

glicosaminoglicano è quindi costituito

disaccaridica fondamentale, formata da un’esosamina e da un acido uronico. Alcuni

glicosaminoglicani di grande importanza biologica contengono nella molecola oltre agli zuccheri

ed acidi uronici, elevate concentrazioni di gruppi solforici. A causa della presenza di gruppi acidi,

carbossilici o solforici, queste molecole si comportano come polianioni e sono quindi fortemente

basofil e spesso metacromatiche. 7

GAG acronimo di glicosaminoglicano perché le unità che si ripetono sono date da 2 zuccheri che

è l’aminozucchero che può

possono essere legati in alfa o beta. Uno di questi zuccheri essere

glucosamina o galattosamina; glucosio e galattosio sono isomeri strutturali. Uno zucchero è un

L’altro zucchero è un acido derivato dallo zucchero: OH sostituito da gruppo acido

amino zucchero,

e questo può essere inserito sopra o sotto l’anello. Acido uronico o iduronico acido glucuronico o

iduronico sono 2 isomeri strutturali. Il fatto di avere un polimero basato sulla ripetizione di questi 2

zuccheri è un polianione.

Si distinguono quattro gruppi principali di GAG secondo i loro zuccheri, il tipo di legame tra

zuccheri e il numero e la posizione di gruppi solfato: 1) ialuronano, 2) condroitin solfato e

dermatan solfato 3) eparina solfato 4) cheratan solfato.

Il più primitivo dei GAG che è prodotto anche dai batteri è un lunghissimo polimero, acido

ialuronico, composto da migliaia di ripetizioni (50000) di N-acetilglucosamina e acido glucuronico.

Componente della matrice l’unico che non è legato covalentemente a proteine per formare i

proteoglicani ma è arrivato indirettamente per formare megacomplesso di acido ialuronico con

proteoglicano che formano reti macromolecolari molto estese importanti per riempire gli spazi della

matrice, ruolo importante nell’ambiente extracellulare!

Gli altri polimeri possono subire ulteriori modificazioni chimiche. Tutto avviene nel golgi ( enzimi

che aggiungono il gruppo solfato).

Eparina un tipo di GAG che viene esocitata in caso di allergie dai macrofagi per es. ma nei

proteoglicani troviamo un composto simile con meno gruppi solfato eparansolfato. Nomi che

e anche l’acido possono avere gruppi solfato

indicano che l’aminozucchero in certi casi al posto

dell’OH. La diversità avviene dal tipo di zucchero dal grado di solfatazione, o dal tipo di legame: se

Non c’è bisogno di sapere la formula ma il dimero che si ripete in questi polimeri,

è alfa o beta.

l’aminozucchero e l’acido derivato dagli zuccheri, la variabilità viene sia se è glucosio o galattosio,

se è acido glucuronico o iduronico, variabilità nel tipo di legame e dal grado di solfatazione.

Sono stati identificati in alcuni tessuti (derma,cartilagine) hanno una concentrazione diversa di

questi zuccheri a seconda della posizione del gruppo solfato; Condroitilsolfato 2 tipi a seconda della

il più solfatato è l’eparina. Anche i GAG ricchi di eparansolfato che

posizione dei gruppi solfato

troviamo in questi proteoglicani di membrana soprattutto, hanno parecchi gruppi acidi.

Abbiamo gruppi acidi nell’aminozucchero e nell’acido: QUALE E’ LA CARATTERISTICA DI

QUESTO E COSA SPIEGA IL LORO RUOLO COME CO-RECETTORE? Il corecettore è una

proteina di membrana che collabora con un recettore specifico per innescare una certa risposta di

tipo di traduzione del segnale. Questi sono i fattori di crescita che sono descritti in siti degli

zuccheri. Sono importanti per regolare molti processi durante lo sviluppo embrionale, di guarigione

delle ferite, di progressione neoplastica ecc ecc. perché ( ed ecco il ruolo dei GAG che viene visto

anche nei libri di b cellulare come una specie di albero con dei rami su cui sono appesi i frutti che

sono i segnali, perché i segnali per essere innescati, il cambiamento di conformazione nel recettore,

che poi fa partire la trasduzione) devono essere presentati con un orientamento particolare. Questi

segnali sono piccoli peptidi (PGF; HGF) di solito erano moduli di grandi proteine che sono state

frammentate da proteasi quindi questi segnali sono dei peptidi che devono avere una conformazione

tridimensionale che è COMPLEMENTARE alla nicchia di aa del recettore e solo quando si

8

stabilizza questo legame il recettore fa partire il segnale. Il compito del proteglicano sembra essere

quello di legare temporaneamente il peptide segnale e di orientarlo nel modo giusto per far

innescare una trasduzione del segnale.

La figura fa vedere 1 proteoglicano di membrana e 1 di matrice che può servire per deposito

temporaneo di segnale. Siccome questi sono solubili, se non ci fosse una struttura che li ferma

andrebbero nei liquidi tessutali; se fosse un tessuto infiammato fa l’edema andrebbe ovunque. Se

invece c’è la necessità che il segnale sia disponibile vicino ad alcune cellule e non ad altre il trucco

è quello di avere delle strutture che legano temporaneamente senza legame molto forti molti

segnali. Fra le cariche del gruppo OH, solfato e carbossilico, la possibilità di formare legame ionico

o ponti H con il peptide segnale e questo permette di fare una specie di mappa di distribuzione di

segnali diversificati. Molti dei proteoglicani di membrana che servono da corecettori

Proteoglicani della membrana ad eparan solfato (HSPgs)

Gli HSPGs giocano ruoli cruciali, regolando le vie di

segnalamento del differenziamento, quali le vie Wnt,

Hedgehog, Transforming Growth Factor‐β, e Fibroblast Growth Factor.

Dal libro: legano varie molecole segnale secrete, come certi fattori di crescita proteici,

controllandone diffusione attraverso la matrice, raggio di azione e vita, oltre ad aumentare o inibire

la loro attività di segnalazione. Per esempio, le catene di eparan solfato dei proteoglicani legano i

fattori di crescita dei fibroblasti, che stimolano vari tipi cellulari a proliferare; questa interazione

oligomerizza le molecole dei fattori di crescita, rendendoli in grado di legare fra loro e attivare i

loro recettori di superficie, che sono tirosina chinasi trans membrana. Nelle risposte infiammatorie,

HSPgs immobilizzano chemochine sulla superficie endoteliale di un vaso sanguigno in un sito di

infiammazione; in questo modo le chemochine restano lì stimolando i globuli bianchi a lasciare il

sangue e a migrare nel tessuto infiammato. Anche se nella maggior parte dei casi le molecole

segnale si legano alle catene di GAG del proteoglicano, ciò non avviene sempre. Alcuni membri

della famiglia del fattore di crescita trasformante (TGF b) si legano alle proteine del nucleo di

proteoglicani della matrice, fra cui la decorina; l’attacco alla decorina inibisce l’attività del

diversi

fattore di crescita. Molecole segnale si possono legare anche a proteine fibrose della matrice: il

fattorei di crescita vascolare endoteliale (VEGF), per es. si lega alla fibronectina. I proteoglicani si

attaccano, regolandone l’attività anche ad altri tipi di proteine secrete, compresi enzimi proteolitici

(proteasi) e inibitori delle proteasi. In questo modo hanno un ruolo nel controllo sia

dell’assemblaggio che della degradazione di altri componenti della matrice extracellulare, tra cui l

collageno. 9

Proteoglicani della membrana ad eparan solfato (HSPgs) 3 classi

“core”

Le proteine dei SINDECANI sono proteine transmembrana che contengono un

dominio citoplasmatico C‐terminale altamente conservato. Le catene di eparan solfato

(HS) si legano a residui di serina distanti dalla membrana cellulare. Alcuni sindecani

contengono inoltre catene di condroitin solfato (CS) collegati a residui di serina vicini alla

membrana. “core”

Le proteine dei GLIPICANI sono proteine globulari stabilizzate da legami disolfuro

un’ancora

(S‐S) ancorate alla membrana da di glicosilfosfatidilinositolo (GPI). Delle

catene di eparan solfato (HS) si legano a residui di serina adiacenti alla membrana plasmatica.

I PERLECANI sono HSPGs che vengono secreti e contengono catene di HS.

Proteoglicano di membrana Sindecano‐4 ‐2, ‐3, ‐4)

La proteina assiale di tutti i proteoglicani di tipo sindecano (sindecan‐1, e attraversa

la membrana plasmatica e dimerizza mediante il dominio citoplasmatico . Le proteine assiali dei

sindecani hanno dimensioni che vanno da 20,000 MW (sindecano‐4) a

45,000 MW (sindecano‐3) a causa di differenze nei loro domini extracellulari, ma hanno domini

di attraversamento della membrana e citoplasmatici simili. I sindecani contengono tre catene

ad eparan solfato e talvolta condroitin solfato. 10

Modulazione dell’attività del “Fibroblast Factor”(FGF)

growth da parte dei proteoglicani ad eparan

solfato

Il FGF libero non è in grado di legarsi ai recettori del FGF sulla membrana plasmatica. Il legame

del FGF alle catene di eparan solfato come quelle del sindecano presente sulla superficie cellulare

induce una modificazione conformazionale che permette al FGF di legarsi ai suoi recettori. Anche il

FGF legato a catene di eparan solfato rilasciate mediante proteolisi dei proteoglicani della matrice

è in grado di legarsi ai recettori per il FGF. Il legame del FGF a proteoglicani ad eparan solfato

della matrice extracellulare può anche proteggere il fattore di crescita dalla degradazione e formare

un serbatoio per FGF attivo.

I glipicani (a sn.) contengono un dominio N‐terminale globulare che è stabilizzato da legami

disulfuro. I siti di legame per i glicosaminoglicani (GAGs) sono localizzati vicino al C‐terminale, al

un’àncora

quale è attaccata di glicosilfosfatidilinositolo (GPI) che collega la

L’ancora

proteina assiale del glipicano alla membrana cellulare. di GPI può essere scissa e in

questo modo questo proteoglicano ad eparan solfato (Heparan sulphate, HS) viene rilasciato

dalla cellula.

I sindecani (a destra) sono proteine transmembrana di tipo I che hanno fino a 5 siti

all’N‐terminale

di legame per i GAGs. I sindecani possono avere legati polimeri di HS vicino del

dominio extracellulare e, in alcuni casi, condroitin solfato (CS; non illustrato) e

dermatan solfato (DS, non illustrato) vicino alla superficie cellulare. Anche i sindecani possono

essere versati mediante scissione proteolitica. 11

Funzione dei glipicani nel segnalamento mediato da fattori di crescita

I glipicani funzionano come proteine a bassa affinità verso le sostanze morfogenetiche secrete. I gli

“Transforming

picanimantengono molecole di segnalamento come WNT, Hedgehog (Hh) o Growth

Factor‐

“(TGF) alla superficie cellulare a livelli tali da attivare i recettori di segnalamento ad alta affinità e

da l’attivazione

permettere dei geni bersaglio. b | In assenza della proteina centrale del glipicano o dell

e l’a

catene di glicosaminoglicani (GAG) i livelli di agenti morfogenetici alla superficie sono ridotti e

ttività delle

vie di trasduzione di segnale diminuisce. c | Quando i glipicani sono sovraespressi, i livelli di agenti

dell’aumentata

morfogenetici alla superficie cellulare sono elevati a causa capacità delle ulteriori ca

tene di dell’equilibrio

GAG. La capacità di segnalamento potrebbe essere ridotta a causa dello spostamento

fra

l’attivazione del recettore di segnalamento e il legame ai GAG. d | I glipicani possono essere rilascia

ti dalla dell’ancora

superficie cellulare mediante clivaggio mediato da Notum a glicosilfosfatidilinositolo (

GPI)

DOMANDA DEL CORSO DI BIOTECNOLOGIE: Descrizione proteine trans membrana tipo I, II,

III, IV cosa è? Terminologia che si usa per le proteine trans membrana che attraversano una sola

volta o più volte, che hanno N-terminale dentro, o COOH fuori o il contrario. Questa terminologia

indica l’orientamento della proteina dentro la membrana. Dato che N-terminale è il primo che viene

sintetizzato la modalità di inserimento di una proteina nella membrana del reticolo nel momento

della traduzione è totalmente diverso se la proteina quando lavora è una di quelle che ha N-

terminale fuori o C-terminale fuori.

SINDECANI: sono rafforzati da ponti S-S e a seconda della collaborazione con il tipo di segnale

che arriva alcuni hanno catene con condroitinsolfato vicino la superficie cellulare. La scissione

proteolitica indica che in certi momenti il proteoglicano può andare in soluzione.

RAFT: ambiente diversificato della membrana, sono strutture dinamiche, esempio è quello della

cellula dell’intestino tenue Versante apicale dove si svolge la fine della digestione e l’assimilazione

di tante sostanze. Ambiente pericoloso per la cellula stessa perchè ricco di Sali biliari; tutte le

l’ambiente del

membrane delle cellule devono proteggersi dal lume intestinale, la presenza di

enzimi, e proteine diverse nei versanti apicali e basali. Questa eterogenicità di funzione richiede che

il RE tramite il Golgi indirizzi le proteine del versante apicale verso il versante apicale e quelle del

12

versante basolaterale al versante basolaterale, quindi con problemi di smistamento di proteine in

modo specifico. È un portale di ingresso per agenti patogeni, riunione in certe zone della membrana

di proteine recettoriali per certi segnali che devono essere attivate in alcune zone e non in altre e

smistamento di proteine verso i vari luoghi della cellula.

Ruolo nello smistamento corretto di proteine ma NON solo le proteine, anche i lipidi, il colesterolo,

sfingolipidi nelle varie membrane, nei vari versanti di membrana.

I raft sono vettori per inserire la quantità corretta di colesterolo nelle varie membrane e lo

smistamento degli sfingolipidi.

STRUTTURA SFINGOLIPIDI: lipidi basati su un aminoalcol che ha già di suo la lunghissima

catena alifatica solo con un gruppo doppio. E’ apolare. La sfingosina ha già una lunga catena

apolare. Quando la sfingosina forma dei legami amidici con un acido grasso si forma un composto

l’acido grasso

che appartiene alla famiglia dei ceramidi, normalmente è lungo e saturo. Abbiamo

una delle caratteristiche più importanti degli sfingolipidi, ( lunghe catene sature) la testa di questo

amino alcool, il gruppo OH allora può legarsi a tipi diversi di molecole. Una di queste è la

fosforilcolina la stessa testa che troviamo nei glicerol lipidi che si chiama fosfatidilcolina. Il

ed è l’unico fosfolipide

componente principale della mielina si chiama sfingomielina derivato dalla

nell’ambito della struttura anfipatica

sfingosina, tutti gli altri non hanno gruppi polari qundi non

hanno gruppi fosfato e sono glicosfingolipidi hanno degli zuccheri legati, alcuni sono molto

semplici, 1-2 zuccheri legati, altri molto complessi, con quantità di residuo di acido sialico molto

diversi tra loro. Molti possono essere ulteriormente solfatati quindi troviamo delle famiglie e

sottofamiglie molto diversificate. NANA è l’acronimo di acido sialico. La varietà di quantità di

zuccheri attaccati a lipidi conferisce alle varie zone del cervello la capacità di conduzione degli

impulsi nervosi molto diversificati; molte patologie sono legate a questo problema della mielina.

Sfingolipidi più complessi sono identificati nel SN, ma sono presenti in tutte le cellule, in alcuni

apparati sono espressi in modo piuttosto elevato.

Per es.: un trucco che le membrane dell’intestino utilizzano per difendersi (o anche dello stomaco)

da pH non neutro sono le sostanze mucificanti, come possono essere quelle necessarie ad assorbire i

grassi quindi gli acidi biliari. Una delle caratteristiche di molti lipidi di membrana sono derivati dal

glicerolo ma con legame ETERE e non estere con acido grasso; l’altro è avere degli sfingolipidi.

Questi sono lipidi che non vengono digeriti dalle lipasi che arrivano dal pancreas, conferiscono

resistenza alle membrane delle cellule. Il ruolo nell’ambito della propagazione del sistema nervoso,

possono servire da isolanti oppure quelli che hanno la mielina ad es. mentre i gangliosidi con molti

gruppi di acido sialico avendo tante cariche negative richiamano cationi contribuiscono a una

concentrazione di cationi a ridosso della membrana e crea un campo elettrico particolare quindi

hanno dei compiti a seconda del tipo di sfingomielina, gangliosidi.

Importante: sono potenzialmente riconosciuti da proteine che legano gli zuccheri, famiglia delle

lectine che permettono di richiamare alcune cellule richiamo dei linfociti agli organi linfoidi

secondari.

I linfociti stanziati nei linfonodi locali che hanno dei vasi sanguigni con delle caratteristiche di

adesività particolare per richiamare alcuni linfociti non altri e questa selezione viene fatta in base

alle selectine. Le cellule endoteliali delle venulesono strutture che permettono un allentamento

13

della giunzione tra cellule endoteliali che permette la transmigrazione dei globuli bianchi ed il loro

endotelio immagazzina sotto la membrana in vescicole di secrezione di quella regolata proteine di

inserisce assente, perché l’endotelio non

adesione che all’accorrenza nella membrana perché non sia

deve ostacolare il flusso del sangue, deve essere molto appiattito e non avere irregolarità per non

creare turbolenza nel sangue e non deve rallentare il flusso del sangue richiamando i globuli bianchi

alla parete. Se invece nella zone c’è stato un danno, cui c’è da riparare quella zona danneggiata

per

allora l’endotelio si attiva e questa attivazione è anche morfologica la cellula invece di essere

di tipo prismatico, sempre più larga che alta e diventano “appiccicose”

sottilissima diventa quasi

cioè viene inserito sulla loro membrana delle molecole che sono in grado di richiamare i vari

globuli bianchi in sequenze molto specifiche per far uccidere i batteri, fagocitare le cellule morte e

da richiamare neutrofili, macrofagi…) C’è da

richiamare i fibroblasti per ricostruire il tessuto (c’è

l’edema delle ferite

far uscire il plasma: fuoriuscita di plasma che va a diluire ma che ha anche

altre funzioni: fornire ossigeno in soluzione e nutrimento. Il siero è plasma dopo che il fibrinogeno

è passato a fibrina ( ragnatela sottile su cui i fibroblasti saliranno per ricostruire il tessuto). Il liquido

cosa è? È tutta la parte del sangue che porta nutrimento all’organismo, tutte le proteine plasmatiche

che portano lipidi, ferro, ecc.. e perché serve il nutrimento? Serve alle cellule per riparare il tessuto.

L’edema serve per compito trofico, serve per diluire le tossine delle cellule morte. Quindi fuoruscita

di plasma, poi Richiamo di piastrine e globuli bianchi, poi guarigione delle ferite che viene sfruttata

dai tumori che simulano una ferita che non guarisce mai.

I glicolipidi si stabilizzano con il colesterolo membrana. I RAFT forma una specie di rete più o

meno lubrificante intorno a certe proteine creando microambiente idrofobico particolare che

condiziona la funzione della proteina.

Ci sono delle proteine che hanno code GPI che stanno bene nei raft (le chinasi ad esempio stanno

bene nei raft, mentre le fosfatasi fuori dai raft), altre invece hanno 1 o 2 code sature o insature

(questo fa la differenza). Nonostante gli sfingolipidi si dispongono nel foglietto esoplasmico (quello

rivolto verso l’esterno) le strutture che conosciamo come raft hanno anche nell’ambiente interno dei

glicerolipidi particolarmente ricchi di lunghe catene sature che ben si organizzano talvolta anche

inserendosi tra le code dell’ altro foglietto dei lipidi nell’ambiente extracellulare. Quindi la

caratteristica è di avere in un foglietto e nel’altro una grande percentuale di lipidi che hanno catene

quindi sono dritti. L’inserimento del colesterolo nella membrana non è casuale

lunghe e sature

ma il colesterolo si stabilizza soprattutto con le catene dritte quindi è concentrato nella zone che

darà origine a questi raft. Molte chinasi si dispongono a livello dei raft, a livello del foglietto interno

e quindi dei processi di trasduzione dei segnali mediati da chinasi sono scatenati dalla zona ricca di

sfingolipidi e colesterolo.

CONFERENZA: lipidi e fosfolipidi sono sintetizzati nel reticolo liscio, sfingolipidi nel golgi. La

membrana dei mitocondri, perossisomi, nucleo ecc. i lipidi li ricevono direttamente dal RE senza

passare dal golgi perché ci sono proteine o vescicole specializzate per smistare i lipidi. Le proteine

collegate al citoscheletro di actina per cui si hanno strutture che collegano proteine con altre. Si

formano queste piattaforme miste lipidi/proteine di segregazione di zona con l’ambiente esterno.

Martinì esperto nel ruolo dei raft con interazione con virus, proteine prioniche. Nei problemi che

riguardano i raft, come si fa a dimostrare che esistono davvero, quali sono le proteine che hanno

bisogno dei raft? 14

TECNICHE ANALITICHE: per isolare i raft, lipide resistente ai detergenti, scioglieva tutti gli

altri grassi, ma lasciava nella membrana, struttura ricca di colesterolo e sfingolipidi che si credeva

fossero i raft; queste strutture rimanevano incastrati affianco le proteine. Questo tipo di definizione

di raft( struttura resistente ai detergente) non convince molte persone perché il trattamento con i

detergenti provoca una aggregazione quasi fasulla di molti lipidi. Altri sistemi dato che il

utilizzo

colesterolo è molto concentrato nei raft di ciclodestrine per estrarre colesterolo, quindi

distruggere la struttura dei raft e vedere come le cellule reagiscono.

TECNICA FRAP che si basa su marcatura con fluorocromo che si lega in modo specifico a Lipidi

senza essere tossico per la cellula viene identificato una zona specifica della membrana dove questo

lipide si concentra e dopo si usa un sistema che disturba la distribuzione di quel lipide e si vede la

fluorescenza come scompare per poi formarsi in altri momenti.

Smistamento specifico di molecole nei versanti della membrana del golgi. Ci sono 2 teorie: si

spostano le vescicole con le proteine modificate; sono gli enzimi che si spostano.

Il lavoro del TRANS golgi è importante per spedire le proteine o i lipidi nel posto giusto.

Quali sono le piattaforme di riconoscimento di certe proteine? L’ancora di GFI è vista come un

segnale di localizzazione apicale e queste proteine è stato visto nel golgi si formano in zone ricche

si è cominciato a vedere che i raft si formano nell’apparato di golgi come

di sfingolipidi

piattaforme di smistamento delle proteine apicali. Dal lume del golgi gemmano vescicole che hanno

all’interno dei domini di proteine che finiscono fuori dalla cellula. Nell’ambiente interno del golgi

ci sono proteine che riconoscono zuccheri che aiutano a selezionare proteine in base al tipo di

zucchero che hanno legato. Le proteine a seconda del numero di residui di aa che hanno possono

essere escluse o incluse nei raft perché ci deve essere una compatibilità di idrofobicità tra aa del

dominio che attraversa la membrana e la lunghezza della coda. Quindi stesso spessore tra lipidi e

proteine. 15

MUCINE

Le mucine possono essere:

 glicoproteine fortemente O‐glicosilate che si trovano nelle secrezioni mucose

 glicoproteine transmembrana della membrana plasmatica che

hanno la frazione glicanica esposta alla superficie cellulare.

Le mucine delle secrezioni mucose possono essere grandi e

polimeriche (mucine formanti gel) o più corte e monometriche (mucine solubili).

Molte cellule epiteliali producono mucina, ma le mucine formanti

gel sono prodotte soprattutto dalle cellule caliciformi o mucipare

dei tratti tracheobronchiale, gastrointestinale e genitourinario.

Nelle cellule caliciformi, le mucine sono immagazzinate

intracellularmente in granuli di mucina dai quali possono essere

secrete rapidamente in risposta a stimoli esterni.

La caratteristica tipica delle mucine è la presenza di segmenti

“variable

peptidici ripetuti chiamati regioni di number of

repeat” (VNTR)”

tandem che sono ricche di siti accettori di

hanno’abbondanti

treonina‐PO‐glicano e mucina O‐glicani

che comprendono 80% della molecola in peso.

Le ripetizioni a tandem sono di solito ricche di residui di

prolina che sembrano facilitare la glicosilazione O‐GalNAc.

Le mucine possono avere centinaia di glicani O‐GalNAc legati

a residui di serina o treonina nelle regioni VNTR.

L’aggregazione di glicani O‐GalNAc induce le glicoproteine “spazzola bottiglie”

muciniche ad adottare una conformazione estesa simili ad una tipo per pulire le

Modello simplificato di una mucina secreta di grandi dimensioni. La regione VNTR

(“variable repeat”,

number of tandem molto ricca di serina e treonina e prolina,è “spazzola

altamente O‐glicosilata; in questo modo il peptide assume una conformazione a

bottiglie”.

per Centinaia di O‐galNAc glicani con molti tipi di struttura diversi, possono

essere legati ai residui di serina o treonina nei domini VNTR. Le regioni ricche di cisteina

alle estremità delle molecole sono coinvolte nella formazione di legami disulfuro

formando polimeri di grandi dimensioni di diversi milioni di Dalton. I domini D hanno

somiglianz con il fattore di von Willebrandt e sono coinvolti nella polimerizzazione 16

RAFTS LIPIDICI I rafts lipidici sono microdomini ricchi in

sfingolipidi, colesterolo e proteine di membrana

che si trovano nel foglietto esterno della

membrana plasmatica.

il ila e lipidi o u po’

Poiché, nei rafts, più

spesso, rispetto al normale, alcune proteine di

membrana vi si accumulano.

i odo i i ‐ lipidi i ‐ posso o esse e

I rafts

considerati come fasi di separazione transitorie

nel doppio strato lipidico in cui si concentrano gli

sfingolipidi.

La presenza di rafts lipidici è stata dimostrata da

un elevato numero di prove sperimentali.

afts lipidi i

Si pensa che la membrana plasmatica delle cellule animali contenga molti (~70 nm di diametro).

La maggior parte delle molecole lipidiche nelle membrane cellulari sono disposte in modo casuale nel

monostrato lipidico in cui risiedono. Le forze di van der Waals di attrazione, però, fra le code di acidi grassi

vicini non sono sufficientemente selettive da tenere insieme gruppi di molecole di questo tipo. Tuttavia, per

alcune molecole lipidiche, come gli sfingolipidi, che tendono ad avere catene di acidi grassi lunghe e sature, le

forze di attrazione possono essere sufficientemente forti da trattenere transitoriamente molecole adiacenti

vicine formando piccoli microdomini.

Dato che le catene di idrocarburi dei lipidi, lì concentrati, sono più lunghe e più dritte delle catene di acidi grassi

i afts so o più spessi delle alt e zo e del ila e

della maggior parte dei lipidi di membrana, e sono meglio

in grado di accomodare alcune proteine di membrana, che tendono quindi ad accumularsi in quelle regioni.

I uesto odo, si pe sa he i afts lipidi i –

organizzino tali proteine sia concentrandole per il trasporto in

‐ o e fa o ua do

piccole vescicole, sia permettendo alle proteine di funzionare in modo integrato

convertono segnali extracellulari in segnali intracellulari.

La maggior parte delle molecole lipidiche in un monostrato si muovono in torno indipendentemente da quelle

dell’alt o o ost ato. ei afts lipidi i, le lu ghe ate e id o a u i he degli sfi golipidi di u

Tuttavia,

o ost ato i te agis o o o uelle dell’alt o o ost ato. Pe iò, i due o ost ati di u aft lipidi o

interagiscono mediante le loro code

lipidiche.

I rafts lipidici potrebbero mediare lo

smistamento (sorting) di

glicosfingolipidi e proteine ancorate

mediante GPI alla membrana

plasmatica apicale.

La membrana plasmatica apicale di

molte cellule è enormemente

arricchita di glicosfingolipidi che

aiutano a proteggere questa

superficie esposta dal danno ad

esempio provocato dagli enzimi

digestivi e pH acido in siti come lo

sto a o o il lu e dell’i testi o. 1

Anche proteine della membrana plasmatica che sono legate al bilayer lipidico da un ancora di

glicosilfosfatidilinositolo (GPI), si trovano esclusivamente nella membrana plasmatica apicale. Se si

DNA i o i a te pe lega e u ’ancora

usano tecniche di di GPI ad una proteina che normalmente sarebbe

consegnata alla superficie basolaterale, la proteine viene invece consegnata alla membrana apicale.

Si ritiene che le proteine con ancora di GPI vengano

dirette alla membrana apicale perché sono associate ai

gli osfi golipidi ei lipidi i he si fo a o ella

rafts

membrana della rete trans del Golgi.

A he le p otei e di e a a o do i i t a s‐

membrana insolitamente lunghi si accumulano nei

afts . I olt e, i afts p efe e zial e te o te go o

p otei e GPI‐a o ate e al u e proteine che legano

carboidrati (lectine) che possono aiutare a stabilizzare

le membrane.

Una volta che hanno selezionato il loro carico caratteristico di

molecole, i rafts gemmano dalla rete trans del Golgi in vescicole

di trasporto destinate alla membrana plasmatica apicale.

t a s‐ e a a

Proteine di membrana con segmenti

sufficientemente lunghi si distribuiscono preferenzialmente nei

rafts e vengono smistate in vescicole di trasporto nella rete

trans Golgi e trasportate in vescicole alle loro destinazioni

finali. In assenza di segnali di indirizzamento specifici, le

proteine sono trasportate alla membrana plasmatica mediante

secrezione costitutiva. In alternativa, le proteine possono

essere spostate dalla via di secrezione costitutiva e marcate per

essere indirizzate ad altre destinazioni, come ai lisosomi oppure

alla secrezione regolata dalle cellule.

RAFTS LIPIDICI E TRASDUZIONE DEI SEGNALI

I rafts hanno un ruolo importante nella risposta localizzata delle cellule a tanti segnali. Molti processi di

trasduzione del segnale avvengono in zone molto ricche di glicolipidi e di colesterolo.

Ci sono già tanti processi di trasduzione del segnale che si sa essere collegati con la localizzazione del recettore

specifico e molti di questi sono dei recettori per le IgE coinvolti nei processi di allergia e di attivazione del

linfociti T e B.

Il ruolo dei lipidi e dei rafts non è solo basato su una barriera impermeabile, molto più di quella dei glicolipidi,

a l’i po ta za si ede ella e essità he ha o le ellule di o u i a e le u e o le alt e. Il g uppo Fa ti i,

molto coinvolto nello studiare il ruolo dei rafts anche in terapia, afferma che il ruolo dei rafts va visto nel

campo della risposta ai segnali esterni e alla necessità di distribuire, in modo non casuale, sulla membrana, dei

recettori e delle proteine, spesso delle fosfatasi, che potrebbero interferire con la durata del segnale.

La possibilità di tenere separate le chinasi dalle fosfatasi è una delle modalità per permettere ad un segnale di

i a e e atti o pe pa e hio te po. A he la possi ilità di fa o i e l’agg egazio e dei e etto i he spesso

e de l’a ie te dei afts pa ti ola e te ido eo.

necessaria per la fosforilazione delle loro code, 2

Si ha, quindi, una descrizione di tipo funzionale: macchine di smistamento molecolare che sono in grado di

oo di a e l’o ga izzazio e spazio te po ale delle ie di t asduzio e del seg ale, all’i te o di aree selezionate

che sono chiamate, da alcuni,

segnalosomi.

La tabella riporta la localizzazione

differenziale di proteine che

partecipano alle vie di segnalazione

(importante!!).

È importante il complesso di un

microambiente che recluta proteine di

uno stesso tipo e fa si che i processi di

fosforilazione e defosforilazione

possano essere o co-localizzati o

sepa ati l’u o dall’alt o.

Il coinvolgimento degli sfingolipidi nella trasduzione è dovuto al fatto che quanto più dense sono le strutture

tanto più possono aggregarsi i vari recettori.

Hakomori et al. hanno dimostrato che i glicosfingolipidi (GSLs) sono modulatori della trasduzione di segnale.

L’agg egazio e di a i a di GSLs e oleste olo se a da e o igi e a i odo i i ell’a ito del ilayer

lipidi o e l’asso iazio e di u a g a a ietà di ole ole di seg ala e to o uesto do i io.

I GSLs sono relativamente ricchi di acidi grassi con catene aciliche sature, che permettono uno stretto

impacchettamento e conferiscono temperature di fusione alte. Viceversa, i fosfolipidi derivati dal glicerolo

so o elati a e te i hi di a idi g assi o ate e a ili he is‐i satu e strutture a gomito), che impediscono

l’i pacchettamento stretto, e conferiscono temperature di fusione basse.

Un altro degli aspetti che collega i rafts alla trasduzione del segnale è la presenza di microambienti che forniti a

proteine molto particolari, specialmente a molte proteine legate a code di GPI (probabilmente tutte le proteine

sono legate a code di GPI). Quindi queste proteine collegate a code di glicosilfosfatidilinositolo, sono presenti

nel foglietto esterno della membrana plasmatica, molte proteine che hanno un compito di essere protein

chinasi, hanno la possibilità di avere comportamento modificato dal collegamento con catene di lipidi che di

solito so o satu e e posso o lo alizza e ueste p otei e dell’a ie te i te o della e a a pe ò se p e i

corrispondenza con la zono dei rafts.

Proteine ancorate tramite GPI, proteine acilate (con coda di acido grasso) come la famiglia src delle tirosina

chinasi e le proteine trimerica G, sono associate ai microdomini di GSLs. Le proteine ancorate a GPI hanno di

solito catene aciliche sature che probabilmente si inseriscono preferenzialmente nei microdomini GSLs. La

famiglia Src delle proteina chinasi vengono modificate da lipidi a catena satura (palmitoilazione e miristilazione)

che probabilmente si inseriscono preferenzialmente nei microdomini ricchi in GSLs.

L’atti azio e di olte fa iglie di p otei a ad atti ità TK tirosin chinasica) è fatta proprio dalla interazione tra

anticorpi o altri ligandi con dei recettori che normalmente possono stare lontano dai rafts ma se diffondendo

lateralmente finiscono proprio nella zona dei rafts tendono ad essere più vicini. E questi legami che sono molto

ti p o uo o o ulte io e te l’agg egazio e.

invade Quindi

il legame con Ab che possono fare legami incrociati con altre

molecole, anche questo è facilitato prorio da una diffusione

laterale che finisce in una zona dei rafts.

ki g ediato da a ticorpi o liga di delle protei e

Il cross‐li i du e l’atti azio e della fa iglia delle

GPI ancorate src‐

3

chinasi e un transiente aumento della fosforilazione a livello della tirosina di diversi substrati (Fig.a).

cross‐li ki g degli i du e l’atti azio e della fa iglia

Anche il GSLs mediato da anticorpi src delle proteina

chinasi e un transitorio aumento di fosforilazione della tirosina (Fig.b).

il oss‐li ki g dei GSLs ediato da a ti o pi può si ula e il seg ala e to ediato

Ciò dimostra che da

p otei e GPI‐a o ate. A ti o pi o t o le p otei e GPI‐a o ate fa o i u op e ipita e la fa iglia delle s ‐

hi asi, e a ti o pi o t o i GSL o‐i u op e ipita o le hi asi e le p otei e GPI‐a o ate. I olt e, la

src-

e di a oid ati dei GSLs della supe fi ie ellula e osta ola l’atti azio e della

rimozione enzimatica della frazio

hi asi edia te a ti o po‐ ediato oss‐li ki g delle p otei e GPI‐a o ate. Queste

famiglia delle src‐ p otei e GPI‐a o ate.

osservazioni suggeriscono che i GSLs sono coinvolti nel segnalamento mediato da

Nonostante non ci sia ancora accordo sul fatto che le proteine GPI-ancorate si associno stazionariamente ai

i odo i i GSLs, si pe sa he il oss‐li ki g ediato da a ti o pi delle p otei e GPI‐a o ate i du a la

traslocazione verso i microdomini GSL o stabilizzino la loro associazione con i microdomini GSL.

L’atti azio e di olte fa iglie di p otei a ad atti ità ti osi hi asi a fatta p op io dalla i te azio e t a

anticorpi o altri ligandi con dei recettori che normalmente possono stare lontano dai rafts ma se diffondendo

lateralmente finiscono proprio nella zona dei rafts tendono ad essere più vicini. E questi legami che sono molto

i ade ti p o uo o o ulte io e te l’agg egazio e.

Esempio di attivazione per le IgE in cui il recettore di solito è lontano dai rafts,le

proteine ad attività TK, sono nei rafts, il legame con gli Ag provoca uno

spostamento che localizza il recettore e fa si che la coda interagisca con questa

zona. Questi spostamenti fanno si che quelli che erano dei micro rafts diventino

più estesi e ciò spiega la possibilità di individuare i rafts nelle cellule vive perché

passano da strutture molto piccole e strutture più estese.

pe l’Epide al G o th Fa to

I recettori EGF) e Ras

sono presenti nei microdomini GSL e il trattamento con

e di Raf‐ e MAPKK hi asi dal

EGF induce la traslocazio

citosol ai microdomini GSL. Ciò suggerisce che i

microdomini GSL possono essere siti di inizio per la

cascata delle MAP chinasi. questo è uno di quei processi

che richiedono la presenza di aggregazione locale di

proteine che devono interagire le une con le altre per far

partire questa trasduzione del segnale e oltre i rafts la

colocalizzazione è facilitata da proteine che tengono i

componenti del macchinario della trasduzione del

segnale tutte a ridosso della stessa zona e proteine

scaffold e il processo è favorito dal fatto che sono vicine. Attivazione delle ERK MAP kinasi. La stimolazione dei

di es ita po ta all’atti azio e

recettori dei fattori della piccola proteina che lega il GTP, Ras, che interagisce

con la proteina chinasi Raf. A sua volta Raf fosforila e attiva MEK, una proteina chinasi a dopplice specificità che

Th ‐ a d T ‐

attiva ERK mediante fosforilazione di residui sia di treonina che di tirosina 185). La ERK quindi

fosforila una gran varietà di proteine bersaglio nucleari e citoplasmatiche. 4

Molte p otei e G t i e i he ha o u ’ aggiu ta di ode lipidi he he pe ette l’a i i a e to delle p otei e

alla membrana e ci sono delle code sature e code insature. Quando si parla di proteine miristilate o

palmitoilate o acilate, in genere, di solito si parla di code sature mentre alcune proteine hanno aggiunta di

strutture apolari ma con gruppi insaturi che preferiranno un inserimento nei glicerolipidi spesso con catene

doppie. Quindi ci sono anche delle patologie collegate alla mancanza della coda lipidica, che è importante per

mantenere le proteine vicine alla zona dove parte il recettore che è coinvolto. La mancanza di queste

modificazioni porta alla solubilizzazione delle proteine. In particolare, a pal itoilazio e ha u uolo ell’indirizzare

p otei e G‐alfa alla a spe ifi i su ‐do i i afts .

le membrana, ed in particolare, La mancanza di palmitato causa una

e ata lo alizzazio e delle p otei e G‐alfa nelle membrane intracellulari.

sono proteine che avvicinano diverse altre proteine in una via di segnalamento e

Le proteine scaffold

permettono la loro interazione, reclutano effettori a valle in una via ed aumentano la specificità del segnale.

Queste proteine sono importanti in molti contesti non solo nella trasduzione del segnale, ma anche per

l’adesio e f a ellule di e se, ui di, dei p o essi i ui la p otei a t a s e a a de e i te agi e o

favorire

la coda citoplasmatica con varie proteine collegate al citoscheletro.

Molto spesso nelle illustrazioni dei libri si vedono le proteine come se fossero sempre a disposizione nel posto

d’i te esse, a isog a fa e si he la p otei a giusta sia el posto giusto e o ada da u ’alt a pa te. Negli

ultimi anni si è fatta

attenzione a questo

tipo di proteine,

l’o ie ta e to più

di tipo funzionale,

sono delle proteine

con diversi siti di

legame per proteine

diverse che di solito

hanno domini che

riconoscono a.a.

fosforilati, spesso

sono proteine che

diventano chinasi se si

legano ad altre

proteine (quindi il

reclutamento vicino al

recettore dipende da

diverse proteine

scaffold).

Si è sempre cercato di classificare da un punto di vista

morfologico e funzionale le strutture delle cellule e anche

el aso dei aft ’ il te tati o di disti gue e tipi di e si. 5

Una delle strutture che più incuriosisce molti ricercatori sono le caveole, delle fossette localizzate nella

so o state pe olti a i e uipa ate alle fossette dell’e do itosi, a

membrana di molte cellule e non lo sono,

anzi sono strutture statiche, molto presenti in vasi sanguigni, varie cellule del sistema nervoso e si è visto che

hanno funzione collegate, spesso, a trasduzione del segnale.

Queste piccole invaginazioni della membrana plasmatica di molte cellule sono state identificate per prima

mediante esame con microscopia elettronica a metà degli anni 50 da due ricercatori (Palade, 1953; Yamada,

i agi azio i a fo a di fias hette di 5 ‐100

1955), come nm della membrana plasmatica :

Le caveole sono descritte come piccole introflessioni della

membrana ricche di molecole di segnalazione e alcuni

ritengono che siano zone specializzate per endocitosi di

lipoproteine che trasportano colesterolo.

Morfologicamente sono degli affossamenti della

membrana. Il loro rivestimento sembra essere fatto da

filamenti disposti concentricamente

che contengono la proteina transmembrana caveolina.

Notare che le caveolae differiscono sia in dimensioni che in

struttura dai pozzetti rivestiti da clatrina, uno dei quali è

visibile in altro a destra di (B).

Le caveole sono state osservate in una gran diversità di tipi cellulari, in particolare nelle cellule endoteliali, ma

non nei tessuti neuronali.

Nelle caveole sono particolarmente concentrate molte proteine e lipidi; tuttavia, la marcatura delle cellule con

u a ato e del do i io PH specifico per il PIP2 indica che questo lipide non è

Pleckstrin Homology,

concentrato nelle caveole.

Il principale marcatore delle caveole è la proteina caveolina. arancione, i lipidi normali in

I glicosfingolipidi, e altri lipidi con catene aciliche lunghe e dritte sono indicati in

giallo-verde.

Le proteine transmembrana caveoline sono in blu. "I rubini

rossi" rappresentano enzimi e recettori ancorati a GPI. Le

so o S ki ases pal itolate, e i

verdi -like recettori

sfere

transmembranosi grigio e arancione rappresentano recettori

di segnalamento associati alle caveolae.

L’idea iniziale era che le caveole fossero delle vescicole endocitotiche

rivestite da clatrina, in seguito questa idea fu abbandonata sia perché

la morfologia delle caveole è più piccola e anche perché le proteine che

sono addossate al versante citosolico hanno una struttura a strati,

mentre nelle vescicole endocitotiche rivestite da clatrina, la clatrina

forma una gabbia ricca di esagoni e pentagoni a costringere la

membrana.

Quindi, la caveola è una vescicola temporanea che poi si staccherà

dalla membrana plasmatica mentre le altre sono zone che

o t i uis o o ad au e ta e l’a ia di s a io, a he pe h i

illi e le i t oflessio i so o delle zo e i ui o al e te l’a ea

micro

coinvolta in un processo è aumentata. 6

Se la caveolina è o meno un marcatore dei rafts è ancora una questione aperta, probabilmente tutte le caveole

sono rafts, ma non tutti i rafts sono caveole.

Altra caratteristica delle caveole è la mancanza di PIP2. Si deve porre attenzione ad alcuni aspetti, ad esempio:

il fatto che diverse proteine, come le integrine, si

concentrino nelle zone dei rafts indica che questo

fornisce anche una piattaforma specializzata per

l’adesio e. Qui di o solo pe la t asduzio e del

segnale, ma anche una piattaforma specializzata per

compiti molto specifici come possono essere la

concentrazione di proteine specifiche per il legame con

la matrice extra cellulare.

Anche la trasduzione del segnale che produrrà

ediato i dell’i fia azio e p efe is e i afts e olte

proteine che sono presenti normalmente nelle cellule,

ma che possono subire una modificazione

conformazionale che le rende in grado di formare

grandi aggregati che a loro volta modificano la struttura

di altre proteine.

È associata ai rafts anche la capacità di avere una specie

di endocitosi molto localizzata, un recettore che è

presente ed è internalizzato con questo processo, è il

recettore per il folato, che diventa un cofattore, non solo per la sintesi della timina ma anche per diversi

processi cellulari, ed è una vitamina. I recettori per queste vitamine di solito sono concentrati in piccole zone

della membrana, non stanno insieme ai recettori per le lipoproteine o per il ferro, sono delle piccole fossette

pa ti ola i e si e ato pe u po’ di a i di di e

endocitotiche che questi processi sono separati

dall’e do itosi t adizio ale p op io pe h a e go o ei afts. A ua to pa e iò, o e o.

Le proteine che sono marcatori delle caveole hanno delle sequenze di a.a. che sono stabilizzate per

complementarietà o con la parte lipidica degli sfingolipidi o con gli anelli del colesterolo.

La caveolina è descritta come una proteina a forcina che ha una zona di interazione con il foglietto che è

stabilizzata con le code anche dal colesterolo. e to: l’esp essio e o e o della

Nel campo di rafts e oncogenesi sembra esserci un collega caveolina può

esse e ollegata o l’adesio ealla at i e e t a ellula e e alla possi ilità di fa e la o elazio e t a l’adesione

e la vita, perché, la maggior parte delle cellule normali se non è collegata alla matrice nel modo corretto,

staccandosi, nelle cellule epiteliali, il distacco è interpretato come un messaggio di morte cellulare e anche la

proliferazione può essere modificata dal grado di adesione alla matrice.

Una delle caratteristiche delle cellule tumorali è la mancanza di limitazione del fatto che se crescono molto non

devono proliferare. Altro processo è quello di proliferazione. Se si mettono le cellule in coltura con un certo

spazio vitale, il fatto di poter allargarsi indica la presenza di nutrimento. Quando iniziano ad esserci troppe

cellule, la quantità di nutrimento non è sufficiente e la cellula comprende che non è il caso di crescere

ulteriormente. Questo controllo manca nelle cellule tumorali e quindi i meccanismi di controllo della crescita

possono essere correlati con la presenza di recettori in queste strutture particolari e che la presenza di

esagerata caveolina interferisca con la risposta ai fattori di crescita.

L’esp essio e della a eoli a stata correlata sia alla trasformazione oncogenica che alla sua regressione:

 La sotto‐ egolazio e della a eoli a ha p o o ato t asfo azio e alig a he pote a esse e o es iata

da a eoli a a ti‐se so Gal iati et al, . 7

 La so a‐esp essio e della a eoli a‐ ha a ogato la es ita i dipe de te da a o aggio N.B. u a

caratteristica della malignità) (Engelman et al, 1997).

 L’esp essio e della a eoli a ha i i ito la es ita di ellule a a ie alig e u a e Lee et al,

1998).

Le caveole sono coinvolte, inoltre, nei processi di infezione batterica:

 Molti batteri che infettano i vertebrati hanno adottato una strategia per illudere i sistemi immunitari

dell’ospite i ade do le ellule.

 L’adesio e e aptazio e dei atte i so o p o essi olto o plessi he coinvolgono diverse proteine

atte i he e u g a u e o di p otei e dell’ospite di seg ala e to e del itos helet o fuo iate dai

batteri.

 La nucleolina è stata identificata come recettore per EHEC (enterohemorrhagic ) (Sinclair

E. coli E. coli

& O'Brien, 2002), ma non è chiaro se la nucleolina sia associata alle caveole. I batteri potrebbero essere

internalizzati mediante un meccanismo simile a quello descritto per il virus SV40 (Pelkmans et al, 2002).

eu o ali esp i o o a eoli a‐ e a eoli a‐ , esse o fo a o

Caveole neuronali: mentre le cellule

caveolae morfologicamente distinguibili. Invece, hanno microdomini ricchi di caveoline associate alla striatina e

, d’a o do

ad altre proteine associate. Le striatine sono concentrate nelle spine dendritiche (Bartoli et al,

o l’opi io e o u e he le spi e sia o egio i i ui si o e t a l’atti ità di seg ala e to .

Importante è la presenza di proteine

lubrificate da lipidi particolari che

permettono alla proteina di svolgere la sua

funziona caratteristica e questa particolarià

pe ette di defi io e i afts lu ifi ati .

l’ambiente molto denso promuove

Compito dei rafts nella trasduzione del segnale (domanda esame)

l’aggregazione di diversi recettori e ciò può essere importante per quei recettori che hanno bisogno di

oligomerizzazione.

Sapere quali sono i lipidi coinvolti e il ruolo del colesterolo (domanda esame)

Rivedere importanza del Golgi nella glicosilazione(per esame) 8

SEMINARIO: INVASIONE DA VIRUS, FORMAZIONE PRIONI, AMILOIDE

Proteine chinasi di varie famiglie che amano molto i rafts, sono proteine che oltre al dominio chinasico hanno

dei domini che possono riconoscere altri a.a. in particolare fosforilati, di solito è inattiva e bisogna attivarla per

farla funzionare. La proteina Src fu la prima tirosina chinasi ad

essere scoperta; ora si sa che appartiene ad

una sottofamiglia di nove proteine chinasi

molto simili, che si trovano solo negli animali multicellulari.

o ta egio e N‐te i ale he si lega o ale te e te ad u

La proteina Src e i suoi omologhi contengono una

acido grasso fortemente idrofobico, che trattiene la chinasi nella faccia citoplasmatica della membrana

S ho olog ;

plasmatica. Dopo ci sono due moduli di legame a peptidi (dominio Src di omologia 3 SH3) e

dominio SH2 che riconosce tirosina fosforilata), seguiti da un dominio catalitico ad attività chinasica.

Queste chinasi normalmente esistono in una conformazione inattiva, nella quale una tirosina fosforilata vicino

al C‐te i ale legata al do i io SH , e il do i io SH legato ad u peptide i te o i u odo he disto e

il sito atti o dell’e zima ed aiuta a renderlo inattivo. La proteina normalmente ha un gruppo

fosfato che la tiene in una zona

particolare, al C-term, e la mantiene

inattiva e la sua attivazione richiede la

rimozione del fosfato e poi che ci sia

u ’alt a p otei a he si lega a u alt o

dei domini e dopo questi passi di

attivazione la proteina è attiva. Quindi

delle comparse della trasduzione del

segnale associato ai rafts sono proteine

di questa famiglia.

Le hi asi della fa igli S so o asso iate a e etto i pe l’Ag e e‐

fosforilano tirosine della sequenza ITAMs (Immunoreceptor tyrosi

ased a ti atio otif : sequenza conservata di quattro aminoacidi che

è ripetuta due volte nelle code citoplasmatiche di alcune

proteine della superficie cellulare delle cellule del sistema immunitario)

asso ia o o il B‐ ell

Le chinasi della famiglia Src Fyn, Blk e Lyn si

antigen receptor mediante legame a motivi ITAM, sia mediante i loro

do i i N‐te i ali he mediante legame con una singola tirosina

fosforilata mediante i loro domini SH2. Dopo il legame con il ligando e

l’agg egazio e dei recettori, esse fosforilano le tirosine negli ITAMs

presenti nelle code citoplasmatiche delle Igα and Igβ.

INTERAZIONE DELLE PROTEINE CON GLI SFINGOLIPIDI: ad oggi gli sfingolipidi sono descritti con ruolo di

chaperonina di una molecola che induce un cambiamento di conformazione in una proteina. 9

ie te di u a

L’a membrana è una struttura bidimensionale in cui le proteine possono raggiungere, in certe

zone, delle concentrazioni molto elevate e possono essere utili ai patogeni per evadere. Le strutture per far

evadere le cellule devono trovare dei recettori, in un primo momento a bassa affinità e, in un secondo

momento, ad alta affinità, e se questi fossero dispersi in una zona molto ampia la probabilità di trovare le

l’i o t o,

condizioni giuste sarebbero basse. Invece se certe zone favorissero prima con recettori a bassa

l’adesio e e, fa o i a o l’i g esso, uesto a tutto a

affinità che favoriscano poi, con quelli ad alta affinità che

vantaggio di queste strutture.

Si è visto che i glicolipidi hanno la capacità di legarsi a diverse proteine e fargli cambiare conformazione.

Era un dogma della biologia dire che la struttura che una proteina può assumere è univocamente

determinato dalla sequenza di a.a. La sequenza di a.a. determina la struttura ottimale della proteina.

A quanto pare, ci sono molte proteine che hanno una plasticità di conformazione possibile enorme che sono

già descritte con sigle particolari e fra queste si trova la proteina prionica.

La modulazione della conformazione di alcune proteine è molto svolta da degli sfingolipidi e viene usato il

termine di chaperonina per inserire il materiale genetico di virus come HIV ed altri, nella cellula ospite con la

fusione, quasi, delle membrane rispettive. I cambiamenti che provocano la formazione delle placche amiloidi o

delle strutture tipo canali ionici che si formano nelle membrane delle cellule nervose è dovuta a proteine

oi olte ell’Alzhei e e alt e patologie del siste a e oso, do ute ad agg egazio i pa ti ola i della

proteina. Proprio queste aggregazioni sono aiutate in modo determinante dai glicolipidi e negli ultimi anni si è

cercato di capire quali sono le strutture sia del lipide sia della proteina che cambia conformazione che

funzionano in patologie totalmente diverse come Alzheimer e morbo della mucca pazza.

È stato quindi cercato il punto in comune in questo tipo di infezioni che sono completamente diverse tra di

loro.

Molti peptidi so o p odotti da di e si ge i e sf utta o o e po tale d’i g esso i di e si tipi di sfi golipidi altri

invece preferiscono il colesterolo; questa preferenza di struttura, condei residui di zucchero legati al

colesterolo già li indirizza alla struttura dei rafts. Ci sono degli approcci per vedere in che modo queste proteine

sono alterate da un punto di vista morfologico e diventano tossiche ad esempio dal lato della tossina si deve

legare alla membrana con carica negativa e poi migrare lateralmente, e questo da il via a un legame meno forte

con recettori che hanno i gruppi di acido sialico in superficie e questa tossina diffonde lateralmente legata agli

sfingolipidi e si crede che trovi una proteina che è presente nelle zone delle sinapsi con la quale stabilisce un

legame ad alta affinità e quindi, visto dal lato della tossina, si pensa che avvenga un cambiamento di

conformazione nella tossina del primo legame debole e che poi la presenta con orientamento tale che la

proteina in cui si lega in un secondo tempo la lega fortemente. Quindi questi legami deboli e il fatto che si

u ’alt a p otei a i di izza a e so la possi ilità he la zo a he fa o isse uesto

possano spostare per trovare

fossero i rafts.

Già in campo di tossina batterica si vedeva la caratteristica di un legame con i lipidi e uno con altre proteine.

Non si è potuto fare a meno di notare che tutto ciò è quello che avviene in patologie molto diverse.

INFEZIONE DA HIV-1: HIV di e so dagli alt i et o i us. E’

approssimativamente sferico con un diametro di circa

120 nm, circa 60 volte più piccolo di un eritrocito, ma

E’ o posto da due opie di RNA a

grande per un virus.

singolo filamento positivo che codifica per i novi geni del

virus, racchiusi da un capside conico composto da 2000

copie della proteina virale p24. Il RNA a singolo filamento

è strettamente legato alle proteine del nucleocapside,

alla p7 e ad enzimi necessari per lo sviluppo del virione,

quali la trascrittasi inversa, proteasi, ribonucleasi e

integrasi. 10

U a at i e o posta dalla p otei a i ale p i o da il apside ga a te do l’i teg ità della pa ti ella di

iò i o dato dall’i olu o i ale he o posto da due st ati di fosfolipidi p esi dalla

virione. Tutto

e a a di u a ellula u a a ua do u a uo a pa ti ella i ale ge a dalla ellula. I se ite ell’i olu o

opie di u a p otei a o plessa dell’HIV he si spo ge i

virale vi sono proteine della cellula ospite e circa 70

tutta la superficie della particella virale. Questa proteina, chiamata Env, consiste in un capello fatto da tre

a o a la st uttu a all’i olu o

glicoproteine gp120 e da uno stelo che consiste in tre molecole di gp41 che

virale. Questo complesso glicoproteico permette al virus di collegarsi e fondersi con le cellule bersaglio per

iniziare il ciclo infettivo. Entrambe queste proteine, specialmente la gp120 vengono considerate bersaglio per

t atta e ti futu i o a i i o t o l’HIV.

I virus infettano specialmente i linfociti T provocando la loro morte e il problema è vedere che cosa favorisce

l’i te azio e o uel tipo di ellula pe i te fe i e da u pu to di ista te apeuti o. La st uttura responsabile

dell’i g esso e adesio e di u i us o et o i us o le ti i us ella ellula ospite, la possi ilità della apsula

virale di ancorarsi alla cellula ospite. Attorno alla capsula, i virus hanno anche una membrana lipidica che è

stata u ata ad u a ellula eu a ioti a he a e ano infettato precedentemente.

La p otei a gp , he fa pa te del p o esso di a o aggio, legata ad u ’alt a gli op otei a detta

glicoproteina 41, è presente in molte copie e ha una caratteristica strutturale che si è rivelata il punto in

o u e o l’i asio e di di e se ode di p o essi patologi i o u i alla fo azio e di pla he a iloidi,

p otei e p io i he, i fezio i i ali e …

Il punto comune individuato, fino ad adesso, è la cosiddetta sequenza di a.a. che assume una conformazione

molto particolare stabilizzata da domini S-S che viene chiamato loop V3. Il virus arriva con le sue proteine in

superficie, il problema che ha il virus è di avere la proteina di fusione che normalmente è nascosta dalla

membrana e da altre strutture deve assumere un cambiamento di conformazione tale da prendere contatto

con la membrana della cellula che è invasa. Quindi, deve trovare qualcosa per smascherare i peptidi e deve

trovare il recettore ad alt affinità che gli immunologi descrivono come Cd4, recettore presente sui linfociti.

Nella cellula invasa ci sono recettori a bassa affinità per la glicoproteina del virus, che si sa sono dei

glicosfingolipidi in particolare, possono avere 3 residui di acido sialico, quindi una carica negativa o zuccheri

neutri.

Nelle cellule che vengono invase sono stati identificati diversi recettori, alcuni di questi hanno affinità e sono

accoppiati a proteine G.

Ciò he dete i a la fuo ius ita dell’a pio e che è il peptide di fusione si è osservato il ruolo degli

sfingolipidi, che riescono a stabilizzare il virus facendolo migrare fino al suo recettore e lo portano ad una

conformazione che è ideale per il legame con Cd4.

fa o is e l’a i i a e to del i us alla e a a i odo da as o de e l’a ua he

Ciò che nello sfingolipide

o può esse e i se ita i ezzo e he au e to oltissi o l’affi ità della ellula he viene invasa con il virus,

io ella gp , la gli op otei a del i us, ’ u do i io che si sa che media il collegamento nella parte dello

sfingolipide esistono degli zuccheri, in particolare il galattosio che si collegherà al dominio V3 in modo molto

stretto e questo è un collegamento molto particolare perché è un collegamento fra uno zucchero del galattosio

che ha una parte ad anello che si collega ad a.a. idrofobici presenti nel dominio V3 e questi si stabilizzano tra di

lo o i odo da fa o i e l’i g esso.

Il legame allo sfingolipide fa uscire il peptide di fusione e cambia la conformazione di questa struttura in modo

tale che si abbia il co-recettore che lo aiuta e la zona che lo cattura di più con le due membrane che si

avvicinano tra di loro fino a quando non sono fuse insieme.

Patologia che non sembra avere nulla in comune è quella dovuta alla proteina prionica che provoca la morte di

una vasta zona dei neuroni. La proteina prionica ha una struttura che viene alterata e provoca la formazione di

aggregati che si inseriscono nella membrana delle cellule provocandone la morte. Anche in questo caso il

cambiamento conformazionale è un cambiamento che induce la formazione di strutture basate sul beta

foglietto che formano una struttura simile ad un poro che si aggrega a strutture dello stesso tipo, formando

delle strutture che tendono sempre ad aggregarsi tra di loro inducendo cambiamenti di conformazione nelle

une e nelle altre. Il cambiamento conformazionale di una proteina da normale è dovuto a sfingolipidi che

11

hanno galattosio in posizione chiave che induce il cambiamento conformazionale (il legame avviene tramite

loop V3). La proteina prionica è normalmente presente nei rafts ed stato dimostrate che la deplezione del

colesterolo dai rafts diminuisce la probabilità di invasione.

La proteina prionica, ha la caratteristica di avere un dominio di tipo V3 che riconosce gli zuccheri in particolare

il galattosio degli sfingolipidi, il collegamento della proteina con gli sfingolipidi induce il cambiamento

conformazionale che porta alla formazione della proteina alterata. Quindi il paragone è sempre quel dominio

che ha affinità per gli zuccheri degli sfingolipidi. È un dominio che riconosce degli zuccheri.

Il dominio V3 interagisce con la proteina

prionica e questo dominio, si è visto essere

p ese te ell’i asio e dell’HIV, ella

formazione di placche amiloidi

ell’Alzheimer oltre alle proteine prioniche.

Il dominio oltre ad essere stabilizzato da un

ponte S-S è ricco di a.a. aromatici che

formano degli anelli che si stabilizzano con

l’a ello degli zu he i fo a do u a so ta

di a atasta e to o la pa te di a ello

degli zuccheri e ciò da un stabilizzazione

locale che avvicina il resto della proteina

alla membrana dato che questi zuccheri,

negli sfingolipidi, sono vicini alla parte

lipidica, di fatto, è trascinata in vicinanza

alla membrana, è aiutato il cambiamento di

conformazione e a questo punto , se la

zona non è molto densa, il cambiamento di

conformazione è già idoneo al legame ad alta affinità.

Quindi si ripropone sempre un processo comune in patologie diverse e in proteine presenti nella patologie,

total e te di e se l’u a dall’alt a. Ha o o u ue tutte i o u e uesto do i io. A he la fo azio e

delle placche amiloidi è favorita dalla presenza degli sfingolipidi. mette in

L’immagine

e ide za l’a atasta e to

dell’a ello dello zu he o o

l’a ello della fe ilala i a della

proteina coinvolta, infatti

quando si va a vedere quali

sono le preferenza per

sfingolipidi di questi germi

sono tutti queste GB3,

galattosio e ceramide, hanno

tutti questo residuo di

galattosio nella posizione

ideale per formare questa

struttura di avvicinamento. La

stabilizzazione è dovuta al fatto

che i vari elettroni che sono

ell’a ello di fe ilala i a si

stabilizzano con gli anelli

coinvolti nel legame tra i vari carboni del legame del galattosio. Quindi c'è anche una spiegazione chimica e

strutturale che spiega questa affinità. 12

Casi o ali dell’attivazione del sistema immunitario, ora, sono studiati in termini di presenza di sfingolipidi.

Molti anni fa, si dimostrava che se si marcavano dei linfociti attivati o no con Ab specifici marcati in

all’atti azio e dei li fo iti, io e t e i u a

fluorescenza, al microscopio si osservava un fenomeno legato

ellula o atti a l’Ag e a dist i uito i odo asuale sulla supe fi ie della ellula, se la ellula e a atti ata pe

p odu e A o t o u e to Ag, la zo a a ata o uell’A di e ta a o olto lo alizzate e questo era

descritto come localizzazioni a macchia di leopardo nella cellula, e allora non si capiva perché i recettori si

aggregassero in quel modo.

La risposta è arrivata alcuni anni dopo capendo che le cellule che sono state messe in contatto con il ligando

specifico provocano una convergenza dei recettori verso zone particolari della membrana ed è lì che il ligando

a à l’effetto di trasduzione del segnale. o t o l’ Ag he gli

Il linfocita B attivato da linfocita T è indotto a proliferare e produrre Ab viene presentato dal

T, ed l’atti azio e he p o o a agg egazio e dei e etto i.

linfocita

Re etto i spe ifi i: so o o plessi p otei i he i o os o o sti oli di e si e il lega e dell’Ag o il e etto e

genererà un processo di trasduzione del segnale che provoca la trascrizione di vari segnali. Il linfocita B attivato,

da un punto di vista morfologico è completamente diversa da un linf. B a riposo, è una cellula che comincia a

produrre molte copie delle stesso Ab, quindi ha una trascrizione enorme, ma sta trascrivendo un solo gene.

Il reticolo della plasmacellula è molto sviluppato, il nucleolo molto grande e molta eterocromatina, ciò si

spiega perché è uno solo il gene trascritto, se fossero molti geni la cromatina sarebbe più distesa perché deve

pe ette e l’a esso a ge i di e si e la o fologia a uota di a o spe ifi a del fatto he sta t as i e do u

solo gene. La risposta al segnale necessita di recettori e co recettori con processi di sequenza di attivazione

i uesto aso si sa he il e etto e pe l’Ag u

particolari e a di quelle proteine che è presente nella zona dei

afts e a he i uesta zo a so o p ese te le p otei e della fa igli S he poi da a o o igi e all’atti azio e.

Qui di il li f.T a i a o l’Ag o iugato al complesso maggiore di istocompatibilità che è riconosciuto dai

recettori che migrano fino alla zona dei rafts dove si aggregano e danno attivazione. Lo stesso succede nelle

ast ells do e la isposta l’eso itosi di ista i a e alt i odulato i e anche in questo caso i recettori e le

proteine coinvolte non sono localizzate nei rafts ed è il legame che provoca il trasferimento del recettor e fino

ai rafts dove sono attivate. all’i izio posso o esse i delle IgE he si

In una cellula non stimolata legano al recettore ma la tirosina chinasi

non è in grado di legarsi alla coda del recettore finche non è nei rafts un gruppo fosfato è ritirato dalla fosfatasi

e ui di le ode o so o fosfo ilate, pe ò ua do l’i sie e degli Ag ulti ale ti p o o a l’attivazione dei

recettori diversi.

Nei rafts convergono i recettori e la proteina Src, i domini che sono fosforilati in risposta a ciò, sono fosforilati

dalla S e uesti p o o a o u a t asduzio e di seg ale a alle. A he ei li fo iti T l’atti azio e è basata

he p ese ta o l’Ag he so o a

esattamente sugli stessi processi e questo richiede che ci siano le proteine

contatto con recettori sulla cellula T e anche qui avviene il processo di signalling.

ise u a delle o segue ze dell’atti azio e dei li f.T he

La polarizzazione delle cellule che devono essere uc

convergono, esocitosi di sostanze che provocano la lisi delle cellule che sono marcate proprio per la

distruzione. 13

MOLECOLE DI ADESIONE DEGLI ORGANISMI EUCARIOTI PLURICELLULARI

Le cellule aderiscono fra loro e alla matrice extracellulare tramite

proteine di superficie cellulare chiamate molecole di adesione

una categoria che comprende le proteine di

cellulare (CAM) adesione transmembrana.

Le CAM possono essere molecole di adesione cellula-cellula o

molecole di adesione cellula-matrice.

Alcune CAM sono dipendenti da Calcio, mentre altre sono

indipendenti da Calcio. sembrano essere soprattutto

Le CAM dipendenti da calcio

responsabili dell’adesione tessuto-specifica cellula-cellula vista

negli embrioni precoci dei vertebrati, il che spiega perché queste

cellule possono essere disaggregate con agenti che chelano il

calcio.

Le CAM sono state identificate inizialmente producendo anticorpi contro molecole di superficie e quindi

controllando gli anticorpi per la loro capacità di inibire l’adesione cellula-cellula in provetta.

Quei rari anticorpi che inibivano l’adesione sono stati quindi usati per caratterizzare e isolare la molecola di

adesione riconosciuta dagli anticorpi.

Le molecole coinvolte nell’adesione delle cellule con altre cellule o con la matrice extracellulare presentano

determinate caratteristiche: nell’ambiente extracellulare,

1) la maggior parte della proteina è parecchio quindi andremo a

esposta

guardare classe per classe come sono i domini che troviamo e le strategie con cui lega il calcio la

per avere delle strutture che devono nel momento dell’adesione essere

quale forma dei ponti S-S

abbastanza dritte per avere un contatto con altre molecole.

La maggior parte delle sequenze di aminoacidi delle caderine si trovano nel versante extracellulare.

2) spesso hanno delle sequenze di aminoacidi con caratteristiche

Sono strutture MULTIMODULARI;

strutture tridimensionali ripetute, ma possiamo anche trovare dei domini che si possono trovare in

proteine plasmatiche o proteine della matrice extracellulare.

Uno dei compiti delle molecole di adesione è quello di permettere alle cellule non solo di aderire fisicamente

ad altre cellule ed alla matrice, ma anche di fra loro e con il loro ambiente.

comunicare

La maggior parte delle molecole di adesione identificate fin ora si è visto che hanno un compito non solo

biofisico , ma anche di trasduzione del segnale, associandosi direttamente o indirettamente a sequenze di

proteine con attività enzimatiche che sono in grado di propagare dei segnali all’interno della cellula o

prendere dei segnali all’interno della cellula e comunicarli alla molecola di adesione alterando le sue

caratteristiche di affinità e di forza verso un ligando.

Le molecole di adesione possono essere modulate da ligandi che o rafforzano l’affinità di una cellula verso

l’altra oppure fungono da antagonisti, quindi nei vari processi si trovano delle molecole che bloccano i siti di

legame ed impediscono l’adesione. l’assemblaggio delle cellule in tessuti,

Le interazioni tra molecole di adesione e i loro ligandi mediano

portando alla formazione di organismi multicellulari.

organi e sistemi,

Numerosi e diversi eventi adesivi, che possono essere oppure sono richiesti per

sinergici antagonisti,

organizzare un tessuto o il comportamento della cellula.

Nelle cellule troviamo una miriade di classi di proteine di adesione che collaborano anche in modo

cooperativo, le quali associandosi vicino ad adesioni dello stesso tipo possono tenere le cellule saldamente

adese ad altre cellule o alla matrice. 1

Gli eventi adesivi possono essere o

stabili transitori:

interazioni tra cellule muscolari cardiache o le cellule epiteliali, sono forti e stabili mentre gli eventi adesivi

dove le cellule sono per lunghi periodi aderenti fra loro o devono in un certo momento contattare le altre

cellule attivandole o inducendo cambiamenti conformazionali o di adesione e quelli dove per esempio

permettono ai leucociti di muoversi attraverso la parete dei vasi sanguigni sono più deboli e transitori.

In questo caso l’adesione avviene in modo molto specifico verso la superficie extracellulare, quindi le

proteine presenti nell’ambiente extracellulare verso le quali hanno un’affinità

cellule riconosceranno delle

altamente specifica quindi si ha complementarietà di legame.

Aumentando la complessità delle interazioni cellula‐cellula e cellula-matrice esiste una notevole ridondanza

fra le molecole di adesione. di modulare l’adesione

Ci sono tante molecole che svolgono lo stesso compito, perché la possibilità è data

anche dal fatto che ci siano diverse molecole di adesione e quindi il fatto che ci siano delle proteine

appartenenti alla stessa famiglia ma di sottofamiglie diverse conferisce una maggiore capacità alle cellule di

modulare momento per momento il modo con cui sono collegate con altre cellule.

In che modo molecole di adesione cellula-cellula come le caderine tengono unite le cellule?

sulla superficie cellulare possono mediare l’adesione

I meccanismi mediante i quali le molecole

cellula‐cellula sono 3: legame omofilico , legame eterofilico e legame mediato da una terza molecola

extracellulare. I meccanismi più comuni sono i legami omofilici ed eterofilici.

Le caderine di solito collegano le cellule mediante un meccanismo

omofilico. le molecole su una cellula si legano ad altre molecole

Nel legame omofilico,

dello stesso tipo su cellule adiacenti (esempio caderina-caderina,

superfamiglia delle immunoglobuline-superfamiglia delle

immunoglobuline); mentre nel le molecole su una cellula

legame eterofilico,

si legano a molecole di un tipo diverso su cellule adiacenti.

Ci sono situazioni più rare in cui è necessaria una terza molecola che fa da linked tra le due molecole, e ciò

avviene nel i recettori di superficie su cellule adiacenti

legame dipendente da molecole di collegamento,

sono collegati fra loro da molecole di collegamento secrete multivalenti.

possano operare negli animali, quest’ultimo meccanismo sembra essere il

Nonostante tutti questi meccanismi

meno comune.

In tale slide è possibile osservare una rappresentazione schematica delle molecole di adesione suddivise in

4 classi: proteine transmembrana che contengono nel

CADERINE:

dominio extracellulare

cinque domini che sono collegati da regioni che legano il Ca2+.

proteine transmembrana che contengono un

SELETTINE:

dominio N‐terminale di tipo

lectinico

MEMBRI DELLA SUPERFAMIGLIA DELLE

sono strutturalmente molto diversi, ma

IMMUNOGLOBULINE:

ciascuno ha da 2 a 5 ripetizioni di tipo Ig nel loro dominio extracellulare, e la maggior parte, ma non tutti,

sono proteine transmembrana.

legati in modo noncovalente composti da subunità α e .

eterodimeri

INTEGRINE: 2

Principali famiglie di molecole di adesione cellulare

(CAMs)

Slide 1

È possibile classificare le proteine della superficie indipendentemente se siano dipendenti o non da ioni

calcio bivalenti e si possono distinguere nella famiglia delle

- e nella

caderine ( sono calcio dipendenti, così come le integrine e le selettine )

(Ig) (non sono calcio dipendenti) le quali mediano adesioni

- superfamiglia delle immunoglobuline

cellula‐cellula di tipo omofilico.

-Per la il legame (arancione) del Ca2+ (mostrato nella slide 1) a siti fra i cinque domini del

caderina,

segmento extracellulare è necessario per l’adesione cellulare.

il dominio N‐terminale (blu) provoca la dimerizzazione della caderina e il suo legame ai dimeri di caderina

della membrana opposta.

-La contiene domini multipli (verdi) somiglianti in struttura alle

superfamiglia delle Immunoglobuline

immunoglobuline e contiene frequentemente ripetizioni di fibronectina (viola).

Mentre un esempio di dato dal legame di tipo lettina delle con catene di

interazione eterofilica è selettine

carboidrati in CAMs (molecole di adesione) di tipo mucinico su cellule adiacenti in presenza di Ca2+.

Il dominio lettina è separato dalla membrana da una serie di domini ripetuti

Le selettine mediano adesioni transitorie cellula-cellula nel torrente circolatorio-

Reclutamento dei leucociti dalla circolazione

A. Il reclutamento dei leucociti dalla

cirtcolazione fino ai siti di infiammazione è un evento complesso e ben orchestrato che può essere

suddivisio in quattro passi:

•Collegamento e “rolling”

•Attivazione

•Adesione

•Migrazione . nell’ancoraggio e “rolling”,

Nonostante si sappia che le selettine giocano un ruolo fondamentale

B.

che vengono secrete chemochine che attivano i

nell’adesione ferma, i dettagli molecolari esatti, e la

neutrofili, e che le integrine sono coinvolte regolazione di questi eventi sono tuttora oggetto

di intenso studio.

Le sono molecole di adesione che legano carboidrati (lettine) che mediano una varietà di

selettine:

interazioni transitorie di adesione nel torrente circolatorio che dipendono dal calcio.

Ci sono almeno tre tipi di selettine: la sui globuli bianchi, la sulle pistrine e sulle

L-selettina P-selettina

cellule endoteliali che sono state attivate localmente da una risposta infiammatoria e la su cellule

E-selettina

endoteliali attivate.

Ciascuna selettina è una proteina transmembrana con un dominio lettina altamente conservato che si lega ad

un oligosaccaride specifico su un’altra cellula. 3

dei globuli bianchi alle cellule endoteliali

Le selettine hanno un ruolo importante nell’attacco che rivestono i

vasi sanguigni, rendendo le cellule del sangue capaci di migrare fuori dai vasi entro un tessuto.

In un organo linfoide le cellule endoteliali esprimono oligosaccaridi che sono riconosciuti da L-selettina sui

linfociti, provocando l’arresto e l’intrappolamento dei linfociti. Viceversa, in siti di infiammazione le cellule

endoteliali accendono l’espressione di selettine che riconoscono gli oligosaccaridi sui globuli bianchi e sulle

piastrine, segnalando alle cellule di aiutare a risolvere l’emergenza locale. rinforzano l’attacco delle

Le selettine non agiscono, però da sole, ma collaborano con le che

integrine,

all’endotelio.

cellule del sangue

Le adesioni cellula-cellula mediate sia da selettine che da integrine sono eterofiliche; le selettine si legano a

oligosaccaridi specifici su glicoproteine e glicolipidi, mentre le integrine si legano a proteine specifiche.

Le selettine e le integrine agiscono in sequenza per permettere ai globuli bianchi di lasciare il torrente

circolatorio ed entrare nei tessuti.

Le selettine mediano un’adesione debole perché l’attacco del dominio lettina della selettina al suo

carboidrato ligando è a bassa affinità. Ciò permette al globulo bianco di aderire debolmente e reversibilmente

all’endotelio rotolando lungo la superficie del vaso sanguigno spinto dal flusso del sangue. Il rotolamento

continua fino a che la cellula del sangue non attiva le sue integrine, provocando adesso un forte attacco della

cellula alla superficie della cellula endoteliale e il suo strisciare fuori dal vaso sanguigno fra cellule

endoteliali adiacenti. osservare che spesso l’adesione è promossa dalle proteine altamente

In tale slide è possibile anche

glicosilate dette ( la sigla CAM è spesso utilizzata per descrivere proteine che appartengono alla

mucine.

superfamiglia delle immunoglobuline). dall’integrina

Il principale tipo di molecola di adesione cellula‐matrice, è dato : è un eterodimero di subunità

alfa e beta.

Tali subunità si legano al dominio di adesione per le cellule, presente nella fibronectina, laminina o in altre

molecole della matrice.

sono le tipiche proteine multimodulari che fanno da collegamento funzionale fra altre

Le integrine:

molecole e le cellule.

E’ importante capire il vantaggio della multimodularità, perché alcuni moduli sono uguali mentre altri sono

diversi e ciascun modulo è specializzato per il legame o con la proteina dello stesso tipo o con altre proteine

della matrice, zuccheri della matrice e cellule.

(ricordare che le glicoproteine della matrice sono multimodulari).

Un altro vantaggio della multimodularità è che talvolta i moduli possono essere scissi da proteasi della

matrice, piccoli peptidi che possono essere dei segnali; normalmente il modulo è nascosto dalla struttura

della proteina, ma se la proteina è il bersaglio di proteasi che tagliano il legame peptidico in zone molto

specifiche il modulo può separarsi, oppure se il modulo è nascosto può emergere con una conformazione

diversa e poter interagire con proteine sulla membrana delle cellule provocando una reazione.

Dimostrazione sperimentale del riconoscimento cellula-cellula.

Ectoderma+ Mesoderma

Quando le cellule di parti differenti di un embrione sono dissociate e poi mescolate tra loro,

le cellule inizialmente si aggregano insieme, ma poi si separano associandosi con altre

cellule dello stesso tipo. Nell’esperimento in a due regioni di un embrione precoce di anfibio

(l’ectoderma ed il mesoderma ) sono state dissociate il cellule singole e poi combinate.

Dapprima le cellule formano un aggregato misto ma poi si separano.

esterna dell’aggregato (rosso), la

Le cellule ectodermiche si muovono verso la superficie

stessa posizione in cui sono localizzate nell’embrione, mentre le cellule

mesodermiche(viola) si muovono verso l’interno, la posizione che occuperebbero

nell’embrione. Entrambi i tipi di cellule, poi , si differenziano nei tipi di strutture che si

formerebbero normalmente nell’embrione. 4

ADESIONE NELLE GIUNZIONI ADERENTI E NEI DESMOSOMI

Figura7.25a

Le giunzioni aderenti

rivestimento dell’intestino, dove appaiono come

Sono particolarmente comuni negli come il

epiteli,

«cinture» che circondano ciascuna cellula vicino alla superficie apicale, legandola alle cellule vicine (figura

7.25a). ‐ che si stabiliscono tra i

In una giunzione aderente, le cellule sono dipendenti

tenute insieme da legami Ca2+

domini extracellulari delle molecole di che fanno da ponte

caderina,

attraverso lo spazio di 30 nm tra le cellule adiacenti (figura 7.26).

Come illustra la figura 7.26, di queste caderine è legato da alfa e beta

Il dominio citoplasmatico

catenine a una varietà di proteine citoplasmatiche, compresi i del citoscheletro.

filamenti di actina

Perciò, come le integrine dei contatti focali, i gruppi di caderine delle giunzioni aderenti:

l’ambiente esterno al citoscheletro di actina

1) connettono funzionalmente / meccanicamente segnali dall’esterno della cellula al citoplasma.

2) e forniscono una via potenziale di trasmissione dei

Per dare un esempio, le giunzioni aderenti situate tra le del rivestimento dei vasi

cellule endoteliali

sanguigni che garantiscono la sopravvivenza delle cellule stesse, mediati da

trasmettono segnali

VE‐caderine. I Desmosomi (o maculae adherens)

Fifura 7.27b Sono giunzioni aderenti a forma di disco con un diametro di

circa 1 μm presenti in diversi tessuti.

I desmosomi sono particolarmente abbondanti nei tessuti

il e gli

soggetti a stress meccanici come muscolo cardiaco

strati epiteliali della cute e della cervice uterina.

Come nelle giunzioni aderenti, i desmosomi contengono

che legano le due cellule attraverso un ristretto

caderine

spazio extracellulare.

Le caderine dei desmosomi hanno domini con struttura

differente rispetto alle classiche caderine presenti nelle

giunzioni aderenti e sono

definite e

desmogleine desmocolline

(figura7.27b).

Dense presenti sulla

placche citoplasmatiche,

Superficie interna delle membrane plasmatiche,

servono da siti di ancoraggio per filamenti intermedi

ripiegati ad ansa simili a quelli degli emidesmosomi.

(figura 7.28) 5

Figura 7.28 Le desmogleine e desmocolline presentano delle code

che indirettamente prendono contatto con i filamenti

intermedi, sono delle strutture di rafforzamento, perché se

sono presenti degli stress meccanici in cui la cellula deve

resistere e deve impedire che le cellule si stacchino le une

dalle altre, tale rafforzamento sotto la membrana è molto

importante.

Ci sono degli anticorpi autoimmuni contro tali proteine

Le giunzioni cellule-cellula usano molecole di adesione

specifiche dei desmosomi, Ca2+-dipendenti, quali le

e le e quindi si ancorano a

desmogleine desmocolline,

diversi FI in modo specifico:

-alle negli

cheratine epiteli

-alla nei

desmina cardiomiociti

-alla nelle cellule della e

vimentina aracnoid mater

delle membrane (meningi) che avvolgono il sistema nervoso centrale, e di cellule

- pia mater

endoteliali specializzate.

Principali funzioni cellulari dei filamenti intermedi

L’epidermide è un buon esempio per illustrare questa

Sostegno meccanico:

funzione che è condivisa dalla maggior parte dei filamenti intermedi. I filamenti

intermedi di tipo cheratina sono abbondanti nei cheratinociti, con un range fra >

10% del contenuto totale di proteine nelle cellule progenitrici basali fino a >

70% nelle cellule di differenziamento più avanzato. I cambiamenti nel colore dei

filamenti riflettono l’espressione differenziale e l composizione delle cheratine

nelle cellule basali, di differenziamento precoce e di differenziamento tardivo (la

freccia indica il differenziamento). Le reti di filamenti di cheratina si estendono

attraverso tutto il citoplasma dei singoli cheratinociti e sono integrate fra cellule

mediante collegamento alle giunzioni cellula‐cellula di tipo desmosomi (punti rossi) e fra le cellule basali e

la lamina basale mediante collegamento ademi‐desmosomi (punti gialli). Questa organizzazione massimizza

il sostegno meccanico fornito dai filamenti di cheratina

La rete tridimensionale di filamenti intermedi fornisce continuità strutturale e resistenza alla trazione

all’intero strato di cellule.

I filamenti intermedi sono legati ai domini citoplasmatici delle caderine desmosomiali da altre proteine come

mostrato nella figura 7.27b.

L’importanza delle caderine nel mantenimento dell’integrità strutturale di un epitelio è dimostrata da una

malattia autoimmune, nella quale vengono prodotti anticorpi contro le desmogleine.

Pemphigus vulgaris,

caratterizzata dalla perdita dell’adesione nell’epidermide e da una estesa

La malattia è cellula-cellula

produzione di bolle nella cute. Desmosomi a cintura e desmosomi a borchia

Desmosome between epithelial cells

Desmosomi a cintura

Desmosomi a cintura sono Interazioni con i filamenti di actina

all’interno della cellula. 6

Negli epiteli, attorno alla cellula è presente il desmosoma a cintura, struttura specializzata a collegare

funzionalmente le contrazioni e dilatazioni di una cellula con la cellula vicina, per cui se per esempio si ha

dell’intestino o della vescica, ogni cellula è collegata con altre cellule vicine e

dilatazione o contrazione

l’elasticità del tessuto è reso possibile perché il citoscheletro di actina di una cellula è collegato

funzionalmente a quello delle altre cellule tramite proteine intermediarie.

Tra queste proteine troveremo molecole di adesione trans membrana come la E-caderina.

si lega alla ‐catenina

La coda intracellulare della E‐caderina sul versante citoplasmatico della membrana

α

plasmatica, formando un complesso Questo complesso si lega a sua volta alla

caderina‐catenina. catenina

e al citoscheletro di La componente extracellulare della molecola di E‐caderina si lega al Ca2+

actina.

rendendo l’integrità morfologica e funzionale della zonula adherens dipendente dal calcio.

La resistenza allo stress meccanico è limitata. Tale giunzione forma una banda o cintura continua che

circonda completamente la cellula.

Desmosomi a borchia

Un altro tipo di collegamento fondamentale dal punto di vista meccanico e strutturale per tenere le cellule

collegate le une alle altre per resistere agli stress meccanici è quello dei desmosomi a borchia (spot

desmosoms).

Tali desmosomi sono come una specie di chiodi diffusi lungo la membrana delle cellule, sono presenti in

numero maggiore o minore a seconda di quante siano le sollecitazioni meccaniche; per esempio le cellule

che hanno un maggior numero di desmosomi a borchia sono le cellule del muso dei ruminanti.

Tali desmosomi presentano proteine trasmembrana (caderine) con delle code che andranno in contatto con

filamenti intermedi ( per esempio cheratina nel caso degli epiteli, o desmina nel caso del muscolo cardiaco)

formando una struttura discoidale (a borchia) sulla superficie di una cellula che è appaiata ad una struttura

identica alla superficie di una cellula adiacente. Si ha una placca circolare (placca di collegamento) costituita

da 12 proteine sul versante citoplasmatico della membrana plasmatica.

È possibile osservare Ampio spazio intercellulare che contiene una banda mediana densa (al microscopio

elettronico) contenente la proteina desmogleina.

Permettono un’adesione ferma fra le cellule.

I desmosomi a borchia sono collegati ai filamenti intermedi quindi a secondo del tipo di tessuto ci sono

diverse famiglie, nelle cellule del muscolo cardiaco in cui le giunzioni fra i vari cardiomiociti sono

fondamentali per propagare non solo la contrazione ma resistere anche allo stress della contrazione, diverse

patologie cardiache sono anche provocate dal collegamento non corretto dei desmosomi che collegano le

cellule.

Uno dei sistemi per disgregare gli epiteli è quello di introdurre l’EDTA che è un chelante del calcio; il calcio

è sequestrato dall’edta, le caderine non presentano più la conformazione corretta e le

cellule si distaccano le une dalle altre.

MOLECOLE DI ADESIONE: LE CADERINE

Superfamiglia di recettori di adesione espressa da tutte le cellule che formano tessuti solidi. 7

(“tight junctions”),

Mediano nelle

interazioni omotipiche giunzioni aderenti, giunzione occludenti

(“gap junctions”) e

giunzioni comunicanti desmosomi.

L’espressione di caderine è

Un tipo cellulare può esprimere molteplici caderine. tessuto‐specifica.

Le caderine sono molecole di adesione calcio dipendenti; normalmente si trovano subito sotto le tight-

junction e garantiscono un’impermeabilizzazione, ossia impediscono ai fluidi che si trovano in un lato

dell’epitelio di mescolarsi con i fluidi sottostanti.

La zona in cui sono presenti tali caderine appare come una zona costituita da fili intrecciati di proteine con

più nodi ci sono tanto maggiore è l’impermeabilizzazione.

nodi e quanti

Le caderine sono proteine particolarmente coinvolte nelle giunzioni tra le cellule epiteliali;

sono particolarmente concentrate nelle giunzioni aderenti o nei desmosomi a cintura o nei desmosomi a

borchia dove presentano delle caratteristiche di collegamento al citoscheletro diverse; sono presenti lungo

tutti i versanti laterali delle cellule epiteliali dove collegano tali cellule con altre cellule vicine.

In alcuni vasi sanguigni, in particolare nelle venule, il ruolo della caderina vascolar endotiliar caderins è

anche importante per poter autorizzare il passaggio dei globuli bianchi, poter andare nel tessuto sottostante

ed essere oggetto di segnali che indicano che l’endotelio che normalmente è quiescente deve proliferare per

formare altri vasi sanguigni; quindi chi si occupa di angiogenesi normale o patologica fa molta attenzione

alle caderine dei vasi sanguigni proprio per il tipo di molecole a cui sono associate e alla capacità di trasdurre

sia il segnale di sopravvivenza che di controllo della migrazione dei leucociti da un ambiente all’altro.

C’è un interazione tra endotelio-pericita e cellule della parete dei vasi sanguigni che a volte richiedono

adesione con molecole con dominio extracellulare estremamente esteso.

L’attività di adesione della caderina è presente su tutta la membrana della cellula e le varie sequenze di

aminoacidi di tali proteine sono presenti nell’ambito extracellulare per quanto riguarda le molecole di

adesione, mentre per quanto riguarda il dominio intracellulare si ha il collegamento con il citoscheletro.

Nel dominio più esterno delle caderine sono presenti dei residui di triptofano che verranno riconosciuti da

tasche idrofobiche complementari o da domini della stessa molecola e questo fa si che la molecola di

adesione sia inattiva, perché si piega su se stessa e quindi non è disponibile per il collegamento, oppure su

una molecola presente su un’altra cellula. STRUTTURA DELLE CADERINE

La maggior parte delle caderine comprende un:

che contiene

N‐terminale extracellulare 5‐6

una

ripetizioni di domini caderinici, corta regione

e un

transmembrana C‐terminale

intracellulare.

L’unità ripetuta caderinica ha circa 110 aminoacidi e

consiste in sette filamenti disposti in una struttura

β‐barile simile alla ripetizioni di tipo Ig.

compatta a

Queste ripetizioni sono collegate da domini che

legano il Ca2+, e forniscono stabilità al dominio

extracellualre.

I domini caderinici sono numerati; quello più vicino

al N‐terminale è denominato «Extracellular

(EC1).

cadherin 1»

Il dominio intracellulare C‐terminale si lega a una

gran varietà di molecole che collegano le caderine al

citoscheletro .

Le caderine sono una grande famiglia di glicoproteine

8

che mediano l’adesione cellulare calcio dipendente e trasmettono segnali dalla matrice

extracellulare al citoplasma.

Le caderine spesso sono derivate da geni che subiscono processi di splicing alternativo e le varie

famiglie hanno in comune dei domini extracellulari che possono avere poche o tante ripetizioni.

Struttura a domini delle caderine.

Le caderine più note sono le “caderine dei

classiche”

vertebrati, e le ad esse

caderine desmosomiali

strettamente correlate. Queste proteine contengono un

prodominio (P) che segue immediatamente la

sequenza segnale, che viene rimossa mediante proteolidi.

Le caderine mature classiche e desmosomiali hanno

ectodomini composti da cinque ripetizioni extracellulari di tipo

caderinico (EC), una semplice regione transmembrana, e un

la ‐catenina

dominio citoplasmatico che interagisce sia con

(caderine classiche) o con la placcoglobina (nota anche come

g‐catenina) (caderine desmosomali).

Altri membri della famiglia delle caderine hanno domini con

strutture molto diverse, in drosophila per esempio sono

presenti caderine simili, ma presentano tanti domini diversi,

mentre nei vertebrati sono presenti domini dello stesso tipo.

I domini caderinici sono numerati a partire dall’esterno( Ec1-2-3-

e l’EC-1

4-5) è il dominio che presenta la struttura di

riconoscimento per le altre caderine.

Fra un dominio caderinico e l’altro sono presenti delle sequenze di

aminoacidi che sono specifiche per legare il calcio, quindi fra un

dominio e l’altro sono presenti dei domini che legano il calcio.

Le caderine per poter funzionare devono formare degli aggregati,

il minimo necessario è un dimero, ma spesso si devono formare

diversi aggregati, e tali aggregati daranno delle possibilità di

collegamento delle caderine sulle altre cellule.

Alcune caderine attraversano 7 volte la membrana plasmatica e

sono associate a proteine G, quindi sono proteine che partecipano

a trasduzione del segnale mentre altre proteine possono avere la

porzione proteica nell’ambiente extracellulare ed essere inserita

nella membrana da code di GPA e queste amano molti raft lipidici.

Ci sono anche delle caderine che sono recettori ad attività chinasica.

chelando il calcio è stato visto che se la concentrazione

Importanza del calcio per le caderine:

extracellulare è bassa la struttura della caderina non presenta quella rigidità che permette lo sporgimento

nell’ambiente extracellulare e la caderina casca su se stessa, quindi è impedita la possibilità di formare

legami con caderine simili nelle altre cellule.

molecole di caderina di una cellula si affiancano e si stabilizzano localmente

Modalità di stabilizzazione:le

con altre caderine dello stesso tipo.

La superfamiglia delle caderine può essere suddivisa nelle:

o caderine classiche tipo I e II

o caderine dei desmosomi

o protocaderine

o altre proteine correlate alle caderine sono tipiche delle cellule endoteliali, sono presenti delle

Le caderine vascolar endoteliar cadherin

patologie associate a tali caderine. 9

hanno una struttura simile fra loro mentre le presentano code

Le caderine classiche caderine non classiche

che interferiscono con i filamenti intermedi.

partecipano alla formazione delle sinapsi.

Le protocaderine

Sono importanti le proteine adattatrici che hanno una certa affinità in alcune zone dei domini intracellulari

delle caderine che possono competere fra di loro per l’aggregazione di strutture che possono modulare la

forma dei filamenti di actina.

Cellula

stromale

Cellula

endoteliale cellula tumorale

Le problematiche in cui sono studiate le molecole di adesione possono essere:

l’organizzazione di una cellula tumorale con l’endotelio, con una cellula stromale; la cellula stromale, la

cellula endoteliale e la matrice extracellulare e i microambienti in cui la cellula tumorale funziona

costantemente dà degli imput che condizionano il comportamento della cellula tumorale; molti studi sulle

strategie di sopravvivenza della cellula tumorale sono fatti in base ad interazione per esempio tra cellula

tumorale e cellula stromale. Ogni tipo

cellulare può

esprimere diversi

tipi di caderine, è

possibile vedere

nella stessa

cellula N-

caderina, E-

caderina, ecc.

Ogni tipo di

tessuto presenta

un particolare

corredo di

caderine ed è

diverso dagli

altri tipi di

tessuti. 10

Caderine classiche

Le caderine classiche presentano il dominio E caderinico, che è una regione che si trova nella regione n

terminale extracellulare in cui ci sono diverse sequenze a botte beta ripetuti che formano una struttura a

barilotto e contengono dei siti di legame per il calcio.

L’estremità carbossiterminale della proteina presenta una regione trans membrana e un dominio

citoplasmatico più o meno lungo mediante il quale può legarsi con molte proteine citoplasmatiche dove

molte di queste appartengono alla grande famiglia delle catenine, molecole citoplasmatiche che collegano le

caderine alle componenti citoscheletriche.

Posseggono un dominio citoplasmatico conservato che interagisce sia con la che con la

catenina‐beta

che a loro volta si legano con una catenina‐alfa.

catenina gamma,

La catenina beta è una proteina che può passare dal citoplasma al nucleo, è un fattore di trascrizione, quindi è

una proteina che in risposta a vari segnali può staccarsi dalla zona di adesione e andare ad attivare alcuni

geni. è una proteina che lega l’actina (Actin‐bindingprotein,

La ABP) che collega il complesso

catenina‐alfa

caderina‐catenina al citoscheletro. Questo ancoraggio intracellulare è richiesto per

un’adesione cellulare .

mediata da caderine funzionanti

CADERINE CLASSICHE DI TIPO I - Sono state le prime ad essere identificate e sono

nominate in funzione dei tessuti in cui sono state

identificate.

Il dominio extracellulare consiste in un pre‐dominio

N‐terminale seguito da 5 domini EC; il EC5 è

caratterizzato da 4 cisteine conservate non presenti

negli altri domini.

Il contiene un [W] conservato in

EC1 triptofano

posizione 2 nella proteina matura [W2] e una tasca

in grado di inserire il W2 di un dominio EC1 vicino, il dominio vicino può essere o una caderina

idrofobica

presente sulla stessa cellula o una caderina presente su un’altra cellula e ciò indica le varie possibilità di

attivazione o meno.

Nella struttura terziaria dei domini possono essere presenti degli aminoacidi che stabilizzano il triptofano

favorendo l’incastro di una caderina con la caderina vicina.

Dopo la rimozione del pre‐dominio (nel Reticolo Endoplasmatico), i residui N‐terminali [che includono il

triptofano in posizione 2 (W2)], formano un «braccio che interagisce con la «tasca

di adesione» accettrice»

nel corpo dell’EC1; si forma inoltre un tra il N‐terminale di un

legame ionico carico positivamente

(Asp) in posizione 1 [D1] e un residuo conservato di [E89] vicino alla tasca

asparagina acido glutamico

accettrice.

Se questa interazione ha luogo nell’ambito della stessa molecola di caderina, la molecola è «chiusa» e non è

in grado di dimerizzare.

La forma «chiusa» è in equilibrio con un forma «aperta» che può interagire con altre molecole sulla stessa

per mediare l’ adesione cellula‐cellula.

cellula (cis) e quindi fra molecole su cellule vicine (trans)

Per vedere quante catene di caderine possono associarsi e quanto può essere forte l’adesione bisogna entrare

nell’ambito di diverse proteine che si trovano nel citoplasma e sono presenti diverse modalità di interazione

delle code che possono promuovere o l’aggregazione e questo rende l’adesione più

fra di loro con varie zone

forte o la separazione e ciò rende l’adesione più debole; dobbiamo immaginare che nei processi di distacco

delle cellule dall’epitelio verranno utilizzate delle modulazioni che provocano il distacco.

Si ha adesione omofilica quando l’ancoraggio tra due molecole diverse avviene mediante «dimerizzazione

con scambio di filamenti» («strand swap»). 11

all’interno di EC1 è una

Un che consiste in istidina, alanina e valina( [HIV], aminoacidi 79‐81]

tripeptide essenziale per l’adesione cellulare mediata dalla caderine di tipo 1.

sequenza di riconoscimento

Le caderine classiche manifestano specificità omofilica:

– La E‐caderina si lega più fortemente alla E‐caderina di quando non si leghi con altre caderine.

delle caderine classiche interagiscono con proteine coinvolte nell’endocitosi

I e nel

domini citplasmatici ed anche con il di

segnalamento intracellulare citoscheletro actina.

interazioni con l’actina

Le sono cruciali per la loro e per formare cellula‐cellula

aggregazione adesioni

stabili.

La coda citoplasmatica delle caderine ha un «juxtamembrane (JMD) e un «C‐terminal

domain»

(CBD). Ognuno di questi domini può legare particolari proteine.

domain»

catenin‐binding Schema della struttura del dimero di

filamenti dei domini EC1-EC2 di Ecaderina

umana. Le due molecole

sono correlate da un asse di

simmetria binaria. Ogni molecola

interagente inserisce il suo residuo

Trp-2 nella tasca accettrice della

molecola correlata della diade. Tre

atomi di qui illustrati da cerchi

Ca2+,

rossi, si trovano all’interfaccia fra i

singoli domini caderinici della Ecaderina,

in questo modo conferendo rigidità alla molecola

Per esempio subito sotto la membrana Il JMD si lega alla catenina p‐120 e stabilizza

la molecola alla superficie cellulare mentre il CBD si lega alla ‐catenina che lega le

caderine classiche al citoscheletro di actina mediante intermediari quali la α‐catenina

e la vinculina.

Le caderine classiche interagiranno indirettamente con i filamenti di actina.

Le actine sono delle specie di perline globulari che polimerizzano formando due

filamenti strettamente intrecciati (l’actina filamentosa), l’actina globulare può

collegarsi o distaccarsi, può essere un filamento lungo o corto e può formare dei

legami crociati, quindi tale struttura è estremamente dinamica.

Proteine di tipo diverso possono formare dei fasci alcuni vicini

mentre altri lontani e tutte queste proteine possono essere

fosforilate cambiando conformazione e cambiando affinità le une

per le altre.

Le varie cellule sono collegate tra loro da giunzioni più o meno

forti e quindi nei vari tipi di tessuti sono stati identificati varie

possibilità di intreccio delle varie subunità. Nei vari tipi di epiteli

monostratificati, pluristratificati e in altri tipi di cellule collegate

fra loro è possibile avere delle interazioni anche laterali e non solo

per quanto riguarda le varie tasche.

Ci sono dei processi di trasduzione del segnale di tipo meccanico;

la tensione meccanica di una cellula è propagata alle altre cellule e

avviene la meccano trasduzione cioè un segnale meccanico

(contrazione, dilatazione, compressione, ecc) può indurre un cambiamento dell’espressione genica o

12

dell’attività di qualche enzima all’interno della cellula tramite l’interazione delle code delle caderine con

varie molecole che sono all’interno della cellula; quindi le forze che agiscono sulla superficie attivano dei

processi meccano sensoriali che portano a risposte meccaniche della cellula che dipendono da queste forze.

Le caderine agiscono come recettori di superficie per le forze che agiscono sulle cellule; tali forze inducono

una cascata di segnalazione intracellulare che includono eventi come alterazioni conformazionali proteici,

catenina e ciò cambia l’interazione con l’actina o il reclutamento con altre proteine.

per esempio nella

La risposta meccanica seguente può coinvolgere il citoscheletro di actomiosina con la miosina come

alterare la rigidità dell’adesione. Quindi

proteina motore che può provocare piccola contrazione che possono

un risultato finale di ciò possono essere delle forze di compressione sulle cellule vicine che dà inizio ad una

cascata e porta ad un’alterazione cooperativa fra le cellule

CADERINE CLASSICHE DI TIPO I:

E‐CADERINE

- Si trovano nella maggior parte dei tessuti epiteliali e sono richieste per molti aspetti della morfogenesi

epiteliale. l’invasività e potenziale metastatico

- Una correla con dei tumori umani,

ridotta espressione di caderine

che la disfunzione delle E‐caderine possa contribuire alla progressione dei carcinomi.

il che suggerisce all’integrina

- Oltre che al legame omofilico, la E‐caderina può legarsi alfa IEL beta7.

CADERINE CLASSICHE DI TIPO I:

N‐CADERINE

o La N‐caderina è espressa nelle cellule endoteliali, cellule neuronali e

di promuovere l’attività

alcuni tipi di tessuto muscolare; inoltre ha il potere

di crescita dei neuriti. Nel campo della neurobiologia è studiato il loro ruolo

nella formazione del cono di crescita che darà origine all’assone

.

CADERINE CLASSICHE DI TIPO I:

P‐CADERINE

La P‐ caderina è particolarmente espressa nel tessuto embrionale e permette il collegamento di cellule per

formare la placenta e l’aggregazione dei vari epiteli durante la

fase di gastrulazione.

L’espressione di P‐caderina durante l’embriogenesi è regolata

in modo dipendente dalla fase di sviluppo e sembra essere

diversa nei topi rispetto agli esseri umani.

. Caderine di tipo II

Hanno un rispetto alle caderine classiche,

pre‐dominio più corto mancano di sequenza di riconoscimento

HAV (histidine, alanine, valine), e hanno conservati di nelle posizioni 2 e 4

due residui triptofano in EC1

è stato eliminato nell’ER),

[W2 e W4] della proteina matura (dopo che il pre‐dominio con una tasca di

riconoscimento più ampia.

I domini EC1 di di caderine di tipo II vicine dimerizzano in modo simile a quello delle caderine di tipo I, con

W2 e W4 che si inseriscono in un sito accettore su una molecola vicina e un legame salino che si forma tra il

Nterminale e un residuo conservato di acido glutammico.

Tuttavia, con altri

le caderine di tipo II hanno una maggiore tendenza a formare legami eterofilici

sotto‐membri di tipo II di quanto non lo facciano le caderine di tipo I.

Il dominio intracellulare delle caderine di tipo II è simile a quello delle caderine di tipo I tranne che nel fatto

che il CBD si lega alla invece che alla

‐catenina ‐catenina. 13

CADERINE CLASSICHE DI TIPO II:

SCOPERTE RECENTEMENTE

CADERINE 5‐12 è coinvolta nell’adesione delle cellule endoteliali e può essere importante

La caderina 5 (VE‐caderina)

nell’angiogenesi e nel controllo della permeabilità vascolare, cioè la capacità di far fuoriuscire il plasma dai

vasi sanguigni che può essere importante nei processi in cui l’edema è necessario per diluire per esempio le

tossine, o per nutrire di più il tessuto, ecc, quindi questa permeabilizzazione o meno del legame

dell’endotelio condiziona quanto plasma esce dai vasi sanguigni e ciò in molte patologie è alterato, per

produzione di edema.

esempio si ha un’esagerata CADERINE DESMOSOMIALI

Funzionano nei desmosomi a borchia.

Nell’Uomo ci sono 7 caderine desmosomali: tre

(DSC 1‐3) e quattro (DSG

desmocolline desmogleine

1‐4).

Entrambe le famiglie hanno 5 domini EC, nonostante il

5° dominio sia meno ben conservato.

I domini EC1 delle proteine desmocollina e desmogleine

sono strutturalmente simili a quelli delle

proteine classiche (ad es. un triptofano [W2] e un acido

glutamico [E89] conservati) ed è probabile che

dimerizzino anche essi tramite «strand swapping»

(scambio di filamenti). all’interno del desmosoma, che interagiscono con

Si ritiene che le caderine desmosomali formino dimeri cis

dimeri su una cellula vicina, con preferenza fra interazioni eterofiliche fra proteine DSC e DSG.

Presentano delle code che interagiscono con i filamenti intermedi.

In tale slide è possibile osservare le caderine desmosomiali che vanno ad interagire tramite diverse proteine

mediatrici con i filamenti intermedi.

Nei lavori più recenti in cui si parla delle caderine soprattutto negli emidesmosomi si fa molta attenzione a

come può essere modulata in modo dinamico l’attività delle caderine, quindi la loro stabilità è riferita nel

termine di modulazione.

PROTOCADERINE Sono il gruppo più esteso di caderine con almeno 70 membri.

Hanno 5 o 7 domini EC, un’ unica regione transmembrana e domini citoplasmatici divergenti.

I suoi membri non contengono un residuo di triptofano in posizione 2 (W2) nè un sito accettore conservati

nel loro dominio EC1.

Vice‐versa, hanno due residui di cisteina conservati e un loop S‐S nel loro dominio EC1 e un dominio RGD

(arginina, glicina, aspartato). 14

E’ interessante notare che in conformazione

le protocaderine mediano adesioni omofiliche e eterofiliche

e possono essere coinvolte in adesione omofilica dopo avere formato complessi con altre molecole.

cis trans

Possono collegare la coda con proteine con attività tirosinchinasiche quindi sono dei modulatori dei segnali.

Sono stati identificati pochi partners di legame per i domini intracellulari, ma uno è la tirosina chinasi Fyn,

che si lega al dominio costante della famiglia delle α‐protocaderine.

Le protocaderine sono state studiate nel sistema nervoso perché sono fondamentali per la creazione delle

varie sinapsi che si devono formare durante lo sviluppo del sistema nervoso. Sono organizzate da proteine

scaffold che collegano i vari canali e tutte le strutture coinvolte nella recezione dei neurotrasmettitori.

Nell’organizzazione degli astrociti con i neuroni anche il collegamento del neurone con la cellula di sostegno

è modulato da molte proteine di questo tipo.

I circuiti neuronali richiedono un preciso e coordinato controllo dell’interazione in tutti gli stadi dello

sviluppo che vanno dallo sviluppo dei neuroni a migrazione del neurone ma anche del cono di crescita.

un’azione concomitante di diverse proteine sulla superficie cellulare che devono interagire in

È necessaria

modo dinamico in modo da poter avere le cellule di sostegno ed i neuroni nella posizione giusta e fra queste

la maggior parte di questi recettori appartengono alla famiglia delle protocaderine.

La capacità di avere un legame più o meno stretto è dato dalla possibilità di avere la fosforilazione, anche la

presenza di calcio è importante e la possibilità di organizzare delle reti di actina più o meno tese

nell’ambiente extracellulare è collegato con la fosforilazione.

La trasduzione del segnale mediato da caderina è fondamentale per la vita della cellula.

La caderina è particolarmente espressa nelle cellule endoteliali, se le cellule non presentano le caderine è

come se ricevessero un segnale per morire e ciò è dovuto al fatto che il segnale di vita e proliferazione di tali

cellule è un recettore per VEGF associato alla VE caderina, in carenza di tale segnale la cellula va in

apoptosi. alla trasmissione di segnali verso l’interno della cellula.

Alcune possono La

collaborare

caderine l’adesione fra cellule endoteliali,

caderina vasculoendoteliale (VE‐caderina), ad esempio, media non solo

dell’endotelio. Nonostante le cellule

ma viene anche richiesta per la sopravvivenza endoteliali che non

grado di aderire una all’altra tramite la N‐caderina,

esprimono la VE‐caderina, siano ancora in esse non

sopravvivono e vanno incontro ad apoptosi.

La loro sopravvivenza dipende da una proteina segnalatrice extracellulare chiamata Vascular Endothelial

(VEGF), il quale si lega ad un recettore ad attività tirosina chinasica che usa la VE‐caderina

Growth Factor

come co‐recettore.

Spesso per studiare la struttura dei tessuti sono visualizzate le molecole di adesione e spesso si vede in che

modo tali molecole sono associate al citoscheletro in situazioni patologiche.

Nei processi di transizione epitelio-mesenchimale che permette il distacco di cellule che formano metastasi o

di tali proteine.

danno origine a crescita tumorale è fondamentale lo studio dell’espressione

varie fasi dell’organogenesi,

Quando per esempio si studia lo sviluppo embrionale nelle ma anche dalla

segmentazione in poi, la blastula è un esempio di adesione fra cellule epiteliali e da questa blastula si

distaccano varie cellule (questa è una transizione epitelio-mesenchimale) tali cellule migrano ed in certe zone

si riassemblano già con caratteristiche di differenziamento diverso ed esprimeranno delle molecole di

adesione appartenenti alla stessa famiglia ma di diverso tipo. Anche tali processi che sono fondamentali per

la formazione di strutture tubulari richiedono adesione nella zone apicale rispetto alla zona basale degli

epiteli.

Complesso giunzionale intercellulare

Ci sono dei casi di adesione non tipica che avvicina il terminale sinaptico di una cellula al terminale post

sinaptico di un’altra e tale avvicinamento è modulato da molecole di adesione e tale avvicinamento è

l’avvicinamento delle zone in cui deve essere rilasciato il

importante per neurotrasmettitore.

PATOLOGIE DIRETTAMENTE COLLEGATE ALLE MOLECOLE DI ADESIONE

Ci sono tante patologie collegate alla disfunzione delle molecole di adesione. 15

Per esempio ci sono diverse patologie collegate alla non adesione delle cellule epiteliali l’una all’altra,

soprattutto nei desmosomi, ed il fatto che questa adesione non sia stretta fa si che gli epiteli non riescono a

rispondere come un complesso unitario, quindi se c’è un abrasione o qualche trauma, normalmente tramite

le giunzioni tutte le proteine reagiscono in modo coordinato mettendo in connessione la molecola di adesione

con il citoscheletro, ma se le cellule non sono collegate fra di loro in modo stretto, una continuazione di

situazione traumatica come l’abrasione soprattutto nell’epidermide fa sì che alcune cellule si distaccano dalle

altre e l’epitelio non è più una difesa contro l’invasione batterica formando così delle bolle, in seguito tali

bolle si rompono e sono presenti delle continue infezioni e ciò è dovuto alla formazione di anticorpi contro

le proteine di adesione.

Molte patologie collegate alla non o poca espressione di proteine che sono presenti nei leucociti e che

permettono di richiamarli dalla circolazione per andare nei siti dove il tessuto è danneggiato, sono quindi

coinvolte nel richiamo dei leucociti dal sangue ai tessuti danneggiati, e se tale proteina non funziona bene si

ha una patologia detta dove la persona non è sottoposta alla

deficienza di adesione leucocitaria, LAD

risposta immunitaria e può quindi avere molte infezioni.

anche un’altra patologia detta

È possibile avere collegata alle proteine

LAD-2 (deficienza di adesione)

che sono utilzzate dalle selettine sull’epitelio per selezionare i globuli bianchi, ma

altamente glicosilate

essendo poco glicosilata dovuto a problemi che si svolgono nell’apparato di golgi, la parte di zuccheri

riconosciuti dalle selettine non è sufficiente e quindi non possono richiamare i leucociti nella zona

danneggiata; essi causano problemi di emofilie varie con gradi più o meno pesanti dovuti all’incapacità delle

piastrine di formare il tappo piastrinico e quindi incapacità di poter sigillare i danni nei vasi sanguigni; sono

quindi esempi di mal funzionamento di molecole di adesione con patologie gravi.

l’arterosclerosi,

Un'altra patologia è o che è un danno che si trova in

il danno da ischemia/riperfusione

tante patologie, qui c’è un trombo che impedisce il passaggio del sangue e quindi i tessuti rimangono

ipossigenati per un certo periodo di tempo, se il trombo viene degradato o il tessuto fa percorsi alternativi di

circolazione c’è riossigenazione dopo ipossie e ciò provoca la presenza di un grande numero di radicali, i

vasi richiamano molti globuli bianchi, ci sono delle patologie collegate a ischemie/riperfusione dovute al

fatto che il tessuto richiama molti globuli bianchi; anche nei processi chirurgici ciò è un problema perché

e non si ha sanguinamento durante l’operazione c’è un periodo

quando i chirurghi clampano i vasi sanguigni

di ischemia e nei tumori tale situazione si presenta in varie zone, perché c’è una tendenza del sangue a

diventare più viscoso, si ha molta aggregazione piastrinica e molto spesso ci sono situazioni di deficienze di

ossigenazione che possono essere seguite da riossigenazione e quindi nella crescita tumorale spesso si hanno

tali problemi. 16

SEMINARIO: TRANSIZIONE EPITELIO-MESENCHIMALE

In vari campi della patologia si sente parlare della possibilità che cellule appartenenti a tessuti di tipo epiteliale

potesse o sta a si e assu e e a atte isti he di u a ellula ese hi ale o del o etti o dell’e io e,

cellule singole che possono migrare.

Negli ultimi 4-5 anni si è pensato che tutte le patologie avessero una componente di transizione epitelio-

mesenchimale, poi sono sorti dei dati che hanno messo in dubbio la differenziazione e adesso si è in una via di

mezzo.

L’a ie te i ui si studia questo processo, oltre allo sviluppo embrionale, per ovvi motivi, è quello della

crescita dei tumori e della disseminazione metastatica e il fatto che molte cellule tumorali venendo a trovarsi in

ambienti poco ossigenato con poco nutrimento, cellule di origine epiteliale, carcinomi, che avendo la

prospettiva di morire per mancanza di nutrimento o ossigeno innescavano il processo di transizione epitelio-

ese hi ale pe sfuggi e all’a ie te o otti ale pe e ig a e alt o e.

Conviene vedere cosa è questa transizione e quali sono alcuni dei parametri che sono studiati.

Molti dei processi in cui si verifica questa transizione da caratteristiche di cellule che sono totalmente epiteliali

gast ulazio e i a a ti, ell’i asio e delle

a caratteristiche di cellule migranti, si hanno, dal momento della

metastasi e in alcune patologie.

È importante capire quali sono i segnali che inducono in una cellula questo cambiamento di fenotipo e quali

sono la proteine che spariscono per dare luogo a proteine di un altro tipo.

Le caratteristiche delle celle cellule epiteliali:

 cellulari: tight junctions, adherens junctions, desmosome (resistenza agli stress) con possibilità di avere

delle zone di comunicazione tra i vari citoplasma che sono le giunzioni gap, importanti anche per la

o di isio e di io i, se o di essagge i e o ole ole g a di. Se l’a ie te di u a ellula di e ta

poco compatibile con la vita, le gap junction cambiano conformazione, il poro è ostruito e la cellula

muore senza contagiare le altre cellule.

Le giunzioni di membrana sono caratteristiche tipiche delle cellule epiteliali. Altra caratteristica è che in

molte cellule i vari domini della membrana svolgono funzioni diverse e ciò è detta polarizzazione apico

baso-laterale, le tight junction di solito fungono da barriera per la diffusione laterale di proteine e

quindi permettono di stabilire la polarizzazione di queste cellule e spesso il movimento è molto meno

ostacolato nel versante laterale e basale, solo che solo le proteine caratteristiche delle giunzioni

rimangono in queste zone e in quelle di adesione della matrice perché a ridosso della membrana si

trovano proteine scaffold particolari per fermarle in quella zona specifica. Ma la polarità è stabilita

anche in gran parte dalle tight junction.

 Polarizzazione apicale baso laterale

 Capacità migratoria limitata o assente

 Espressione di cheratine specifiche

 E-caderina e actina corticale (fornisce elasticità)

Le cellule epiteliali sono anche caratterizzate dai filamenti intermedi della famiglia della cheratina e hanno la

caratteristica di presenza abbondante di e-caderine, specialmente abbondanti nella zona aderente e nelle

giu zio i a o hia e u adde sa e to olto p o u iato dell’a ti a he fo a delle eti t idi e sionali che

conferiscono anche la forma alla cellula.

Le cellule del tessuto connettivo sono caratterizzate da:

 Non si formano giunzioni stabili con altre cellule

 Carenza della tipica polarizzazione apicale-basale (anche un fibroblasto, di fatto è polarizzato, perché

la parte basale contiene le proteine di adesione per la matrice, mentre la parte apicale contiene

microvilli e ondulazioni varie coinvolte nel contatto con vie extracellulari e quindi di fatto anche se non

esiste una barriera chiara come la tight junction tra il dominio basale e il dominio apicale anche la

cellula mesenchimale ha una certa polarità, dovuta a funzioni diverse dei vari versanti) 1

 Aumentata degradazione della matrice ad opera di metallo proteasi, per avere varchi nel connettivo

dove camminare.

 -smooth

Espressione di proteine mesenchimali: Vimentina, muscle actin (SMA), Fibronectina

Fibroblast Specific protein -1 (FSP-1) i e ti a e l’SMA

La sono marcatori delle cellule del

connettivo, specie di quelle che si muovono. La fibronectina

è una glicoproteina della matrice che ha anche delle

versioni che rivestono la cellula e fungono da collegamento

o l’a ie te e t a ellula e e o olte i teg i e. Qui di

questo può essere vista come una specie di sottilissima

ragnatela che ha delle isoforme che rivestono la cellula al di

fuori e altre isoforme che tendono a formare grossi

polimeri che si depongono nella matrice extracellulare e di

solito , le piste che le cellule seguono per migrare sono

molto ricche di fibronectina. Ci sono altre proteine che

sono marcatori specifici dei fibroblasti che poi sono espressi

nelle cellule connettivali e non in quelle epiteliali.

Le caderine con le loro proteine associate, chi vicina alle

membrane coma le p120 e le altre che formano una specie

in incastellatura con altre proteine come la vinculina, che

fas i o l’a ti a, ui di asso ia

forma meccanicamente la

parte contrattile della cellula data dal citoscheletro di

actina con tutte le proteine associate, al collegamento con

le altre cellule.

Swap, significa rimescolare e molte teorie descrivono in che modo le caderine su cellule diverse si associano, in

che modo trovano strutture complementari e così via. Queste sono basate su swapping o rimescolamento dei

domini esterni che permette di trovare strutture complementari. Quindi il legame che le caderine

promuovono, in vari tipi cellulari sono più o meno forti e sono basati su organizzazione molto particolare di

questi domini.

La forza di adesione dipende sia da organizzazione di

caderine sulla stessa cellula (interazione in cis),

interazione tra cellule diverse( in trans) che è anche

interazione di stabilizzazione laterale di vari domini.

Uno degli argomenti che tratteremo parlando delle

famiglie delle integrine è quello che, queste molecole

di adesione dimeriche specializzate molto per il

contatto con ambiente extracellulare sono anche

mediatori di segnale che si riflettono sulla morfologia

della ellula e sull’esp essio e di al u i ge i.

Questo è mediato ancora una volta dal collegamento

delle code delle molecole di adesione con proteine

he o ga izza o l’a ti a, he si hia a o talli a

(actin binding proteins) che fa dei fasci e possono

competere per il legame con le integrine e

promuovere la loro attivazione, ossia un cambio di conformazione da inattivo in cui le teste cascano sulla

teste i te agis a o l’u a

membrana o una conformazione attiva che richiede che le code si allontanino e le due

o l’alt a o e p otei e. Di e se di ueste p otei e d’i te azio e ispo do o a seg ali a i e ui di le 2

i teg i e so o le tipi he p otei e di ediazio e t a l’a ie te este o e l’a ie te i te o della ellula.

Diventano molto importanti nel cambiamento da epiteliale a mesenchimale.

La transizione da una cellula epiteliale a una mesenchimale prevede la possibilità di avere passaggi diretti da

u o stato all’alt o. Le tappe che possono normalmente avvenire in una

cellula epiteliale che comincia a staccarsi e migra, può

anche avere la capacità di degradare la lamina basale

dell’e dotelio dei asi, a dare in un vaso sanguigno,

migrare lontano, trovare un ambiente idoneo, uscire e

i ost ui e l’a ie te epiteliale.

La transizione è modulata da escrezione progressiva da

caderine varie per cui, per esempio da un ectoderma in

un neuroderma si ha una progressiva espressione di

caderine di tipo neuronale e uno smistamento delle cellule che portano alla formazione di strutture che

esprimono solo la N-caderina. Quindi, lo smistamento cellulare durante lo sviluppo embrionale richiede

u ’esp essio e diffe e ziale di aderine che poi le porta a separarsi tra di loro.

La pe dita dell’esp essio e della ade i a, o al e te è associata ad un innesco del programma della

transizione epitelio mesenchimale.

dita dell’esp essio e della aderina

La pe o il modo di espressione inadeguato è molto importante nella

disseminazione delle cellule metastatiche, indipendentemente dalla conversione. La forma e il cambiamento di

forma dei tessuti che possono passare da struttura epiteliala sottile e bassa a formare struttura epiteliale ma

molto più alta come la placca neurale, ad esempio, richiede che ci sia un rimescolamento delle varie caderine.

A he ella fo azio e della es ita dell’asso e dei eu o i, si ede he i sia u a ia ento di

esp essio e di ade i e he sta a edia e osta te e te l’i te azio e dei o i o l’a ie te este o. Diverse

caderine sono importanti per la giunzione sinaptica e quindi durante il processo che da un neuroblasto si passa

ad u eu o e ’ lu go la struttura la membrana della cellula, nelle varie zone, un progressiva espressione di

caderine specifiche per le varie zone della cellula.

Nel campo della neurobiologia la plasticità della formazione delle sinapsi può essere studiata anche in termini

di espressione o meno delle varie protocaderine che sono importanti per avvicinare i due bottoni e delle N

ade i e he so o i po ta ti ella zo a dell’asso e.

Nella camera delle uova di Drosophila, dove ci sono le cellule derivate

ig a o, e si osse a he ’ a ia e to di

dalle cellule nutrici, che

espressione delle caderine. Contrariamente al suo ruolo nella

epiteliali, la E‐ ade i a edia inoltre

stabilizzazione delle giunzioni la

migrazione a lunga distanza delle cellule attraverso i tessuti come ad

esempio nella migrazione delle cellule marginali (rosa) nella camera delle

uova. Le cellule marginali migrano da una estremità dalla camera delle

aggiu go o l’oo ita.

uova fra le cellule nutrici finché non

Molti studi sulla transizione sono stati fatti coltivando le cellule in colture tridimensionale con della matrice che

promuove la formazione di aggreganti ed è possibile con dei marcatori particolari (Ab marcati con

fluorescenza) vedere il cambiamento di espressione della E-caderina, e la vimentina: quindi si vede che la

ade i a ie e pe sa, au e ta olto l’a ti a e ’ po a i entina che diventa molto più espressa in una

specifica zona della cellula. 3

L’espe i e to, con il TGF

(Transforming Growth

Factor) induce la transizione e

si hanno strutture di tipo

fibroblasto che non

esprimono più la N-caderina

ma cominciano ad esprimere

molta actina nel citoplasma,

tutte le cellule esprimono

l’a ti a, pe hé è la proteina

del citoscheletro che dà

forma alla cellula, solo che la

cellula epiteliale è molto

addensata sotto la membrana

plasmatica, mentre nei

fibroblasti la distribuzione

diventa soprattutto presente

nel citosol e non sotto la

membrana.

Le caratteristiche interessanti delle cellule del connettivo embrionale e dei tessuti adulti: la cellula aumenta la

te all’apoptosi; o ha più

capacità di migrare ed invadere; diventa molto più resiste tanto bisogno di

adesione cellula- matrice per poter vivere e diventa una cellula che produce molte glicoproteine, proteoglicani,

polisa a idi o e l’a ido ialuronico che sono componenti della matrice. Questo è uno dei punti chiave perché

la cellula possa separarsi da un epitelio.

La lamina basale è una struttura molto specializzata della matrice che funge da sostegno meccanico alle cellule,

ma anche da filtro molecolare per le sostanze che possono passare dal connettivo alle cellule. Quindi, la lamina,

ha molte cariche negative dovute a proteoglicani e quindi respingono gli anioni e fanno passare cationi e ha

una struttura molto più estesa in superficie che in spessore, quindi una lamina, con delle proteine che formano

una rete di collegamento si con le proteine di adesione della cellula, sopra, sia con organizzazione del

connettivo, sotto. È una specie di frontiera a cui si possono legare dei segnali vari che sono dei piccoli peptidi

e a esso all’epitelio.

che possono ave

La la i a asale o è solo u sosteg o e a i o a a he la via di o u i azio e dell’epitelio o il

o ettivo dove i so o i vasi sa guig i, i ervi, e …

La lamina una barriera che di solito impedisce che le cellule del connettivo migrando invadano il tessuto

epiteliale, è quindi, anche, una barriera alla migrazione delle cellule connettivali. Se invece è la cellula

dell’epitelio he de e passa e dall’alt a pa te, uesta de e deg adare localmente la lamina e quindi esprime

sulla superficie, o secerne, delle proteasi che localmente aprono dei varchi e questa riesce a passare, questo è

uno dei punti più critici di questo cambiamento.

Lavori di Kalluri et al: la transizione epitelio mesenchimale è importante durante lo sviluppo embrionale

pe h dallo zigote, l’uovo le ellule dell’o ga is o

fertilizzato, deriveranno tutte e la complessità progressiva

richiede un processo di di differenziamento e di grande plasticità. Quindi durante tutte le fasi della

e ’ u o ti uo passaggio he po ta a a ti e i diet o f a gli sta hi

gastrulazione, organogenesi e così via

epiteliali e mesenchimali e questo fa parte del normale sviluppo embrionale.

Quando sono totalmente differenziate, le cellule epiteliali di solito cominciano ad esprimere delle proteine

ifi he pe la fu zio e di uel tessuto lì he so o fegato, e e e … e t e le ellule del ese hi a

spe

saranno di solito cellule di sostegno, non solo di tipo fisico, ma anche trofico e di segnale.

si a uta l’idea,

Per molti anni, che una volta che la cellula raggiungeva uno stato di differenziamento finale

rimaneva in quello stato permanentemente, adesso questa idea è sfidata da osservazioni che anche delle 4

cellule in un epitelio che era considerato in modo terminale potessero alterare il fenotipo e attivare un

programma EMT (transizione epitelio-mesenchimale), tornando indietro nello sviluppo embrionale. Ciò

permetterebbe quello che è descritto come trans differenziamento, termine che nel campo delle cellule

sta i ali stato utilizzato pe e a e di spiega e l’uso di ellule sta i ali pe ipa a e tessuti da eggiati.

Oltre al trans differenziamento si discute anche della fusione ossia una cellula staminale emopoietica , per

esempio richiamata per riparare un tessuto danneggiato arriverebbe al tessuto e si tran differenzierebbe in un

tessuto a dia o, e ale, epati o e … e uesto o i pli a u au e to dei o oso i, a se pli e e te u

di diffe e zia e to. L’alt a teo ia he a o a oggi e a di

cambiamento del programma spiegare il riparo di

tessuto danneggiati da parte di cellule provenienti dal midollo o emopoietico o mesenchimale è quella detta

fusione ossia questa è una cellula mesenchimale o staminale che si fonde con una cellula e lavorando insieme

questo implicherebbe la riparazione del programma sbagliato della cellula danneggiata. Questo implica un

raddoppiamento del genoma, è stato difficile sono state utilizzate tecniche di ibridazione in situ per i vari

cromosomi, e qualche volta si sono osservate cellule aventi il doppio dei cromosomi , ma non era abbastanza

e, ’ u a te za

convincere tutti che fosse un processo di fusione. Adesso, dato che la ricerca è in evoluzio

teoria basata su micro vescicole in cui le cellule mesenchimali produrrebbero delle vescicole con proteine

mRNA o miRNA che sono catturate dalle cellule danneggiate per riparare il tessuto. Quindi ci sono ancora delle

teorie diverse sul fatto che si possa avere un riparo del tessuto a partire da cellule che hanno caratteristiche

ell’a ito dell’e e tuale t a sizione

non epiteliali. Ma epitelio mesenchimale si parla di questo trans-

differenziamento, conversione di epiteliale e mesenchimale, non solo durante lo sviluppo, ma anche in un

i p o essi ell’adulto di ipa o dei tessuti da eggiati

individuo adulto. Probabilmente possono anche innescare

queste modificazioni, infatti in molte situazioni di infiammazioni croniche e carcinomi invasivi questo processo

sembra essere molto frequente. pe dispe de e le ellule ell’e io e,

Sono noti vari tipi di EMT che costituiscono meccanismi, riconosciuti,

per formare cellule mesenchimali nei tessuti danneggiati e iniziare il comportamento invasivo e metastatico.

I asi o e etastati o so o p o essi di e si, l’invasione igua da l’atta o al tessuto o ale atto o alla

massa tumorale e richiede parecchia degradazione della matrice e un inserimento delle cellule tumorali tra le

cellule che avranno tessuto normale attorno, varie volte, anche con ematossilina-eosina si può vedere che nella

zo a di i asio e di u tu o e le ellule ha o u a fo a o ale, spesso so o dista ate l’u a dall’alt a e

e us ola i, dell’epitelio e … e t e la zo a

formano come dei tentacoli che vanno in mezzo alle fas

posteriore del tumore sembra un epitelio malconcio, disorganizzato e morfologia cellulare diversa, e ciò vuol

dire accrescersi a scapito del tessuto sano circostante. La disseminazione metastatica o invazione, invece, è

dovuta a cellule tumorali che si sono distaccate hanno invaso i vasi sanguigni o linfatici, molto più facilmente

quelli linfatici perché hanno le pareti molto sottili e hanno delle cellule endoteliali per far uscire ed entrare la

linfa. Le cellule endoteliali hanno dei lembi , la linfa proveniente dal liquido tissutale e va tramite i vasi linfatici

alle vene e poi ritorna per filtrazione nei capillari, per entrare nei vasi linfatici non deve trovare ostacoli e

ui di l’e dotelio fatto o la possi ilità di alza e dei le i e ui di fa us i e la li fa. La disse inazione ai

linfonodi, che è così preoccupante, è, quindi, dovuta alla facilità di invadere i vasi linfatici. Nei vasi sanguigni

l’i asio e si ha elle e e e o elle a te ie pe h la st uttu a dell’a te ia u a a ie a e a i a, olto

più spessa della parete delle vene, ha molti più strati di connettivale, di cellule muscolari ecc.. e ci vuole,

quindi, molta più degradazione per entrare in un arteria e non in una vena. Quindi le cellule tumorali scappano

dai tessuti poveri di nutrienti lontani dai vasi sanguigni. Una teoria sullo stimolo per la disseminazione

etastati a l’allo ta a e to da u a ie te tossi o. La metastatizzazione è un evento frequentissimo,

ossia, il fatto che diverse cellule tumorali finiscano nei vasi sanguigni e nei vasi linfatici è frequentissima, per

fortuna non tutte le cellule tumorali sopravvivono, muoiono specialmente quelle nei vasi sanguigni perché il

sangue ha una pressione di trascinamento soprattutto nella parte delle arterie che danneggia la membrana

delle ellule e l’ossige azio e del sa gue e u o sho k pe le ellule tu o ali he giu go o da tessuti se za

pu t oppo l’a ie te ei

ossigeno; vasi linfatici non è così traumatico perché è poco ossigenato e quindi non

’ u a a ata a iazio e di ossige azio e o l’a ie te da ui le ellule pa ti a o e il flusso li fati o o

forte e quindi i traumi per le cellule tumorali sono molto minori e qui non subiscono danno e possono arrivare 5

a destinazione, spesso, nei linfonodi. È quindi importante capire le varie strategie che i tumori usano per

sop a i e e a spese dell’o ga is o, pe pote poi usa e u a te apia adatta sul pazie te e tra le strategie usate

dai tu o i ’ a he la EMT. Classificazione dei vari tipi di transizione:

Tipo 1 Tipico dei processi embrionali che danno

origine a mesoderma, endoderma e cellule che si

muovono come quelle delle piastre neurali o germinali.

È un processo dove da un epitelio primitivo si ha un

mesenchima primitivo che può subire modificazioni e

convertirsi in epitelio e si sa che da questi secondi tipi di

epitelio ci sia un differenziamento che porta alla formazione dei vari tipi di cellule epiteliali ma anche dei vari

ale he a o dagli adipo iti, o d o iti, osteo lasti e … ui di tutto u

sottotipi di cellule di tipo connetti

processo di differenziamento specifico.

Il tipo 1 è considerato il processo tradizionale, normale, dello sviluppo embrionale.

Tipo 2 è scatenato da stimoli diversi e si vede nelle situazioni patologico

in cui un organo danneggiato può sostituire delle cellule morte con altre e

ciò può avere come contraccolpo la fibrosi dei tessuti. La fibrosi è una

produzione abnorme di collagene che può essere vista dai patologi come

tentativo di circoscrivere la zona danneggiata (ad esempio la fibrosi attorno

ad una zona affetta da virus serve per bloccare la disseminazione del virus).

La fibrosi, di fatto, è un problema, poiché ostacola la diffusione delle

sostanze, ad esempio si ha un fegato che ha avuto problemi legai a virus, ad

abuso di alcol o di farmaci in modo continuato e si comincia a vedere una

produzione di collagene, spesso non solo nel connettivo portale, ma anche

diet o le ellule dell’e spazio diet o l’e dotelio dei si usoidi

lungo i sinusoidi dotelio e nello spazio di Disse

epatici in cui sono filtrati il plasma del sangue con quasi tutte le lipoproteine, tranne quelle molto grandi, per

dall’i testi o a o a o tatto o l’epato ita as osta dall’alt a pa te. L’epato ita

cui le sostanza cha arrivano

prende le sostanze da elaborare, riversa quelle che ha elaborato, alcune nella bile e altre nello spazio di Disse ,

ueste sosta ze passa o att a e so il po o dell’e dotelio che è fenestrato e quindi gli scambi metabolici tra il

sa gue e l’epato ita so o ediati dalle fe est atu e dell’e dotelio. Qua do si fo a o ellule he a u ula o

la vitamina A e sono cellule contrattili, sempre nella parete dei sinusoidi, in casi di infiammazione producono

collagene che nasconde le fenestrature o le chiude e quindi quanto più collagene si produce in un sinusoide

ta to e o il pa i e to dell’i testi o può esse e o seg ato all’epato ita e ui di non si elaborano le

ie all’o ga is o. Qua to u fegato ta to peggio fu zio a, pe h u po’ alla

sostanze necessa più fibrotico

volta è impedito lo scambio sangue-epatocita e viceversa. Casi di obesità e diabete può alla lunga provocare

ciò.

Quindi, questa fibrosi precede spesso la cirrosi, aumento di produzione di collagene, ed è una delle premesse

affinché si abbia un epatocarcinoma. Questa è una conversione, rispetto a quella embrionale, che richiede

te pi olto lu ghi e può alla fi e dist ugge e l’o ga o olpito se non è rimosso lo stimolo infiammatorio.

Tipo 3 si trova nella conversione che permette la formazione delle metastasi.

Avviene nella conversione del tumore da benigno (di solito incapsulato) a

maligno.

Chi cerca di capire quali sono le reti di trasduzione del segnale che sono

coinvolte vede che ci sono diversi stimoli che hanno azione su recettori diversi

ma che convergono tutti verso uno stesso risultato finale. È quindi importante

capire quali sono i meccanismi che innescano questi cambiamenti . Le varie vie 6

e da o l’idea di di e si tipi di e etto i he posso o esse e oi olti o plessi a e te o u

di trasduzio

inizio di segnale che poi di solito convergono tra di loro per innescare questo tipo di progressione. ESEMPIO:

Metalloproteasi di una matrice può indurre la conversione attraverso recettori non ancora specificati. È molto

probabile che il gruppo di ricerca, che ha pubblicato, conosca poco il fatto che le metallo proteasi possono dare

origine a frammenti di proteine che sono dei domini che possono diventare fattori di crescita o

differenziamento. Quindi non ci deve stupire che una metallo proteasi possa indurre questo, perché uno dei

domini di una proteina della matrice, staccato dal suo contesto può essere visto da integrine particolari e far

partire questo processo.

SELECTINE Termine molto usato dagli

immunologi che usano il termine

CD (Cluster Differentiation) per

distinguere le cellule di classi

diverse attivate in modi diversi

e …

Le selectine sono molecole di

adesione usate dagli endoteli per

richiamare cellule circolanti, in

particolare globuli bianchi, sarà

sfruttata questa tendenza naturale,

che è fondamentale per la

sopravvivenze, dalle cellule

tumorali per usare lo stesso

processo nel momento sbagliato.

Questa selezione di cellule è fatta

in tappe che provocano un

richiamo con rallentamento del

e dotelio. Si de e i agi are

movimento e una specie di rotolamento sull’ il sangue che scorre con una certa

elo ità, e ui di ’ il plas a o i globuli bianche e rossi.

Il richiamo dei globuli bianchi ai tessuti danneggiati è fatto solo in venule post capillari, dove il sangue scorre

più le ta e te e l’e dotelio spe ifi o pe h ha pa eti sottili, u a zo a o diffi ile da att a e sa e, però

pe fa passa e i glo uli ia hi att a e so l’e dotelio, ’è prima un processo cioè il rallentamento delle

giu zio i dell’e dotelio o il plas a he es e dal sa gue, si fo a ui di l’ede a ei tessuti da neggiati e con

questa fuoriuscita di plasma il sangue diventa più concentrato e la probabilità che una cellula del sangue

i o t i l’e dotelio olto aggio e. Poi l’e dotelio de e ette i del suo pe rallentarlo e questo richiede

varie molecole di adesione. Primo passo di un endotelio, è quello di esprimere sulla superficie, solo se in

tessuti danneggiati, delle molecole di adesione della famiglia delle selectine che riconoscono dei gruppi di

zuccheri, di oligosaccaridi che formano degli Ag specifici di quella cellula li.

l’adesio e dei leu o iti alle ellule

Durante la risposta infiammatoria, endoteliali è controllata dal legame delle

selectine vascolari a carboidrati complementari. Tutti i ligandi noti delle selectine sono glicoproteine

transmembrana che presentano strutture oligosaccaridiche alle selectine. La formazione transiente di legami

tra le selectine e i loro ligandi mediano il passo iniziale della cascata di adesione. Tutti i tipi di selectina possono

tet asa a ide sial l‐Le is sial l‐CD 5 . Questo

riconoscere glicoproteine e/o glicolipidi che contengono il

tetrasaccaride si trova in tutte le cellule circolanti della serie mieloide ed è compost di acido sialico, galattosio,

fu osio e N‐a etil‐galattosa i a. Non è chiaro come le selectine riescano a svolgere interazioni specifiche con I

loro ligandi, dato questo comune carboidrato di riconoscimento. 7

Sialyl Lewis-x e altri tipi di Ag, sono combinazione di zuccheri che ha un

residuo di acido sialico in posizione critica e che è espresso da mucine,

proteine altamente glicosilate, che sono presenti sulla membrana del

leucocita, in questo caso un neutrofilo che è il primo ad essere

catturato, in un secondo tempo vengono i monociti ed eventualmente,

se lo stimolo persiste, dei linfociti.

Questo primo passo di rallentamento del flusso è seguito da un

processo di rotolamento, devono entrare in azione delle proteine sulla

superficie del leucocita, che sono delle integrine che vanno a

riconoscere proteine della super famiglia delle Ig (che non appaiono in

immagine) e causano arresto completo del leucocita. Questa è la prima

parte del richiamo di globuli bianchi in una zona danneggiata ed è

mediato da selectine, che sono espresse sulla superficie di un vaso che

i o os o o degli zu he i sulla supe fi ie dell’alt a ellula.

C’ se p e la e essità di i o da e he u a ole ola di adesio e ha u

contro ligando specifico.

SEMINARIO: STRUTTURA DEI VASI SANGUIGNI I periciti sono delle cellule, non molto note, che

hanno un ruolo importantissimo nei vasi

sanguigni. Il pericita è una cellula che ha come

dei tentacoli e lavora in collaborazione con

l’e dotelio. Ha il compito di contrarsi sulle

piccole venule e sui capillari per modulare la

velocità di scorrimento del sangue.

La struttura dalle arterie e delle vene è

caratterizzata da una parete dove le cellule

muscolari lisce, che sono molto frequenti nelle

arterie muscolari, favoriscono la contrazione per spremitura e permettono al sangue di scorrere in una

direzione.

Anche i vasi sottili hanno cellule specializzate, che fanno delle micro spremiture, che sono i periciti.

I capillari sono le strutture che promuovono gli scambi metabolici nel

tessuto. Ci sono capillari che hanno una sola cellula endoteliale richiusa

su se stessa come una foglia di tabacco e i capillari normali, presenti in

molti tessuti ed è per questo, che è pericoloso che si formino dei trombi

perché ostruirebbero il flusso di sangue .

Il pericita è una cellula con caratteristiche contrattili che si trova immediatamente dietro un endotelio e ha un

e allu gato lu go l’asse del

corpo cellula vaso sanguigno e tanti prolungamenti nel citoplasma che abbracciano

il capillare e queste braccia, sono dette anche cellule stellate, sono ricchissime di actina e miosina delle cellule

muscolari lisce e possono contrarsi e quindi il micro flusso dei capillari è merito della contrazione di queste

cellule. Ma queste cellule, negli ultimi anni, sono state viste come fondamentali anche nella proliferazione e nel

8

all’a gioge esi e olte di ueste ellule ha o a he alt i

differenziamento dei vasi sanguigni, nella risposta

compiti, per esempio le cellule stellate del fegato sono anche depositi di vitamina A .

Nel cervello i periciti:

Co t olla o l’i teg ità della B ai ‐Blood‐Ba ie BBB egola do l’o ie ta e to e l’abbondanza

1. delle

proteine delle giunzioni tight e aderenti delle cellule endoteliali ed anche la velocità di transcitosi di fluido

(trasporto transendoteliale di vescicole piene di fluido);

. Regola o la sta ilità e l’a hitettura dei microvasi cerebrali neoformati;

3. Contribuiscono alla secrezione e regolano i livelli di proteine della matrice extracellulare formando la lamina

basale;

4. Regolano il diametro dei capillari e il flusso sanguigno;

5. Fo is o o le fu zio i di lea a e e fago itosi del e ello . gioge esi

Nell’a dei tumori: sulla parete vaso, il

pericita contribuisce alla sintesi della lamina

basale che deve essere poi danneggiata e rotta

perché un eventuale nuovo vaso possa formarsi

e si diriga verso il tessuto con carenza di

ossigeno (ciò avviene in tutti i tessuti carenti di

ossigeno e nello stimolo tumorale).

È importante notare (in figura) la differenza tra

un pericita normale e patologico.

L’intercellular gap è molto comune nei vasi

sanguigni dei tumori e significa che i vasi sono

molto permeabili, fanno uscire parecchio plasma

verso il tumore. Nel plasma è presente il

fibrinogeno che diventa fibrina e rimane il siero,

fondamentale per lo sviluppo delle cellule.

Il tumore fa ciò che fa una ferita, aumenta gli

allentamenti fra le cellule endoteliali affinchè

possa fuoriuscire il plasma contenente, tra

l’alt o, ossige o p otei e plas ati he e il p odotto di deg adazio e delle piast i e he so o fatto i di es ita e

quindi è una ferita che non si rimargina.

In un vaso normale si ha un’elevata concentrazione della VE caderina, è quindi una parete ben sigillata, mentre

e. I pe i iti so o ellule he i o da o l’e dotelio e odula o la

in un vaso tumorale ci sono molte fenestratu

vita o la morte della cellula endoteliale. 9

BIOLOGIA CELLULARE proteine che si legano specificamente a zuccheri

LECTINE:

Si trovano in processi fondamentali per le cellule come il traffico di vescicole dal reticolo al Golgi, dal Golgi

endosomi, esosomi, membrana plasmatica; questo tipo di riconoscimento proteina-zucchero è presente in

a

molte proteine intracellulari, in proteine extracellulari e in proteine della membrana.

Questi zuccheri, che possono essere presenti in combinazioni molto particolari in glicoproteine e glicolipidi,

costituiscono punti di attacco che possono essere sfruttati da tossine batteriche.

lectine che si legano al ß-galactoside. Sono coinvolte nella stimolazione linfocitaria e nella

Galactine:

formazione di aggregati di cellule tumorali che si formano nei vasi sanguigni. Molte cellule tumorali invece

viaggiare da sole si aggregano con piastrine o con altre cellule tumorali, formano talvolta una specie di

di

rivestimento di fibrina che protegge il trombo dall'urto con l'endotelio, tra i trucchi che le cellule tumorali

per soffrire meno il trauma meccanico del flusso sanguigno c'è la formazione di aggregati misti con

usano

globuli bianchi e piastrine con questo rivestimento esterno di glicoproteine. All'inizio della formazione di

trombi giocano un ruolo importante le lectine che riconoscono il ß-galattosio.

Nel seminario sui raft abbiamo parlato di un particolare dominio con una specifica sequenza aminoacidica

che si lega in modo specifico agli zuccheri presenti sui glicolipidi, questa interazione favorisce il

conformazionale per la formazione di placche amiloidi, per l'invasione, ecc. Le interazioni

cambiamento

avvengono per mezzo di legami deboli (se sono tanti il legame diventa forte), come i legami idrogeno perché

gruppi OH che sono sopra e sotto gli anelli degli zuccheri possono partecipare a formare ponti idrogeno,

i

possono stabilizzarsi in varie posizioni con gruppi laterali di aminoacidi polari non carichi. L'accatastamento

degli anelli degli zuccheri con anelli aromatici di alcuni aa aromatici è un'organizzazione parallela che

permette una stabilizzazione tra atomi di carbonio che sono parzialmente positivi (quelli legati a OH, perché

l'ossigeno è più elettronegativo). Negli ultimi tempi si presta attenzione all'interazione tra atomi C e elettroni

π (elettroni coinvolti nei doppi legami coniugati che se hanno diversi legami vicini possono circolare

liberamente nella zona dell'anello in orbitali complessivi, sono anche abbastanza liberi e spesso sono

π π π

coinvolti in stabilizzazione formando i complessi tra elettroni di una struttura planare e gli e di un'altra

che sta vicino). Nel seminario sui raft abbiamo visto una figura in cui lo zucchero legato a un

ceramide in quel dominio V3 specifico per l'interazione con i raft; l'anello, in

questo caso della fenilalanina viene stabilizzato dall'anello dello zucchero.

Le strutture oligosaccaridiche complesse presenti sulla superficie cellulare, incorporate nella matrice

extracellulare o legate alle glicoproteine secrete, possono:

 svolgere ruoli strutturali

 mediare movimenti intracellulari dei glicoconiugati dal RE fino alla superficie cellulare

 fungere da marcatori che mediano eventi di riconoscimento cellula-cellula o cellula-matrice

I ruoli non strutturali degli zuccheri di solito richiedono la partecipazione di che legano gli zuccheri.

lectine

Nell'elaborazione di glicoproteine e glicolipidi ci saranno processi di riconoscimento basato sugli zuccheri.

Una delle caratteristiche di queste proteine che riconoscono zuccheri è essere proteine con molti domini che

ma l’attività di legame allo zucchero può di

hanno funzioni di tipo strutturale o di modulazione dell'affinità,

solito essere attribuita ad un singolo modulo all’interno del polipeptide: la sequenza (Carbohydrate

CRD

recognition domain).

Ci sono lectine intracellulari, extracellulari (servono per organizzare glicoproteine e proteoglicani

nell'ambiente extracellulare) oppure le molecole di adesione transmembrana come le selettine.

La è una lectina calcio dipendente coinvolta nel controllo di qualità delle proteine nel reticolo

calnexina

endoplasmatico, fanno parte dell’unfolded protein response (risposta alle proteine mal ripiegate), è un

controllo importantissimo, finché rimane sotto controllo cerca di aiutare il corretto ripiegamento sia delle

proteine di membrana che di quelle solubili nel RE, basandosi anche sul passo iniziale della glicosilazione,

1

gli zuccheri collaborano al ripiegamento.

All'interno del RE si effettua il controllo sugli eventuali ponti disolfuro, se nelle proteine con struttura

quaternaria le subunità sono legate correttamente, se è tutto a posto passano nel Golgi e procede

l'elaborazione, se non si riesce a ripiegarle correttamente il RE avrebbe l'obbligo di usare dei trasportatori

sulla membrana del RE che trasportano le proteine nel citoplasma dove vengono degradate dal proteasoma.

Negli ultimi anni si è visto un numero crescente di patologie in cui questa risposta non funziona come si

deve, anche se la proteina non è ripiegata nel modo giusto, finisce sulla membrana, sui lisosomi,

nell'ambiente extracellulare, ecc. dando problemi.

Anche altre lectine lavorano nel RE.

Uno dei sistemi per indirizzare le proteine ai lisosomi è il che viene aggiunto nel trans

mannosio-6fosfato

Golgi network, nello smistamento ci sono delle vescicole che hanno delle lectine che riconoscono

specificatamente questo zucchero e selezionano in vescicole le proteine che vanno a finire nei lisosomi.

Questo passaggio dal trans Golgi network ai lisosomi non è diretto, c'è una stazione intermedia chiamata

L'indirizzamento ai lisosomi è basato sulla lectina che riconosce il mannosio 6fosfato.

endosoma tardivo.

Diverse lectine sono coinvolte nella marcatura di glicoproteine che devono essere degradate, sono quelle

specifiche per il ß galattosio. Ci sono proteine che sono coinvolte nel riconoscimento dell'acido sialico.

Il carboidrate binding domain può essere di tipo diverso, alcune lectine hanno la capacità di legare vari

zuccheri sulla stessa molecola e su molecole diverse, spesso hanno una forma che sembra un bouquet di fiori.

Sono strutture più o meno plastiche, hanno vari domini simili a domini delle proteine coinvolte nella cascata

del complemento. Alcune proteine, non tutte le selettine, hanno la zona che riconosce gli zuccheri in

periferia, alcune sono a metà strada, alcune ce l'hanno al N terminale fuori, altri al C terminale. Sono

abbastanza diverse anche come strutture di inserimento nella membrana.

I domini svolgono compiti ben precisi, molti ancora ignoti, probabilmente non è casuale che famiglie diverse

abbiano sequenze di domini diverse.

Le proteine che passano dal RE possono essere solubili o proteine di membrana, verranno selezionate strada

facendo da lectine.

sono calcio dipendenti, hanno un dominio che riconosce il calcio. La piega di riconoscimento

Lectine C: degli zuccheri ha una particolare struttura a foglietti ß.

Fungono da recettori per l’endocitosi: ci sono recettori

che possono riconoscere sostanze da internalizzare

mediante un riconoscimento di zuccheri. I recettori sulla

superficie quando non servono più vengono

internalizzati e degradati, parecchi recettori vengono

endocitati e riconosciuti da parte di zuccheri.

Il proteoglicano è un complesso proteico legato a

diverse catene di GAG, nell'organizzazione della matrice

questi riconoscimenti specifici vengono fatti in base a

complementarietà di sequenze di aa ma anche aa e

zuccheri. Non ci dobbiamo stupire che il proteoglicano

abbia nella sequenza proteica la capacità di riconoscere

zuccheri su altre proteine.

Le lectine possono formare grandi aggregati che contribuiscono a legare altre molecole, si può avere un

legame ad una mucina che ha diversi tipi di zuccheri che può essere collegata a lectine diverse, aumenta

l'avidità di una cellula per un'altra. Le cellule tumorali hanno un eccesso di mucine sulla superficie per

sfruttare il fatto che nell'endotelio di vasi sanguigni e linfatici ci siano lectine che riconoscono le mucine. Le

vediamo coinvolte in molti processi, non solo dell'infiammazione che richiede il richiamo di globuli bianchi,

ma anche di attivazioni specifiche di cellule del sistema immunitario.

La che ha molti residui lectinici nella stessa proteina, questo aumenta la capacità di collegamento.

collectina

Le lectine solubili vanno in soluzione, le transmembrana hanno altri tipi di strutture. 2

SELETTINE

La superfamiglia delle caderine è fondamentale per l’adesione cellula-cellula negli animali, ma almeno altre

tre superfamiglie di proteine di adesione cellula-cellula sono altrettanto importanti: integrine, selettine e

membri adesivi della superfamiglia delle immunoglobuline. Le selettine, come le caderine e le integrine,

richiedono calcio per la loro funzione adesiva, i membri della superfamiglia Ig no.

Le sono proteine di superficie che legano carboidrati (lettine) che mediano una varietà di interazioni

selettine

transitorie di adesione nel torrente circolatorio. Il loro ruolo principale è nelle risposte infiammatorie e nel

controllo del traffico dei globuli rossi.

Ciascuna selettina è una proteina transmembrana con un dominio lettina altamente conservato che si lega a

un oligosaccaride (su glicoproteine o glicolipidi) specifico su un’altra cellula (legame eterofilico).

Nel campo dell'adesione temporanea, come quella mediata dalle selettine, queste molecole vanno viste

sempre con il loro rispettivo ligando (coordinate per indicare la molecola che viene riconosciuta in

receptor)

modo specifico dalla molecola di adesione.

Sono caratterizzate da domini particolari, un dominio più esterno rispetto alla cellula che riconosce degli

zuccheri che possono essere presenti su glicoproteine o su glicolipidi. I polisaccaridi e gli oligosaccaridi sulla

superficie cellulare sono importanti per il riconoscimento tra cellule ed eventuali legami tra cellule o con

prodotti (di solito peptidi), come tossine che servono a portare alla morte la cellula. Queste interazioni

richiedono il riconoscimento di sequenze di zuccheri molto particolari da parte di strutture specifiche; non

solo i globuli bianchi possono essere richiamati in certe zone in base a questi zuccheri, ma anche agenti

esterni possono sfruttare gli stessi meccanismi. Molte invasioni batteriche e tumorali sfruttano processi

fisiologici di riconoscimento tra cellule e di trattenere eventualmente cellule in certe zone. 3

Questo articolo spiega

perché alcuni batteri in

ambito di tessuti che

hanno vari tipi cellulari

preferiscono un certo tipo

di cellula e non altri,

perché hanno delle lectine

sui pili sulla superficie dei

batteri che riconoscono

zuccheri in certe zone.

Le selettine sono lectine di tipo C (calcio dipendenti) espresse sulla superficie di leucociti, piastrine e cellule

endoteliali attivate.

Promuovono l’aggancio e il rotolamento di leucociti e piastrine sull’endotelio vascolare e sono importanti

per lo homing dei linfociti verso organi linfoidi secondari e per il reclutamento dei leucociti ai siti di

infiammazione.

Da notare che una stessa cellula endoteliale può esprimere selectine diverse. Sono processi di endocitosi

sotto controllo perché l'endotelio normalmente non richiama i globuli bianchi, deve lasciarli correre senza

frenarli. L'inserimento di molecole di adesione per richiamare i globuli bianchi deve avvenire solo in

situazioni in cui il tessuto sottostante è danneggiato e dev'essere riparato. Se però lo stimolo dell'inserimento

di molecole di adesione è continuo, gli endoteli di quei vasi rallentano la circolazione del sangue, richiamano

in modo esagerato leucociti, contribuiscono a un'infiammazione di tipo cronico.

Presentano grande diversità per l'interazione tra cellule.

Le molecole di adesione della super famiglia delle immunoglobuline sono importanti per agganciare le

integrine sui leucociti.

CD34 è un marcatore tipico di endoteli, cellule staminali, capillari, è una glicoproteina coinvolta in vari

processi.

PSGL1 noto anche come CD162, è una glicoproteina chiamata ligando 1 per la P selettina presente su

piastrina o su endotelio. È un marcatore di molte cellule infiammatorie, in particolare delle cellule che

presentano l'antigene (cellule dendritiche), ed è un marcatore anche per l'homing dei linfociti, può legarsi nei

leucociti al marcatore delle venule nei linfonodi. 4

Tipi di selectine:

 espressa in tutti i leucociti, ad eccezione dei linfociti T. Il dominio extracellulare della

L-selectina:

L-selettina si lega sia a PSGL1 su cellule mieloidi o linfociti T attivati che a glicoproteine che si

trovano sulle cellule endoteliali specializzate delle venule endoteliali alte del tessuto linfoide

periferico. La L selettina è una delle molecole presenti su molti leucociti, non sull'endotelio, è

presente nelle strutture che aumentano la superficie esterna dei leucociti, dei microvilli che

permettono al leucocito di tastare il terreno e stabilire o meno contatti con altri tipi di cellule. Il fatto

di essere multi dominio le rende bersaglio di molte proteasi, in particolare metallo proteasi (hanno un

metallo, di solito zinco, nella tasca catalitica importante per selezionare il legame peptidico che verrà

scisso), è possibile regolare il numero di recettori sulla superficie attivando delle metallo proteasi che

le staccano dalla membrana. Ha la capacità di avere legami modulati da proteine che legano il calcio

e anche da proteine che regolano il citoscheletro di actina. Anche nei leucociti la selettina è legata in

modo indiretto al citoscheletro.

 espressa da cellule endoteliali attivate e piastrine al momento della formazione del tappo

P-selectina:

piastrinico. Sono coinvolte in legami eterofilici, riconoscono strutture chiamate antigeni sialyl-Lewis

X che hanno uno zucchero particolare in una certa posizione, hanno un fucosio sotto l'acido sialico.

Può essere internalizzata mediante fossette rivestite da clatrina e indirizzate ai granuli di secrezione

per riciclaggio, oppure ai lisosomi per degradazione. Il principale ligando è PSGL1, le interazioni tra

selettina e PSGL1 sono fondamentali per indurre i leucociti ad ancorarsi e a rotolare sulle cellule

endoteliali, oppure su piastrine immobilizzate che esprimono la P selettina.

 espressa dalle cellule endoteliali attivate che hanno ricevuto dal tessuto danneggiato

E-selectina:

citochine, TNF, interleuchine, ecc e anche dalle piastrine dei segnali che scatenano l'esocitosi della

selettina. La selettina è normalmente immagazzinata in vescicole sotto la membrana (note come

corpi di Weibel-Palade).

La E selettina riconosce una particolare sequenza di zuccheri presente anche in una glicoproteina

presente in molti leucociti, PSGL1, antigene tipico di leucociti che sono riconosciuti da quella

lectina, ha diversi altri zuccheri e sequenze di aa particolari con gruppi sulfidrilici. Ha una coda che

interagisce con il citoscheletro quindi può cambiare la conformazione della cellula o della piastrina

quando la molecola di adesione è legata a un ligando. Le code possono indurre polimerizzazione

diversa dell'actina. È una molecola di adesione che, così come può essere inserita sulla membrana,

può essere rimossa di solito alla fine dell'infiammazione.

hanno una forma tipo sigaro, identificati in molti endoteli. All'inizio si riteneva che

Corpi di Weibel Palade:

fossero marcatori delle cellule endoteliali, ma non tutti quelli che studiavano l'endotelio di capillari vedevano

questi corpi. Non sono presenti nell'endotelio dei vasi dei tumori, non tutti gli endoteli sono in grado di

promuovere l'espressione di selettine. Sono delle zone di accumulo di molecole coinvolte nella formazione

del tappo piastrinico, come il fattore di von Willenbrand, e anche diverse selettine. Questi corpi si fondono

con la membrana plasmatica, riversano nell'ambiente extracellulare molecole solubili e nella membrana

molecole di membrana.

Le differenze di dimensioni fra le selettine riflettono il numero di domini (short consensus repeats) per

SCR

legare gli zuccheri, la L selettina ha 2 domini, la E selettina 6 domini, la P selettina fino a 9. La P selettina ha

forme derivate dallo stesso messaggero per splicing alternativo, differenze nel dominio all'interno della

cellula, hanno la capacità di interagire con proteine diverse, quindi una grande variabilità sia in termini di

residui che riconoscono gli zuccheri sia per la capacità di interagire con proteine all'interno della cellula.

Hanno la capacità di essere rigide ed estese, spesso l'inattività di queste molecole è dovuta al fatto che sono

ripiegate su loro stesse e non sono rigide, ad esempio quando le integrine sono inattive hanno le teste

ripiegate a toccare quasi la membrana, quando sono attive le teste sono rivolte verso l'ambiente esterno.

La P selettina può essere usata come marcatore per i megacariociti, cellule molto grandi che nel midollo

osseo sono la fabbrica delle piastrine, nel loro citoplasma si formano strutture specializzate con granuli vari

che per frammentazione del citoplasma danno origine alle piastrine circolanti. Siamo abituati ad aspettarci i

megacariociti nel midollo osseo, ma talvolta nelle fettine di milza, nella polpa rossa, e talvolta nei fegati

normali capita di vedere megacariociti, perché nell'embrione sono organi dove si svolge l'emopoiesi e rimane

un residuo di attività emopoietica. Una situazione in cui milza e fegato riprendono la capacità di essere

emopoietici, in particolare per globuli rossi e leucociti delle cellule mieloidi, non linfociti, sono le situazioni

in cui il midollo osseo ha subito dei danni ed è diventato fibrotico (mielofibrosi per esempio), sono malattie

5

in cui il midollo non riesce più a fabbricare il sangue quindi l'organismo riattiva l'emopoiesi extramidollare.

Sono stati trovati megacariociti in gran numero nel fegato e nella milza di animali con tumori. Vedere queste

cellule fuori sede è indice di sofferenza dell'organismo, in particolare in carenza di ossigeno. È stato

dimostrato che la produzione di VEGF da parte del tumore, induce l'emopoiesi nel fegato e nella milza.

l'attivazione richiede l’azione

Anche nelle piastrine dei granuli, che sono depositi di molecole che saranno

utili nella formazione del tappo piastrinico, solo in quel caso vengono messi in superficie delle molecole di

adesione e varie altre molecole, quindi ci sono anche qui dei granuli (che non si chiamano Weibel Palade)

che hanno il compito di inserire la molecola sulla membrana tramite esocitosi regolata.

Possono venire internalizzate per essere distrutte, questo è il loro ligando particolare che è simile a quello

che viene riconosciuto dalla E selettina.

Antigeni dell'emopoiesi embrionale possono essere usati per identificare cellule embrionali.

Bisogna sempre sapere che per ogni selettina c'è un ligando particolare che normalmente gli immunologi

hanno classificato come CD vari (cluster differentiation). è una glicoproteina altamente glicosilata, è

CD 34

una delle molecole di adesione tipica dei macrofagi della superfamiglia delle immunoglobuline (CAM, cell

adhesion molecole, è la sigla delle molecole di adesione della superfamiglia delle Ig), questa è una tipica

interazione eterofilica.

Questo è un tipico antigene piuttosto esteso, con vari residui glicoproteici. CD24 è una glicoproteina legata

alla membrana da una coda di GPI.

L'inserimento di queste selettine sulla membrana

è un tipico esempio di secrezione non costitutiva

ma regolata, ci vuole un segnale, in questo caso

non un ormone o un neurotrasmettitore, perché

qui sta pensando a ghiandole che devono far

fuoriuscire delle sostanze per esempio per la

digestione quando arriva un ormone particolare.

Un segnale indica che la vescicola si deve

fondere con la membrana e rilasciare le

molecole che vanno in soluzione oppure inserire sulla

membrana molecole transmembrana come le selettine.

I leucociti hanno questi frequenti microvilli che si alzano e si

abbassano a seconda dell'ambiente in cui si trova la cellula. 6

Integrine con 2 subunità una con una coda più grande nel citoplasma che è la subunità ß, sono indicati i loro

controligandi. Il riconoscimento tra 2 cellule richiede una collaborazione tra un gran numero di molecole di

adesione di famiglie diverse, per esempio un'integrina VLA (very late antigene).

Le P e le E selettine riconoscono il PSGL1 che è molto concentrato nei microvilli di molti leucociti, è una

glicoproteina altamente glicosilata il cui controligando è una selettina.

Già 20 anni fa era nota l'importanza delle interazioni deboli proteina-proteina e proteina-zucchero in cui si

spiega sempre che è un fenomeno complesso, fondamentale nello sviluppo embrionale, nel sorting e

selezione dei vari tessuti nella formazione di organismi multicellulari, smistamento di cellule che si separano

le une dalle altre e si aggregano tra loro, è tutto basato su molecole di adesione.

Le interazioni deboli che mediano le interazioni transitorie hanno bassa affinità e velocità molto rapide di

associazione/dissociazione. PSGL ha molti zuccheri e aa con gruppo solfato (le solfatasi sono presenti nel

Golgi).

Esempi di ligandi, non sono da sapere le sigle, ma dobbiamo capire che tipo di molecole possono essere

riconosciute dalle selettine: proteine altamente glicosilate che hanno tanti zuccheri che facilitano il

riconoscimento per le lectine multivalenti. CD34 o PECAM sono marcatori per l'angiogenesi tumorale, per

contare quanti vasi sanguigni sono presenti, CD34 è usato anche come marcatore per la separazione di

cellule staminali emopoietiche e altre cellule.

Il legame di una cellula con un'altra induce un cambiamento di forma nella cellula, e la forma è data dal

citoscheletro che cambia. È possibile che la riorganizzazione del citoscheletro aumenti o diminuisca l'affinità

di questo verso il ligando.

Troveremo le selettine nelle prime fasi del reclutamento dei leucociti ai siti di invasione. Vari parametri

coinvolti nel richiamo dei leucociti che vanno dalle forze di taglio che la pressione che il sangue esercita

sulla superficie delle cellule endoteliali (una pressione esagerata può attivare l'endotelio e aumentare il

rischio di aterosclerosi e altre malattie vascolari), e l'espressione di citochine varie dei segnali che provocano

il richiamo, studi su mediatori e espressione di selettine, integrine ecc.

Stimoli che arrivano dal tessuto danneggiato per indurre l'inserimento di molecole di adesione sulla

superficie, in termini di cellule danneggiate che producono interleuchine, ci sono dei recettori soprattutto

sulla parte basale dell'endotelio per le citochine infiammatorie che compaiono sulla superficie recettori ad

alta affinità. 7

In un vaso è stata impedita la circolazione per un certo periodo, dopo il sangue ha ripreso a scorrere, quindi

riperfusione dopo ischemia con infiammazione che viene scatenata localmente che è basata anche sulla

produzione di radicali liberi, anche questa dovuta a granulociti che entrano. Questi processi vengono visti sia

nell'ambito dei fattori che promuovono la adesione lenta, il rotolamento; l'adesione forte è modulata da

integrine. Bisogna allentare il legame delle VE

caderine in questa zona, la forma

della cellula cambia, diventa molto plastica, si può immaginare il citoscheletro che cambia completamente,

deve infilarsi tra i varchi, deve degradare la lamina basale sotto, deve andare nel connettivo. Se è un

granulocito rilascia i suoi granuli, uccide i batteri e muore anche lui, se è un monocito si trasforma in

macrofago e fa altro. Allo stesso tempo l'endotelio deve promuovere la formazione del tappo piastrinico, si

8

ha adesione tra le piastrine che aiutano anche a rallentare i globuli bianchi e li avvicinano alla zona

danneggiata.

Le molecole di adesione hanno un ruolo fondamentale in diversi scenari: sviluppo embrionale,

disseminazione metastatica, varie patologie. (immunologia, non per l'esame, approfondimento)

Immagini di tessuto infiammato, globuli rossi e bianchi molto concentrati, le venule si sono allentate, gran

parte del plasma è andato verso il tessuto edematoso.

Modo in cui selettine e integrine mediano le adesioni cellula-cellula necessarie per la migrazione di

Figura:

un globulo bianco fuori dal torrente circolatorio in un tessuto. Per prima cosa le selettine sulle cellule

endoteliali si legano a oligosaccaridi sui globuli bianchi, che si attaccano così debolmente alla parete del

vaso. Quindi il globulo bianco attiva un’integrina nella sua membrana plasmatica, che diventa in grado di

legarsi ad una proteina chiamata ICAM1, che appartiene alla superfamiglia delle Ig, nella membrana della

cellula endoteliale. Ciò crea un’adesione più forte che permette al globulo bianco di strisciare fuori dal vaso. 9

Biologia cellulare

SUPERFAMIGLIA DELLE IMMUNOGLOBULINE

…. Caratterizzazione immunoistochimica di queste molecole nei processi normali e patologici come possono

l’invasione tumorale,

essere l’infiammazione la formazione di placche aterosclerotiche, la crescita tumorale,

metastatizzazione e anche nello sviluppo embrionale per capire le interazioni che si formano non si

la

formano mentre le cellule migrano in varie parti, si fermano in alcune proseguono in altre tutti sono

processi di riconoscimento specifico, spesso debole, che permette alle cellule di proseguire la loro strada;

sono processi sfruttati in ingegneria tissutale per cercare di riparare i tessuti danneggiati sfruttando cellule

staminali, bisogna richiamare quali fermare nel tessuto giusto, differenziarsi nel modo giusto ecc

Quando parleremo delle vescicole rilasciate dalle cellule ( ectosomi, esosomi, sono vescicole diverse che

hanno ruoli diversi) da recenti scoperte sembra che molto del ruolo di riparo dei tessuti fatti dalle cellule

staminali, sia mediato da vescicole che le cellule scambiano una con le altre e queste molecole portano con

non

sé delle molecole di adesione. La famiglia delle Immunoglobuline ha una adesione che è dipendente dal

Ca2+ o ioni bivalenti in generale.

Il ruolo che è svolto dal calcio o magnesio è di tipo strutturale che permette ad una proteina di assumere una

conformazione estesa verso un ambiente extracellulare e che ritroveremo nelle integrine ed è presente anche

nelle selettine perché anche l’orientamento dei domini che poi riconoscono gli zuccheri anche quello

dipendeva dal collegamento con il calcio ed erano ruoli strutturali qui invece vedremo che il ruolo strutturale

di questi domini

svolto da ponti S-S covalenti che rafforzano i collegamenti tra domini vari e all’interno

servono a creare una struttura che è molto particolare, molto conservata e sembra che è una delle ragioni per

extracellulari che è dominio detto Ig

cui nella natura sia così conservata è un dominio resistente alle proteasi

Like di tipo immunoglobulinico. Queste proteine delle molecole di adesione sono solo uno dei tanti

componenti della superfamiglia delle immunoglobuline. Fra le molecole di adesione è difficile classificare in

sola classe perché ci sono delle selettine che appartengono alla famiglia delle immunoglobuline e

una

vengono chiamate I-selettine, quindi hanno domini Ig like e domini lectinici, quindi è difficile catalogarli. 1

Le molecole della superfamiglia delle immunoglobuline possono essere coinvolte sia in tipi di legami

OMOFILICI, un po’ come succede per le caderine, ossia queste molecole hanno dei domini che riconoscono

dei domini simili di solito all’estremità ma non necessariamente e quindi il legame è tra famiglie di proteine

dello stesso tipo. Sono di solito legami più saldi rispetto ai legami di tipo ETEROFILICO ( es in cui una

proteina della superfamiglia delle immunoglobuline è espressa da una cellula endoteliale, in questo caso ha

come controligando una proteina della famiglia delle integrine ( dimeri alfa e beta struttura quaternaria

entrambi i domini contribuiscono al riconoscimento del ligando nell’ambiente extracellulare)). Le integrine

sono coinvolte nel legame eterofilico ad esempio (in figura) con delle proteine della matrice extracellulare

che possono essere presenti nei vari tipi di matrice e può essere un legame più o meno forte e ci sono anche

delle situazioni spesso presenti nei tappi fatti dalle piastrine per riparare un danno ad un endotelio delle

varie e questo è un legame non omofilico perché c’è una

piccole proteine che servono da ponte tra integrine

proteina di mezzo che è diversa e ricordiamo le selettine che riconoscono proteine altamente glicosilate.

caratteristica

Queste proteine hanno come la presenza di diversi domini chiamati tipo immunoglobulinico

hanno delle strutture basate sui foglietti beta orientati alcuni in un senso, altri in altri collegate da zone

intermedie con ponti S-S domini sandwich like ( hanno strutture che si possono aprire o chiudere). Molte

delle proteine della superfamiglia delle immunoglobuline oltre ad avere delle ripetizioni di questo dominio (

un certo numero che dipende dal tipo di molecola di dominio di tipo immunoglobulinico hanno anche spesso

delle ripetizioni di domini che sono simili a domini che si trovano nella fibronectina ( es. proteine della

matrice extracellulare). Quindi dominio di tipo 3 della Fibronectina

Sono descritte come proteina di tipo I transmembrana perché hanno N-term extracellulare e C-term

intracellulare. E’ una nel corso dell’evoluzione con questo dominio ( di tipo

famiglia che si è affermata

immunoglobulinico) in particolare si trovano nelle molecole degli anticorpi. Ci sono diverse proteine di

questa superfamiglia presenti sulla membrana plasmatica quindi sono proteine di superficie, e molte sono

CAMs.

I domini delle immunoglobuline consistono di 70-110 aa e sono classificati in due subtipi:

 Domini variabili

 Domini costanti

I domini V e C condividono una tipica struttura detta “ a panino” che consiste in due strati di filamenti β anti-

paralleli stabilizzati da un ponte disolfuro, che produce una struttura compatta relativamente insensibile alla

scissione proteolitica. all’antigene β.

Il tipo V contiene le proprietà di legame e consiste di 9 foglietti

β.

Il tipo C media le funzioni di effettore e contiene 7 foglietti

β ci sono anche diversi residui idrofobici.

Nei foglietti 2

I domini IgSF sono classificati come V, C1, C2 o I («intermedio»), a seconda della lunghezza e dei «pattern»

delle sequenze.

– C1: corrisponde al dominio C delle immunoglobuline

– C2: variante che si trova nella maggior parte delle altre proteine IgSF.

– I: strutturalmente simile al dominio V, ma contiene anche aspetti caratteristici dei domini C.

I domini IgSF contengono relativamente pochi residui altamente conservati. Aspetti caratteristici dei domini

β e

IgSF includono residui idrofobici alternanti nei foglietti i residui di cisteina conservati che formano

β.

legami disolfuro fra i due foglietti

Fra le diverse proteine della superfam. delle immunoglobuline, quelle che ci interessano, sono le molecole di

adesione di tipo I: parte extracellulare con N-term e una piccola coda C-term nel citoplasma che come

vedremo in alcuni casi è molto studiata perché interferisce, in quanto ha dei domini che possono essere

fosforilati ed essere riconosciuti da quelle proteine della famiglia Sars e scatenare una traduzione del segnale.

Nell’ambiente extracellulare a seconda del tipo di famiglia, oltre a questi domini che sono comuni a tutte le

molecole di adesione di questa famiglia ci sono anche i domini di tipo III della fibronectina

β‐

Il dominio FNIII è stato prima descritto nella proteina dellamatrice extracellulare fibronectina e consiste in

β‐foglietti

strati chesi sovrappongono contenenti 7 antiparalleli.

Nelle CAMs con diversi domini tipo Ig, uno o più domini ditipo V si trovano di solito più vicini al N‐termina

le, seguiti da uno o più domini di tipo C2. La fibronectina è presente nel plasma sanguigno ed è importante

per partecipare alla formazione di una specie di supporto che promuove la formazione di aggregati piastrinici

in collegamento con l’endotelio e ha la capacità di rivestire le cellule nell’ambiente, sulla membrana

plasmatica quasi in corrispondenza con la distribuzione interna di actina. Fibronectina di rivestimento delle

cellule è una fibronectina che può formare grossi polimeri e infatti ha i domini che sono specializzati per un

dell’embrione o delle ferite o

assemblaggio che forma le grandi reti della matrice extracellulare soprattutto

dei tumori quindi è una piccola proteina che fa le piste seguite per la migrazione di molte cellule.

Struttura modulare della fibronectina e suoi domini di legame

Tipica proteina multi modulare con moduli che possono essere coinvolti nel collegamento con altre proteine

e questi sono moduli utilizzati per collegarsi al collagene e possono collegarsi sia a molecole di fibronectina

un’altra molecola importante della matrice. Questi domini si possono legare non solo ad altre

che fibrina

molecole di fibronectina ma anche eparina e sindecano ( eparina è GAG altamente solforato mentre il

sindecano è un proteoglicano). I moduli di tipo 3 vengono numerati perché in varie proteine derivate dalla

3

fibronectina che hanno effetto antiangiogenico ( per es. prendono solo alcuni di questi domini e la stessa

struttura in aa di questi domini la si trova in altre proteine in particolare proteine di adesione del sistema

nervoso N-CAM. Il dominio intracellulare può contenere diversi domini che possono essere fosforilati e

motivi che riconoscono quelle proteine adattatrici sotto la membrana “scaffold” che a loro volta possono

c’è un collegamento funzionale

interagire con il citoscheletro; quindi tra le molecole transmembrana che

riconosce altre molecole e l’organizzazione del suo citoscheletro e eventuale formazione di spostamento di

fattore di trascrizione, quindi entriamo nel campo del segnalamento “outside-in” o “outside-out” perché è

possibile cambiare l’affinità della molecola di adesione per il suo substrato, cambiando la molecola attaccata

alla coda del citoplasma quindi c’è questa modulazione di affinità estremamente importante ed è spesso

di transizione epitelio mesenchimali o nell’infiammazione.

alterata nei vari processi

Quando presenti, i domini FNIII si trovano vicino alla membrana.I domini transmembrana sono corti.

I domini intracellulari variano in lunghezza, e molticontengono motivi di segnalamento e/o regioni che

interagiscono con il citoscheletro o con elementi adattatori.

Quindi, le interazioni delle CAMs IgSF sulla superficie cellularepossono portare a segnalamento «outside‐in

» o «inside‐out».

L’immagine fa presente che è possibile che l’adesione richieda la formazione di dimeri o aggregati vari I-

CAM che è espresso tra leucociti e l’endotelio, già lo fa vedere come dimero e altra zone che poi sarà

coinvolta nel legame con integrina su altre cellule.

IMPORTANTE: la struttura primaria di Ig può essere molto diversa, quello che è simile è la struttura

ossia l’organizzazione a foglietto β

terziaria organizzato a forma di barilotto, collegati in modo plastico dai

dominio con struttura simile anche fatto da aa diversi

ponti S-S quindi spesso si può avere un però in

comune c’è il fatto che si possono formare β

foglietti che abbiano aa idrofobici, poi sono diversi tra di loro.

l’affinità è estremamente elevata.

Nei processi di riconoscimento anticorpo-antigene Nel caso delle molecole

di adesione della famiglia delle Ig sulla membrana invece, il singolo legame è debole però collaborano

diversi tipi di molecole e quindi l’effetto complessivamente può essere descritto come effetto Veltro. Questa

è una delle differenze tra le varie molecole di questa superfamiglia che possono avere affinità verso la

molecola che riconoscono molto diversificata.

Interazioni delle molecole di adesione cellulare

delle IgSF

Questi aggregati richiedono interazioni fuori dal sito primario di legame con il ligando sia in

Cis (fra molecola della stessa cellula ) che in trans ( fra molecole su un’altra superficie cellulare. 4

Le proteine IgSF formano interazioni trans con molecole come le integrine.

Ad es., l’interazione tra la «Intracellular Adhesion Molecule» (ICAM‐1) e integrine specifiche

probabilmente coinvolge una cerniera («zip») di adesione eterofilica.

Altre proteine IgSF sono impegnate in eventi di legame omofilico e un complesso di adesione a

sembra stabilizzare l’adesione mediata dalle N‐CAM.

doppio zip

Spesso queste Ig riconoscono il CO-RECETTORE sono proteine della famiglia delle integrine. Questi sono

invece spesso nel SN l’organizzazione è estremamente complessa: nelle cellule degli

legami di tipo trans;

astrociti, nelle cellule di protezione contro l’infiammazione per es. e in particolare il legame che l’assone

stabilisce con le cellule con cui deve compattare sono mediate da queste N-CAM.

Esempio nel campo dell’immunologia:l infocita T che deve ricevere un antigene quindi ha il recettore per

l’antigene che ha delle proteine della famiglia delle Ig ed il riconoscimento verrà fatto tra integrine su cellule

T e molecole della superfamiglia delle Ig nella cellula a cui deve presentare il suo antigene. Il fatto di avere

dei dimeri crea area di riconoscimento ampia che facilita il riconoscimento specifico.

Molecole di adesione cellulare appartenenti alla superfamiglia delle immunoglobuline β2

I-CAM di tipo 1, 2, 3 sono diverse per il numero di residui. Tutte queste si legano a integrine sui linfociti

e sono coinvolte nel richiamo dei leucociti ai vasi sanguigni nelle zone danneggiate e nei tessuti linfoidi.

5

Dove si nota il dominio di tipo III della fibronectina sono quelle particolarmente espresse sul SN e c’è una

che è una proteina che ha un codino che la àncora alla membrana ed è una proteina che può essere rilasciata

nell’adesione tra piastrine ed endotelio,

da qualche fosfolipasi che taglia questo lipide. Proteina coinvolta

quasi tutte sono note con un numero di CD.

Le sottofamiglie hanno dei nomi che indicano le cellule o i processi in cui sono particolarmente coinvolti.

ICAM‐1(CD54)

Proteine di 80‐114 kDA a singola catena con 5 domini tipo Ig, una singola regione transmembrana e un corto

dominio citoplasmatico

‐1 ‐1

Si può legare a LFA (integrina), Mac (integrina), fibrinogeno, acido ialuronico e CD43

l’espressione

I leucociti a riposo esprimono poco ICAM‐1,ma viene indotta dopo attivazione.

e l’attivazione con

Le cellule endoteliali no attivate hanno bassi livelli di ICAM-1, citochine infiammatorie

quali IL‐1, IFN‐ e TNF‐ dà origine ad una aumentata espressione di ICAM1 sulle cellule endoteliali oltre

alla sua induzione su cellule epiteliali e mesenchimali.

La ICAM‐1 umana è utilizzata come recettore per il principale gruppo di rinovirus; in vitro è stato

per il legame di eritrociti infetti da Plasmodium falciparum all’endotelio delle

identificato come recettore

venule postcapillari.

sono rivolti nella giunzione tra una cellula e l’altra; non sull’ambiente del’endotelio rivolto verso

Le I-CAM

il sangue. Sono modulate nei vari processi di angiogenesi o quando un globulo bianco deve passare

attraverso l’endotelio per andare nell’ambiente sottostante. Vanno su domini di membrana diversi.

L’endotelio ha 3 domini particolari: quello rivolto verso il sangue, verso le giunzioni endoteliali e quello

rivolto verso la lamina basale.

CD31 coinvolto nella formazione del tappo piastrinico 6

Rhinovirus binds to ICAM-1

oncell surface (A). ICAM-1 binding triggers a conformational change of virus, and leads to a release of

RNA, which is transported into the inside of cells (B). We aim to use the first domain of ICAM-1 to

neutralize virus, therefore to inhibit rhinovirus infection.

Il recettore del virus del raffreddore: l’adesione del virus alla molecola che permette l’inserimento del suo

RNA.

Nel caso di anemie falciformi i globuli rossi infetti possono aderire all’endotelio sfruttando queste molecole

di adesione. Quindi queste sono situazioni patologiche. Le cellule dell’endotelio o dei leucociti inattivi hanno

poche molecole, se invece sono stimolati da citochine infiammatorie i livelli diventano elevati. Sono

molecole che stanno in stand-by e si possono attivare in situazioni patologiche.

CD102 (I-CAM2)

Proteina di 55‐65 kDa, con 2 domini tipo Ig.I linfociti e i monociti quiescenti, ma non i neutrofili,

nell’endotelio

esprimono bassi livelli di ICAM‐2 in superficie,l’espressione è elevata e nelle cellule follicolar

i dendritiche dei centri germinali nei linfonodi. Il quadro di ICAM‐2 NON è sovra‐regolato nei leucociti o

endotelio attivati da mediatori infiammatori. Ligandi: LFA‐1 e Mac‐1 (integrine)

Ruolo preciso non ancora identificato, ma si ritiene che siaimportante per la ricircolazione dei leucociti attrav

i leucociti non escono solo quando c’è infezione, normalmente

ersol’endotelio di tessuti NON infiammati

arrivano dal sangue, escono pattugliano e ritornano al sangue. Sembra che le proteine che espongono per

farsi autorizzare il passaggio dall’endotelio sono diverse da quelle che espongono se c’è infezione.

CD50 ( ICAM‐3 ) E’

Molecola di 120‐160 kDa con 5 domini tipo‐Ig. espressa costitutivamente a livelli elevati sui leucociti, ma

non si trova nella maggior parte delle cellule endoteliali (alcontrario di ICAM‐1 e ICAM‐2).

Ligandi: LFA‐1, ma non a Mac‐1.

l’interazione

Si presume che di ICAM‐3 con LFA‐1 sia coinvoltanel legame iniziale delle cellule T alle cellu

l’antigene.

le che presentano 7

L’alterazione dell’integrina (LFA‐1)

conformazionale da ripiegata su se stessa ad estesa scatena

un’attivazione del dominio I che si lega ad ICAM‐1.

Sulla superficie dei leucociti sono presenti integrine che sono sulla membrana ma sono in conformazione

INATTIVA in cui c’è un tipo di interazione tra le code particolare e questa zone è ripiegata su se stessa.

Quando sono attivate, attivazione che viene dall’interno perché il leucocito prima ha subito il rolling su

endotelio e poi si prepara a fermarsi, tutta questa struttura si raddrizza e sia nella subunità alfa che beta.

Il dominio di riconoscimento può stabilire dei legami sempre non covalenti con una molecola della

superfamiglia delle Ig e quindi l’adesione è bel forte e forma il rotolamento dei leucociti nell’endotelio. Ci

sono diverse altre proteine di questa superfamiglia che sono utilizzate per caratterizzare sottotipi di leucociti,

per es. linfociti B, T a seconda dell’animale e sono collegati nel riconoscimento tra di loro nei vari processi

di attivazione immunitari. Partecipano a processi di attivazione e trasduzione del segnale.

LFA-2 (CD2) (Leukocyte Function Associated molecule-2)

Molecola di 50 kDa con due domini tipo‐Ig.Nell’uomo e nei ratti è presente solo nei timociti, linfociti T elinf

ociti NKNel topo è anche espresso dai linfociti B

Nell’uomo LFA‐2 si lega a LFA‐3Nel ratto e topo il principale ligando è CD48Il legame fra LFA‐2 e i suoi li

all’adesione l’antigene

gandi contribuisce fracellule T e le cellule che presentano o alle cellule bersaglio.

Il LFA‐2 può trasmettere segnali di attivazione al linfocito, e cisono prove che questi segnali abbiano un effe

sull’attivazione

tto sinergico dei linfociti T

LFA‐3 (CD58)

E’ simile a LFA‐2 in struttura: contiene 2 domini tipo‐Ig.Può esistere sia nelle forme transmembrana che leg

ate aglicosil‐fosfatidilinositolo.E’ espresso da una gran varietà di cellule, che includono

leucociti, cellule endoteliali, cellule epiteliali, eritrociti e fibroblasti Ligando: CD2 (LFA‐2) 8

da sapere bene, è argomento di domanda all’esame!!!

NCAM (CD56) (Neural Adhesion Molecule)

sia promuovere l’adesione, ma in certe situazioni anche ostacolarlaperché

Possono è un polimero di

zuccheri che può essere legata covalentemente in certe fasi dello sviluppo che viene perso nella maturità e

che nelle cellule del sistema nervoso dell’adulto, che sono in grado di riparare il SN (quindi nell’ambito di

attivazione delle cellule staminali neuronali che sono presenti in certe zone del cervello particolare, questa

migrazione è modulata da diverse sottofamiglie di questa.) Diverse di queste proteine che derivano da

splicing alternativo da un precursore solo possono avere anche modificazioni post-traduzionali importanti

che sono l’aggiunta di zuccheri della famiglia degli acidi sialici, soprattutto è presente nel tessuto nervoso ma

E’

anche muscolare, può essere espresso anche da linfonodi. coinvolta in legami di tipo omotipico.

Può anche interagire con il collagene e proteoglicani ad eparina/eparan e

condroitin solfato.Media interazioni cellula‐cellula e cellula‐matrice.Si pensa che sia coinvolta anche nel con

trollo dello sviluppo neuronale. Ruolo nei linfociti umani ancora non definito.

Ha domini diversi: III della fibronectina vicino alla membrana e una coda che può essere diversa a seconda

delle varie famiglie. La struttura comune delle N-CAM, ma possono avere gradi diversi di glicosilazione in

particolare di acido polisialico e possono arrivare ad avere polimeri con più di 100 molecole di acido sialico

legate. Acido sialico è di tipo diverso, quindi il grado di polisializzazione è diversificato, e questo fa parte del

set delle interazioni fra tipi cellulari diversi. Quattro forme di N‐CAM.

La parte extracellulare della catena

polipeptidica in ogni caso è

ripiegata in cinque domini di

tipo Ig (e uno o due altri domini,

detti “fibronectin type III repeats”).

Le estremità di ogni loop che

costituisce un dominio tipo Ig sono

collegate da

legami

disulfuro (S‐S; rosso).

(B) Modello per le interazioni omofiliche

dell’adesione

che sono alla base

cellula–cellula mediata da

N‐CAM

Anche fra queste ci sono tipi diversi: quelle che sono totalmente

extracellulari, l’isoforma con code GPI, coinvolte nel legame omofilico. 9

Coinvolte nell’organizzazione delle sinapsi.

Le N‐CAMs, un gruppo di proteine di adesione cellulare Ca2+‐independenti dei vertebrati, appartengono alla

superfamiglia Ig delleCAMs. Il loro nome riflette la loro particolare importanza nel tessuto nervoso.

Come le caderine, le N‐CAMs mediano primariamente interazioni di tipo omofilico, collegando cellule che

esprimono molecole N‐CAM simili. Al contrario delle caderine, le N‐CAM sono codificate da un singolo

gene; la loro diversità deriva da splicing alternativo del mRNA e da differenze nel grado di glicosilazione.

Come la N‐caderina, le N‐CAMs compaiono durante la morfogenesi, giocando un ruolo importante nel

loro ruolo nell’adesione cellulare è

differenziamento delle cellule muscolari, gliali e nervose. Il stato

l’adesione di

dimostrato con anticorpi specifici. Ad es., neuroni della retina in coltura è inibita dall’aggiunta

di anticorpi contro le N‐CAMs.

Tre delle N‐CAMs prodotte mediante splicing alternativo del trascritto primario prodotto da un singolo

gene CAM

N‐CAM 180 (180,000 MW) e N‐CAM 140 sono ancorate alla membrana

e differiscono nella lunghezza dei loro domini citoplasmatici. La N‐CAM 120 è legata alla membrana

mediante un’ancora a glicosilfosfatidilinositolo (GPI). Ciascuna di queste tre N‐CAMs possono anche

(2→8),

‐acidosialico

differenziarsi a seconda della lunghezza della catena di poli‐ il cui sito di legame

è indicato. 10

Proteine di adesione cellulare N‐CAMs

Le proprietà adesive delle N‐CAMs sono modulate da lunghe catene di acido sialico, uno zucchero carico

negativamente.

Le N‐CAMs che sono pesantemente sialate formano interazioni omofiliche più deboli delle forme

con un minore contenuto di acido sialico, probabilmente a causa della repulsione fra i residui di acido sialico

carichi negativamente. ( Tanto più numerosi sono i residui di acido sialico legati a queste, tanto più la

porzione della cellula viene respinta dalle altre cellule perché anche se non sono polisialate in questa zone,

che ha come ultimo zucchero l’acido sialico e c’è

la maggior parte di glicoproteine e glicolipidi una carica

negativa che riveste le cellule di fatto per impedire che le cellule si colleghino, si mette un gran numero di

per esempio nell’assone che sta crescendo e questo viene respinto.)

cariche negative delle N-CAM

L’adesivita è modulata dal grado di glicosilazione, in particolare dai residui di acido sialico.

l’acido polisialico costituisce fino al

Nei tessuti embrionali come ad es nel cervello, 25% della massa

di N‐CAMs. Viceversa, le N‐CAMs dei tessuti adulti contengono solo un terzo di acido sialico rispetto

all’embrione.

Le inferiori proprietà adesive delle N‐CAMs embrionali permettono che i contatti cellula‐cellula si formino

e in seguito si rompano, una proprietà necessaria per la formazione di contatti cellulari specifici

nell’embrione in via di sviluppo. Le superiori proprietà adesive delle N‐CAMs adulte stabilizzano questi

contatti. Quindi, la forza delle proprietà adesive fra le cellule viene modificata durante il differenziamento

dalla glicosilazione differenziale delle N‐CAMs.

Gli acidi sialici (Sia) sono zuccheri acidi che comprendono una famiglia di almeno 40 derivati naturali

dell’acido N‐acetilneuraminico dell’’acido N‐glicolilneuraminico dell’acido

(Neu5Ac), (Neu5Gc) e

deaminoneuraminico (KDN; 2‐cheto‐3‐deossi‐D‐glicero‐D‐galattononurosonico) con modificazioni

mediante acetilazione, solfatazione, metilazione, lactilazione e lactonazione.

Nella maggior parte dei casi, gli Sia sono localizzati in forma monometrica nelle estremità non riducenti

delle catene di carboidrati di glicoproteine e glicolipidi e giocano un ruolo importante nelle interazioni

ligando‐ recettore e nella communicazione cellula‐cellula.

N‐CAM e poliSia

Fra le glicoproteine contenenti poliSia, le più studiate sono le N‐CAMs. Le NCAM con legata una struttura

‐>

di 8 sono espresse sopratutto nel cervello embrionale. Dopo il differenziamento in cervello

adulto, la quantità della struttura poliSia è grandemente ridotta, mentre quella di NCAM non cambia.

nell’ippocampo e

Tuttavia, nel cervello adulto, sono presenti NCAMs nei nuclei ipotalamici dove si

‐>

osservano neurogenesi, migrazione cellulare e plasticità sinaptica. Il poliSia legato in 8 viene

attualmente considerato come un importante fattore di regolazione che impedisce legami forti fra NCAMs. 11

PECAM‐1 (CD31)

Molecola di superficie con 120‐130 kDa e 6 domini tipo‐Ig.Presente sulle piastrine, alcuni leucociti

e, a maggiori livelli, nelle giunzioni intercellulari delle cellule endoteliali.

E’ dall’endotelio E’ un marcatore

espresso di tutti i tipi di vasi ed è un utile marcatore dei vasi sanguigni.

delle giunzioni di membrana, delle cellule endoteliali quindi non è espresso sul versante luminare(rivolto

verso il sangue) ma è coinvolto nell’adesione tra una cellula e l’altra.

Fra i leucociti può essere espresso dai monociti e neutrofili e da sotto‐tipicaratteristici di linfociti T, soprattut

CD8+“naive”.

to dai linfociti T

Può anche essere espresso da cellule staminali del midollo osseo e celluletrasformate delle linee mieloide e p

iastrinopoietica (dei megacariociti). La coda di queste molecole ha dei domini che quando la molecola

adesione è coinvolta con il ligando viene fosforilato e quando è fosforilato o può essere defosforilato in un

secondo tempo o può essere riconosciuto da proteine diverse sotto la membrana. Proteina che modula segnali

diversi a seconda del ligando con cui sono impegnate.

v3.

Può interagire in modo omofilico.Può anche interagire con le integrine CD38 e

Anticorpi anti‐CD31 interferiscono con la formazione delle giunzioni tracellule endoteliali e bloccano la che

motassi di neutrofili e di monociti. Ci sono prove che il CD31 sia necessario per la transmigrazione di

neutrofili e monociti in vivo.

PECAM‐1 è una molecola di adesione espressa sulla superficie di cellule endoteliali, piastrine e leucociti.

E’ una proteina transmembrana con una regione extracellulare checontiene sei domini Ig‐like, un dominio tra

nmembrana e una corta codacitoplasmatica conservata che contiene un motivo immunomodulatorio

(ITIM). Questo motivo consiste in due residui di tirosina che, dopofosforilazione, si legano alla fosfatasi 2 (S

HP2) che inibisce diverse vie di attivazione.

Nelle cellule endoteliali, il PECAM‐1 si localizza sopratutto nelle giunzioni

intercellulari dove è coinvolto in interazioni omofiliche trans con PECAM‐1 nelle cellule vicine.

includonol’integrina

Il PECAM‐1 può anche legarsi a diversi altri contro‐recettori, che

αvβ3ma le funzioni di tali interazioni sono state peggio caratterizzate.

VCAM‐1 (CD106) (Vascular Cell Adhesion Molecule)

Molecola di 110 kDa con 7 domini tipo‐Ig.La sua espressione è indotta sulle cellule infiammatorie da

mediatori infiammatori quali IL‐1 e TNF‐.

Espressa anche in alcuni macrofagi, cellule dendritiche, cellulestromali del midollo osseo, cellule della sinov

ia nelle articolazioni infiammate e nelle cellule muscolari. 12

(VLA‐4) e .

Ligandi: integrine

l’estravasione

Promuove dei leucociti, soprattutto nei siti diinfiammazione.

all’adesione

Inoltre può participare fuori dalla vascolatura,che include il legame de linfociti alle cellule dendr

itiche e alle cellule del midollo osseo.

Info: nell’ambiene extracellulare esiste molto ADP o ATP che hanno dei ruoli diversi da quelli a cui siamo

abituati; vengono secreti da diverse cellule, agiscono su recettori colinergici e sono delle molecole di

Molte cellule dell’endotelio hanno degli

segnalazione. ADP partecipa a processi di aggregazione piastrinica.

enzimi che tagliano ATP e ADP extracellulare.. è promotore di aggregazione piastrinica. ( vabè, direi che

basta!! ) 13

MOLECOLE DI ADESIONE: INTEGRINE

Le integrine sono una famiglia di proteine integrali di

membrana, trovate soltanto negli animali, dove svolgono un

ruolo chiave nell’interazione delle cellule con la matrice

extracellulare e risposta a segnali provenienti dalla matrice

extracellulare e nell’ interazione fra cellule diverse, in

particolare nel richiamo dei globuli bianchi ai siti di

infiammazione, nella formazione dei trombi e in tanti altri

processi.

Sul lato extracellulare della membrana plasmatica le integrine legano una grande varietà di ligandi detti

sequenze amminoacidiche arginina-glicina-acido aspartico

multivalenti, perché la stessa proteina presenta

(RGD nella nomenclatura abbreviata degli amminoacidi), in grado di riconoscere il collagene

(glicoproteine), la fibronectina (proteina molto glicosilata), la laminina (glicoproteina).

Questa sequenza tripeptidica è presente nei siti di legame cellulare dei proteoglicani, della fibronectina,

della laminina e di varie altre proteine extracellulari.

Altre integrine riconoscono altre sequenze amminoacidiche o domini proteici.

l’aggregazione di integrine diverse e ciò contribuisce ad aumentare l’affinità di legame tra le

È possibile che ci sia

proteine, caratteristica importante soprattutto se la cellula deve rimanere saldamente adesa alla matrice; mentre

quando serve che la cellula contatti temporaneamente la matrice, o altre cellule, il legame deve essere debole in

modo tale che sia facilmente distrutto o creato, quindi in base al processo l’affinità della proteina per il ligando

deve essere modulata. Sul lato intracellulare della membrana, le integrine interagiscono direttamente o

indirettamente, con molte proteine differenti.

Nella slide 2 è possibile osservare una coda citoplasmatica più lunga dell’altra.

Prendendo in considerazione le integrine, gli emidesmosomi sono utilizzati per effettuare un legame saldo

soprattutto fra le cellule epiteliali e la matrice.

Slide 2 Struttura delle integrine

Le integrine sono i principali recettori proteici che le cellule utilizzano sia per legarsi che

per rispondere alla matrice extracellulare. transmembrana (α e ) di

Le integrine sono costituite da due catene polipeptidiche

dimensioni 120‐170 kDa e 90‐100 kDa, rispettivamente, legate tra loro in modo

non‐covalente, entrambe delle quali contribuiscono al legame con la MEC o con le altre

cellule. È stato visto che molti domini sono costituiti da foglietti beta.

α e

Le subunità essendo due polipeptidi distinti e avendo strutture a domini specifiche

non condividono alcuna omologia.

Capire in che modo sono strutturati i vari domini extracellulari di tale proteina contribuisce a far capire in che

modo può essere modulata l’affinità della proteina. al sito di legame dell’eterodimero con il ligando.

I domini extracellulari di entrambe le subunità contribuiscono

L’interazione delle integrine con i loro ligandi dipende da cationi divalenti extracellulari come calcio o magnesio, a

seconda dell’integrina (sono presenti da 3 a 4 siti di legame per ione divalente nel dominio extracellulare della

catena α, legame anche nella catena

adesso in alcune integrine sono presenti dei siti di ).

due domini diversi: αa e

Le integrine possono legarsi a cationi divalenti mediante a.

Il dominio αa nelle catene α αa

si trova e quando è presente media il legame con i cationi; se il dominio è assente, il

luogo mediante il dominio trova in tutte le catene

legame con il catione ha a che si (esempio integrine

piastriniche). 1

Il tipo di catione divalente può influenzare sia l’affinità che dell’attacco di un integrina ai suoi ligandi.

la specificità

La stessa proteina extracellulare può essere riconosciuta da diverse integrine, ad esempio almeno 8 integrine legano

la fibronectina e almeno 4 integrine legano la laminina.

dalla possibilità di effettuare lo “splicing alternativo” sull’ mRNA di

Questa diversità è ulteriormente aumentata

integrine.

Nell’uomo sono α e 8 subunità

state descritte 18 subunità che si assemblano in 24 integrine diverse e ciò

conferisce un’affinità diversa nei confronti della macromolecola; alcune integrine si legano soltanto ad un solo tipo

di macromolecola (esempio fibronectina o laminina), mentre altre si possono legare a diverse macromolecole

(esempio collagene+fibronectina+laminina).

In tale slide è possibile osservare le combinazioni note fra le

e α.

subunità

Ci sono dei tentativi di suddividere dal punto di vista funzionale le

rispetto alla sub unità α.

integrine in base alla loro subunità

La specificità delle integrine è data dalla combinazione specifica

α e

fra le subunità .

Subunità α:

α contiene sette ripetizioni di circa

Il dominio extracellulare della subunità

60 residui, che si ripiegano formando una struttura ad elica («propeller»), con

disposte attorno ad un asse centrale.

sette lame formate da foglietti

Ciascuna “lama” è numerata e svolge una specifica funzione.

La tasca di legame con il ligando si forma all’interfaccia fra le lame 2 e 3 del

α a della catena

dominio ad elica della subunità ed il dominio . Il suo

α abbia o meno

orientamento si altera leggermente a seconda che la subunità

il dominio αa.. È presente una sorta di incavo fra il dominio ad elica della

beta, si forma cosi una “nicchia” dove è necessario

subunità alfa ed il dominio

che ci sia la testa della subunità alfa e la testa della subunità beta.

catene α delle integrine presenta un

Un sotto‐insieme di dominio di

presente nella maggior parte delle integrine, che contiene un

inserzione (αA), localizzato fra le ripetizioni due e tre dell’elica, è

sito di legame per i cationi,

presente sia sulla catena alfa che beta di molte integrine; quattro catene alfa

contenenti alfa-a (alfa1, alfa2, alfa 10 e alfa 11) si combinano con beta1 per

dare una sottofamiglia distinta di legame con laminina/collagene.

Le integrine non contenenti alfa-a sono recettori selettivi per la laminina

(glicoproteina della lamina basale) e si legano sulla laminina a siti diversi da

quelli in cui si legano le integrine contenenti il dominio alfa-a

L’estremità carbossi-terminale dell’elica è un dominio di tipo

immunoglobulinico, detto Thigh (coscia), strutture stabilizzate da ponti S-S

a “beta sandwich”

seguite da due domini Calf1 e Calf-2 (sono domini basati

su beta foglietti) (calf= polpaccio) ed inoltre è presente un piccolo dominio

transmembrana. mostrano poca omologia, le

I domini intracellulari delle subunità alfa

varie subunità alfa presentano sequenze di amminoacidi molto diverse fra

2

loro, tranne che per un dominio conservato prossimo alla regione transmembrana che si associa con la coda

citoplasmatica della subunità beta.

Subunità β

Le regione extracellulari delle subunità beta delle integrine contengono:

- un dominio ibrido,

un dominio “plexin-semaphorin-integrin” PSI,

- 4 ripetizioni tipo “Epidermal Growth Factor” (EGF) e

-

- un dominio di code beta.

è un dominio “ig like”, presenta un sito di legame simile al dominio presente nella subunità beta

Il dominio ibrido

ed è chiamato alfa-a inserito fra due beta foglietti, è un ibrido fra immunoglobulina e foglietti beta.

Il dominio beta-a contiene un dominio di legame ai metalli che si lega a cationi divalenti quando la subunità alfa

non contiene il dominio di inserzione alfa-a.

forma un beta-foglietto antiparallelo a due filamenti fiancheggiato da due corte eliche ed è

Il dominio PSI

importante perché contribuisce all’attivazione delle integrine.

delle catene beta delle integrine sono corte e altamente conservate e presentano 2 domini

Le code citoplasmatiche

fosforilazione, presentano diversi amminoacidi che possono essere fosforilati ed innescare un’ organizzazione

di

del citoscheletro o una particolare trasduzione del segnale. Le code reclutano proteine quali la talina, che si lega ai

filamenti di actina collegando le integrine al citoscheletro di actina e le interazioni integrine-citoscheletro sono

essenziali per l’attivazione delle integrine.

L’ETERODIMERO DELLE INTEGRINE

La struttura extracellulare degli eterodimeri di integrine consiste in una

“testa” e due “gambe”.

dell’integrina è il principale punto di contatto tra le subunità alfa

La testa

e beta; i contatti sono formati dalle interazioni dell’elica della catena alfa

e il dominio beta-alfa della catena beta.

sono formate dai domini Thigh (coscia) e Calf 1 (polpaccio)

Le gambe alfa e i domini PSI, EGF, TD della subunità

della subunità beta.

Le “ginocchia” sono importanti, perché permettono all’integrina di

adottare una conformazione ripiegata o dritta, che è fondamentale per l’attivazione delle integrine.

Si ha interazione tra le subunità alfa e beta sia a livello delle teste che a livello delle gambe.

dei segmenti transmembrana serve a portare l’integrina in situazioni di

È stato visto recentemente che l’interazione

inattività, in cui le code sono vicine, mentre quando le due code sono separate i due segmenti transmembrana non

entrano in contatto e anche tale processo fa parte dell’attivazione delle integrine.

β1

INTEGRINE

Sono presenti meno subunità beta rispetto alle subunità alfa, ma è proprio la subunità beta che condiziona la

funzionalità dell’integrina. Quindi le varie famiglie sono descritte in base alla subunità beta.

Le integrine beta1 comprendono la maggiore sub-famiglia delle integrine e sono espresse da una grande diversità di

cellule. Sono spesso presenti nelle integrine coinvolte nel collegamento con la matrice, ma sono anche coinvolte

nell’attivazione dei leucociti, infatti il più importante membro della subfamiglia delle integrine beta1 dei leucociti è

il Very Late Antigen-4(VLA CD49d/CD29, alfa4beta1). Il VLA-4 si lega al suo ligando VCAM-1 (molecola di

ed è il principale responsabile dell’adesione dei linfociti

adesione della superfamiglia delle immunoglobuline),

all’endotelio vascolare e del reclutamento dei leucociti alle zone infiammate. Gli immunogeni riconoscono tali

integrine come VLA.

Le subunità beta1 formano dimeri con almeno 12 subunità alfa distinte. 3

α5 della fibronectina e α6

Esse si trovano su quasi tutte le cellule dei vertebrati.: 1, per esempio, è un recettore 1 è

un recettore della laminina su molti tipi di cellule.

l’espressione della subunità

Anche durante lo sviluppo embrionale beta può essere regolata, molti individui

comprano anticorpi anti beta-1 per studiare lo sviluppo embrionale.

INTEGRINE β2 4 differenti catene alfa (αl,αm, αx e αd)

Formano eterodimeri con che sono poi riconosciute da CD (cluster

differentescion), i quali riconoscono o subunità alfa o subunità beta. di integrine, l’espressione delle integrine

Al contrario delle altre subfamiglie

beta2 si riscontra solo nei leucociti. Tali integrine svolgono un ruolo

fondamentale nella lotta alle infezioni e mediano soprattutto infezioni cellula-

cellula.

Si legano a ligandi specifici sulla superficie di altre cellule (contro recettori),

come membri della superfamiglia delle immunoglobuline soprattutto nelle

cellule endoteliali.

Le integrine beta 2 sono espresse esclusivamente dai leucociti e subiscono

un’alterazione conformazionale che coinvolge la fosforilazione della subunità beta nel processo di attivazione.

Tuttavia questa fosforilazione non è necessaria ne sufficiente per l’attivazione conformazionale.

Lo stato di attivazione è controllato dal sito GFFKR(gly- phe- phe- lys- arg ) immediatamente adiacente al dominio

transmembrana della catena alfa.

Molti degli antigeni con cui gli immunologi descrivono le varie sottopopolazioni sono catene beta, per esempio

l’antigene dei linfociti, MAC-1

LFA è è espresso nei granulociti e monociti.

β2 includono 4 diversi eterodimeri

Le integrine l’integrina β2 predominante.

- CD11a/CD18 [Lymphocyte Function‐Associated Antigen‐1] (LFA 1)

- CD11b/CD18 (Mac esclusiva dei granulociti e monociti

1),

- CD11c/CD18 (p150,95)

- CD11d/CD18. per la molecola β2 (CD18) provoca una malattia genetica, la

Una mutazione nel gene che codifica LAD,

I pazienti con LAD hanno infezioni batteriche ricorrenti dovute all’incapacità di

Leukocyte Adhesion Deficiency.

reclutare attivamente i granulociti in risposta alle infezioni.

LFA-1(αlβ2):

è espresso su linfociti, granulociti, monociti e macrofagi; il suo livello di espressione aumenta dopo attivazione.

Si lega ad I-CAM-1 (CD54), ICAM-2 (CD102) e ICAM-3 (CD50).

L’interazione LFA-1 con i suoi ligandi gioca un ruolo critico in un ampio arco di funzioni, che includono le

risposte dei linfociti T e B e l’adesione dei leucociti alle cellule endoteliali.

MAC-1(αMβ2):

espresso ad alti livelli sui monociti e granulociti e a livelli più bassi su un sottoinsieme di linfociti T.

l’attivazione dei monociti e dei granulociti porta alla mobilizzazione dei depositi intracellulari di MAC-1e ad un

rapido aumento della sua espressione sulla superficie cellulare. Si lega alla componente iC3b del complemento, al

L’interazione di Mac-1

fibrinogeno, al fattore X della cascata della coagulazione e a ICAM-1. con iC3b media la

fagocitosi dei bersagli opsonizzati. È inoltre coinvolto nella migrazione trans endoteliale dei monociti e dei

neutrofili.

P150,95(αxβ2):

Espresso soprattutto dalle cellule dentritiche, monociti, macrofagi e granulociti. Si trova anche a livelli più bassi

sulle cellule NT e cellule T attivate.

Si lega a iC3b,ICAM-1,fibrinogeno e al polisaccaride della parete dei batteri Gram negativi.

L’interazione di αxβ2 è importante per l’adesione di monociti e neutrofili

a ligandi ancora sconosciuti

all’endotelio infiammato e può essere coinvolta nell’attività citotossica delle cellule T.

αDβ2: 4

espressa in alti livelli dai macrofagi della polpa rossa della milza e dalle cellule schiumose delle strisce grasse che

si formano sulla parete dell’aorta nei processi di aterosclerosi.

È espressa a livelli più bassi da sub-tipi di leucociti del sangue periferico. Si lega a ICAM-3 ma non a ICAM-1 o a

VCAM-1.

(PS:tutta la parte scritta in corsivo è presente nelle slide, ma non è stata spiegata dalla prof)

β3

INTEGRINE

Sono espresse da diversi tipi di cellule (esempio piastrine)

Si legano a diverse proteine della matrice extracellulare, incluso il fibrinogeno nel processo della coagulazione

sanguigna. Sono coinvolte nella formazione del tappo piastrinico e nella formazione di vari coaguli. Deficienza di

catene beta3 portano ad insorgenza di patologie come l’emofilia dove non si può formare il tappo piastrinico e

basta una piccola ferita affinchè ci sia un eccessivo sanguinamento.

α2bβ3, mentre il recettore α2b

Nelle piastrine è costitutivamente espresso il 3 delle piastrine non

recettore

fibrinogeno, il recettore α2b

stimolate si può legare soltanto al 3 delle piastrine attivate è in grado di legarsi oltre

che al fibrinogeno anche al fattore di von Willebrand,

fibronectina, vitronectina e trombospondina.

L’adesione mediata da α2b 3 gioca un ruolo critico

nell’aggregazione ed attivazione delle piastrine.

L’attivazione piastrinica è accompagnata da una

conformazionale di α2b

modificazione 3 e il legame con

il ligando induce un’ ulteriore alterazione della

conformazione.

Le piastrine attivate presentano un pool di monomeri che

possono essere poi polimerizzati in risposta a vari

segnali.

Come si può notare dalla slide la piastrina diventa una struttura stellata e molto contrattile, infatti quando si collega

al coagulo contraendosi può anche contribuire a diminuire la struttura del coagulo.

Quindi: β1 con almeno 12 subunità α distinte;

formano dimeri esse si trovano in quasi tutte le cellule dei

Le subunità

vertebrati, sono soprattutto coinvolte nel collegamento con la matrice.

β2 formano dimeri con almeno 4 tipi di subunità alfa e sono espresse esclusivamente sulla superficie

Le subunità

dei globuli bianchi, dove hanno un ruolo essenziale nel rendere queste cellule capaci di combattere le infezioni.

Le integrine β3 si trovano su una varietà di cellule, fra cui le piastrine.

Le subunità alfa e beta delle integrine presentano dei sottodomini e ciascun sottodominio svolge un compito

specifico.

INTEGRINEβ4-β8

L’integrina beta4 (CD104) forma un eterodimero con la subunità alfa6 che si lega alla laminina.

È espressa nelle cellule epiteliali, sotto-insiemi di cellule endoteliali, e sotto insiemi di timociti immaturi nel topo,

sono studiate nel campo dei linfociti e degli organi linfoidi e sono meno comuni nell’organismo rispetto alle altre

classi di integrine.

Bisogna ricordare che la beta 4 è la tipica integrina che si trova negli emidesmosomi e presenta una coda molto

lunga.

È possibile visualizzare nelle tabelle seguenti le varie classi di integrine, dove sono espresse, i controrecettori, e

cosa comporta una mutazione nelle varie subunità. 5

PRINCIPALI FUNZIONI DELLE INTEGRINE

- Collegamento della cellula alla matrice extracellulare (MEC)

- Trasduzione di segnale tra la MEC e la cellula

- Presentano inoltre una grande varietà di attività immunologiche, possono essere importanti per i linfociti nella

ricerca di cellule con cui attivarsi o distruggere, la migrazione cellulare e il legame alle cellule di alcuni virus,

quali l’adenovirus, l’ecovirus, lo hantavirus e virus che provocano patologie alla bocca e al piede.

Un’

- importante funzione delle integrine si vede nella molecola GPIIbIIIa (bersaglio anche nel campo

dell’arterosclerosi), un’integrina presente sulla superficie delle piastrine, responsabile del

collegamento alla fibrina all’interno di un coagulo sanguigno in formazione. Questa molecola aumenta in modo

drammatico la sua affinità di legame per la fibrina/fibrinogeno mediante associazione delle piastrine con i collageni

esposti nel sito della ferita.

Dopo associazione delle piastrine con il collagene, la GPIIbIIIa cambia conformazione, permettendole di legarsi

alla fibrina e ad altri componenti del sangue per formare la matrice del coagulo e fermare la perdita di sangue.

Le integrine funzionano come una sorta di “antenne” sono sempre allerta su ciò che avviene sia fuori che

all’interno della cellula e sono in grado di indurre anche un cambiamento dell’espressione genica per

accompagnare ciò che succede nell’ambiente esterno e tale caratteristica è molto importante.

Negli organismi pluricellulari le strutture esterne alla cellula sono importanti per organizzare i vari tessuti e

mediare gli scambi metabolici. Esiste una sorta di legame mediato da proteine transmembrana in questo caso,

proteine che attraversano la doppia membrana della cisterna nucleare che sono collegate alle proteine della lamina

collegate ai cromosomi quindi c’è una continuità meccanica fra l’interno del nucleo e

che a loro volta sono

l’ambiente esterno. 6

Slide 3 È importante prendere in considerazione non solo le molecole di adesione presenti

sulla membrana cellulare, ma anche la possibilità di tenerle collegate

meccanicamente al citoscheletro, infatti come mostrato nella slide 3 esiste una

forza di stiramento da parte della matrice. Se le molecole di adesione non fossero

ancorate da qualche parte, la cellula probabilmente rimarrebbe impassibile e la

proteina si staccherebbe dalla membrana, mentre se esiste tale strategia di

collegamento delle molecole di adesione con le strutture del citoscheletro, la

cellula può assecondare le sollecitazioni meccaniche dell’ambiente esterno ed

adattarsi, e ciò è importante per la vita della cellula.

In tale slide è possibile osservare alcune proteine di collegamento molto

importanti, sono presenti delle code di una delle subunità di integrina, sono

presenti dei fasci di actina formando delle strutture che sono come dei piccoli

muscoli (micro sarcomeri) che permettono alla cellula di avere una forma tesa in grado di appiattirsi su un

substrato, oppure può generare delle contrazioni portando dietro il citoplasma . Quando parleremo del citoscheletro

vedremo che tali proteine che formano dei dimeri formano dei fasci che tengono lontane le singole fibre di actine

per permettere l’inserimento nel centro di alre proteine, solitamente sono delle proteine motrici , es la miosina.

Alla matrice non sono solamente adese le integrine, ma sono anche

collaborano all’adesione

presenti diversi proteoglicani di membrana che

e alla segnalazione che arriva dalla matrice.

FUNZIONI DELLE INTEGRINE NEI LEUCOCITI

Le integrine giocano un ruolo ben definito nel movimento dei leucociti verso i siti di infiammazione.

In seguito alla fase iniziale di “rolling” mediata da selectine, il flusso di leucociti è rallentato ulteriormente

dall’interazione di integrine sulla superficie dei leucociti con molecole di adesione intercellulare della

superfamiglia delle immunoglobuline (ICAMs) espresse dalle cellule endoteliali attivate.

Le integrine solitamente non si legano ad un ligando prima di essere attivate, le cellule devono prima ricevere uno

stimolo che attivi l’integrina.

Lo stimolo può essere fornito da chemochine, da legami incrociati di recettori dei leucociti quali Cd2 e Cd3, o da

segnali indotti dal legame a molecole quali le selectine E- e P- sulla superficie delle cellule endoteliali.

Tutti questi stimoli segnalano l’arresto del linfocita; si ha un’inattivazione dall’interno (inside out) dell’integrina

che passa da una situazione da ripiegamento su se stessa ad allungamento e la sua struttura è pronta per riconoscere

un’altra proteina. particolare, sono un fattore principale di attivazione dell’adesione

Studi recenti suggeriscono che le chemochine, in

mediata da integrine all’endotelio e successivamente arresto dei leucociti.

L’adesione di recettori dell’integrina.

stabile dei leucociti attivati è mediata da entrambe le famiglie beta1 e beta2

L’adesione dei neutrofili alle cellule endoteliali di integrine 2. LFA-

è mediata principalmente dall’interazione

1(α2 2) e Mac-1(αm 2) con le ICAM-1 e ICAM-2 espresse dalle cellule endoteliali.

Inoltre interazioni adesive mediate da integrine beta1 possono contribuire all’extravasazione dei leucociti. 7

L’interazione di α4 1 con VCAM-1 espressa sulle cellule endoteliali attivate contribuisce alla migrazione di

linfociti, monociti, basofili ed eosinofili.

L’importanza dell’adesione mediata dalle integrine beta2 in vivo è illustrata dalla sindrome di decicit di adesione

type 1, LAD1) in cui vi è un’assenza totale o parziale di

(Leukocyte adhesion Deficiency

leucocitaria di tipo 1

integrine beta 2 nei leucociti. I pazienti con tale condizione ereditaria soffrono di gravi infezioni batteriche e

funginee. I loro neutrofili possono rotolare, ma non aderiscono al tessuto endoteliale e non riescono a migrare dal

torrente sanguigno ai siti di infiammazione. Difetti simili si ritrovano in topi carenti di ICAM-1.

LEGAME CON IL CITOSCHELETRO collegamenti (o “integratori”)

Le integrine fungono da

transmembrana mediando le interazioni richieste fra il citoscheletro

e la matrice extracellulare per permettere alle cellule di aderire alla

matrice. La maggior parte delle integrine sono collegate ai

ad eccezione dell’integrina α6

filamenti di actina, 4, che si trova

negli emidesmosomi, in quanto è collegata funzionalmente ai

Dopo il legame dell’

filamenti intermedi. integrina al suo ligando

coda citoplasmatica della subunità si collega a

nella matrice, la

diverse proteine intracellulari di ancoraggio, che includono la

la α‐actinina

talina, e la filamina.

A loro volta, queste proteine di ancoraggio si possono legare

strettamente all’actina o ad altre proteine di ancoraggio come la collegando funzionalmente l’integrina ai

vinculina

filamenti di actina della corteccia cellulare.

La corteccia cellulare è una zona della cellula sottostante la membrana molto densa che di solito esclude gli

organelli, ed è una zona molto ricca di actina.

questo collegamento porta all’aggregazione

Normalmente, delle integrine e alla formazione di adesioni focali tra la

cellula e la matrice extracellulare.

Se il dominio citoplasmatico della subunità è deleto con tecniche di DNA ricombinante, le integrine più corte si

legano ai loro ligandi, ma non mediano più una forte adesione, e non sono più in grado di aggregarsi nelle adesioni

focali.

Sembrerebbe che le integrine interagiscono con il citoscheletro per collegare fortemente le cellule alla matrice,

così come le caderine debbono interagire con il citoscheletro per collegare le cellule in

modo efficace.

Il collegamento al citoscheletro potrebbe aiutare le integrine ad aggregarsi, producendo un legame di aggregazione

blocca l’integrina in una conformazione che le permette di collegarsi al suo ligando specifico in

più forte; inoltre

modo più stretto.

Così come le caderine promuovono l’adesione cellula‐cellula senza formare giunzioni aderenti mature, le integrine

l’adesione cellula‐matrice

possono mediare senza formare adesioni focali mature.

In entrambi i casi, tuttavia, le molecole di adesione transmembrana possono ancora legarsi al citoscheletro.

Per quanto riguarda le integrine, questo tipo di adesione ha luogo quando le cellule si espandono o migrano e

portano alla formazione dei complessi focali (adesioni focali localizzati).

Mentre quando la cellula si ferma si ha la maturazione del complesso focale formando delle strutture più estese con

un maggior numero di integrine che si aggregano e si stabilizzano fra loro.

l’attivazione

Affinchè i complessi focali maturino in adesioni focali è necessaria della proteina Rho GTPasi.

L’attivazione di Rho porta al reclutamento di ulteriori filamenti di actina e di integrine verso il sito di contatto. 8

ADESIONI FOCALI

Sono delle zone circoscritte nella membrana di tutte le cellule, non solo di cellule immobili, ma soprattutto in

cellule mobili in cui si concentrano delle integrine di collegamento con il citoscheletro che sono collegate

all’interno con il citoscheletro di actina. Tali giunzioni possono essere temporanee se la cellula è in movimento

oppure possono essere sempre presenti, e nelle cellule immobli si trovano insieme agli emidesmosomi.

Durante lo sviluppo embrionale nella formazione delle giunzioni di membrana si formano inizialmente delle

piccole zone di adesione che richiamano altre proteine rafforzando così il punto di contatto. Durante lo sviluppo

embrionale, anche nelle zone di contatto con la matrice si formano delle piccole zone che poi richiameranno altre

proteine per formare degli emidesmosomi più saldi.

sono caratterizzati da integrine che prendono direttamente contatto con il citoscheletro

I punti di adesione focale

di actina, mentre sono caratterizzati da integrine con subunità beta4 con una coda estremamente

gli emidesmosomi

lunga che collabora alla formazione di complessi di proteine che formano una placca di rafforzamento della coda di

integrine e a tale placca successivamente si collegano le proteine dei filamenti intermedi.

Il compito degli emidesmosomi è quindi quello di generare resistenza agli stress meccanici, mentre il compito

e sentire stimoli provenienti dall’ambiente

delle adesioni focali è quello di assecondare dilatazione-contrazione

esterno.

Difetti in tali strutture sono gravi, perché le cellule possono facilmente distaccarsi dalla lamina basale permettendo

l’ingresso di batteri ed inoltre viene meno la funzione di barriera degli epiteli.

si nota che alcuni dei prodotti della degradazione del collagene 17 sono coinvolti nel

Negli emidesmosomi

controllo dell’angiogenesi.

Il collagene 17 è una proteina trans membrana (normalmente i collageni che si conoscono sono collageni della

matrice extracellulare) che gioca un ruolo importante nel mantenimento del collegamento tra gli elementi strutturali

coinvolti nell’adesione dell’epidermide.

intracellulari ed extracellulari

È un eterodimero con tre catene alfa1 ed ogni catena di 180 kDa contiene un dominio intracellulare globulare di

circa 70 kDa che interagisce con la subunità beta4 delle integrine, con la plectina e con la BP230.

Gli emidesmosomi sono necessari per il collegamento stabile degli emidesmosomi ai filamenti intermedi di

cheratina. ASSE INTEGRINE- FILAMENTI INTERMEDI

(il termine asse dà l’idea di un collegamento funzionale che bisogna

tener presente)

L’interazione dell’integrina con i filamenti intermedi è fondamentale per

l’integrità dell’epitelio il quale deve essere saldamente collegato alla

lamina basale.

Sono presenti molte patologie con formazione di bolle e di vescicole

dovute a mutazioni dell’integrina beta4, tipica proteina degli

emidesmosomi che ha come ligando la glicoproteina laminina

Le membrane basali («Basement Membranes», BMs) sono strati densi di

matrice extracellulare che fungono da barriere strutturali che separano le

cellule epiteliali, cellule endoteliali, assoni dei nervi periferici, cellule adipose e cellule muscolari dal sottostante

stroma.

Tali membrane presentano dei pori di notevole dimensione condizionando ciò che passa.

Presentano una carica negativa permettendo il passaggio di cationi e ostacolando il passaggio di anioni, inoltre

richiamano alcuni fattori di crescita di differenziamento mentre ne escludono altri.

Le BMs forniscono sostegno strutturale, separano i tessuti in compartimenti e regolano il comportamento cellulare.

9

Tutti i tipi cellulari producono componenti della BM: collagene di tipo IV, laminina, fibronectina, proteoglicani

eparan solfato e nidogeno/entattina oltre a componenti minori.

La composizione molecolare della BM varia nei differenti tessuti conferendo ad essi una specificità di segnalazione

importante per definire le funzioni specializzate delle cellule epiteliali ed endoteliali nei diversi organi.

Tutte le BM contengono laminine, una famiglia di 16 glicoproteine eteropolimeriche generate dalla combinazione

5α, 4 e 3 .

di catene

Quando presenti in concentrazione sufficiente, le laminine possono auto assemblarsi in polimeri che interagiscono

con altre componenti della ECM, nonchè con recettori sulla superficie cellulare quali le integrine e il distroglicano.

Le isoforme di laminina presenti nei tessuti sono regolate in modo tessuto‐specifico e regolate nel tempo durante lo

(che contiene catene α3, 3 e 2; preferenzialmente nota

sviluppo embrionale. La laminina‐332 come laminina‐5) è

una componente delle BM epiteliali, e quindi è presente nella pelle, mucosa squamosa stratificata, amnio e cornea.

La sua principale funzione è quella di mantenere l’integrità epiteliale e la coesione epitelio‐mesenchima in tessuti

dall’unica capacità

esposti a forze meccaniche elevate. Questa funzione è facilitata della laminina‐332 di interagire

l’integrina α3 1 porta all’assemblaggio dei punti di

con integrine distinte. La sua interazione con adesione focale

l’interazione con le integrine α6 4

(FA), mentre porta alla formazione di emidesmosomi.

sono complessi multiproteici presenti negli epiteli semplici e stratificati.

Gli emidesmosomi

Sono presenti due tipi di emidesmosomi che si distinguono in base alla composizione molecolare.

Tipo I (emidesmosomi classici): si trovano negli epiteli stratificati (es. pelle) e contengono tre proteine

transmembrana:

Integrina α6 4, tetraspanina CD151, e collagene di tipo XVII («antigene 180 bullous pemphogoid, [PD]).

contengono solo l’integrina α6 4.

Tipo II: si trovano negli epiteli semplici (es. Intestino) e

Le proteine specifiche per la formazione della placca degli emidesmosomi appartengono alla famiglia delle

placchine.

Gli emidesmosomi collegano la matrice extracellulare alla rete dei filamenti intermedi. Quest’interazione è

stabilita da due proteine della famiglie delle plectine: la plectina e la BP230, solo la plectina è presente sia negli

emidesmosomi di tipo I che di tipo II. Le plectine sono grandi proteine citoplasmatiche , che nel loro C-terminale

contengono sei ripetizioni di tipo placchina. Le interazioni della plactina con i filamenti intermedi è mediata da

una sequenza di residui basici che collega la quarta e la quinta ripetizione placchina.

L’estremità amminoterminale delle plectine contiene tuttavia due domini “calponin homology “(CH) che

costituiscono un dominio di legame con l’actina.

dominio di legame con l’actina le plectine si possono associare o con il dominio citoplasmatico

Mediante il

dell’integrina alfa6beta4 o con i filamenti di actina.

La maggior parte delle integrine sono collegate a filamenti di actina, mentre l’integrina beta4 è tipica degli

emidesmosomi ed è collegata ai filamenti intermedi.

Integrina α6β4 plectina 10

Trasduzione del segnale

La trasduzione del segnale mediata da integrine regola:

la proliferazione, la morte apoptotica, il differenziamento, motilità cellulare nell’ambiente extracellulare.

l’affinità di legame con l’ambiente

Tra i processi che coinvolgono la segnalazione di inside out che condizionano

processi di trasduzione di segnale che provocano l’attivazione di PIP2; il diacilglicerolo

esterno, ci sono diversi

rimane sulla membrana, mentre la testa polare può anche provocare un rilascio di calcio, ma ci sono anche delle

proteine che sono delle chinasi che provocano l’inizio di tale via; quindi alcuni dei segnali mediati da PIP2

provocano un collegamento o meno della talina che è la proteina che più condiziona l’attivazione delle integrine, e

con cui tali integrine dall’altra

quindi può avvicinare o separare le code delle integrine e selezionare poi il modo

parte vengono a legarsi al substrato esterno.

Se la cellula normalmente sta migrando e riconosce un ligando e tale ligando non solo lega l’integrina ma sollecita

anche l’aggregazione di varie integrine, quindi quante più integrine si collegano tanto più forte è il legame, questo

collegamento con molecole dell’ambiente esterno può far partire un segnale in cui è condizionata la polarità della

cellula, può essere un segnale di proliferazione, un segnale di cambiamento conformazionale ecc.

Se si immagina per esempio lo sviluppo embrionale con la cellula che migra in varie zone, i segnali per fermarsi o

meno , differenziarsi o meno arrivano dall’ambiente esterno e sono mediati dalle integrine che la cellula ha

coinvolto con tale legame.

Il segnale può anche partire dall’interno e questo può condizionare la forza con cui le varie integrine si collegano

e può anche promuovere un distacco di collegamento, può promuovere la migrazione, oppure può promuovere una

disposizione diversa del tipo di matrice assemblata, perché se sono integrine che riconoscono un proteoglicano, chi

una laminina chi un collagene possono condizionare un’organizzazione diversa della matrice in quella zona lì.

Definizioni: un’ integrina singola ed il suo

forza di legame tra ligando. Questa può essere alterata da alterazioni

Affinità:

conformazionali nella struttura dell’integrina.

misura della forza complessiva di legame di integrine aggregate.

Avidità: l’avidità di legame con il substrato

Quanto più integrine si associano tanto maggiore è

Seminario: –

Asse Integrine Filamenti intermedi

Emidesmosomi: struttura e assemblaggio

L’interazione della plectina con la coda citoplasmatica dell’integrina α6 4 è considerato il passo iniziale per la

formazione degli emidesmosomi.

La coda dell’integrine α6 4 è insolitamente lunga alcuna omologia con le altre subunità delle

e non condivide

integrine.

La sua interazione con la plectina induce un’alterazione nella coda dell’integrina.

conformazionale

Poichè il reclutamento del collagene di tipo XVII e della placchina BP230 ai desmosomi richiede una previa

con la 4, questo cambiamento conformazionale potrebbe

interazione della plectina facilitare le interazioni di

entrambe le proteine con l’integrina.

Seminario

Collagene di tipo XVII (noto anche come BP180)

Il grande ectodominio C‐terminale di circa 120 kDa consiste in 15 subdomini collagenosi, caratterizzati dalle

tipiche sequenze ripetute G‐XY dei collageni.

dell’ectodominio

La struttura globale è quella di una triplice elica flessibile con una significativa stabilità termica.

11

La parte prossimale alla membrana dell’ectodominio, all’interno degli aminoacidi 506‐519, è responsabile del

legame con la subunità α6 dell’integrina – aspetto apparentemente importante per l’integrazione del collagene di

tipo XVII nell’emidesmosoma.

Il maggiore dominio colalgenoso, Col15, che contiene 232 aminoacidi (aa 567‐808) contribuisce significativamente

a stabilizzare l’omotrimero del collagene XVII.

Il C‐terminale del collagene XVII si lega alla laminina 5 e la corretta integrazione della laminina 5 nella ECM

richiede il collagene XVII.

(ps: la prof chiede spesso all’esame la membrana basale) 12

NOTA: Nella diapositiva della scorsa lezione, bisogna correggere fosfatidilserina con PIP2.

La seconda diapositiva sulle integrine mostrata la scorsa volta, dice che le integrine interrogano

costantemente l’ambiente esterno e quindi permettono alle cellule di adeguarsi alle modificazioni che

in questo avvengono; ciò è anche vero per quanto riguarda l’ambiente interno. In questo ruolo di

“antenna”, in altre parole di strutture coinvolte non solo nell’adesione, ma anche nella sensibilità,

troviamo coinvolto anche il citoscheletro con i

filamenti di actina; questo accade in processi

che riguardano non solo l’adesione di una

cellula che è ferma nel tessuto (quindi negli

epiteli con gli emidesmosomi, punti di adesione

focale), ma anche in diverse altre situazioni. Ci

sono casi in cui questo contatto funzionale fra

integrine ed actina, è estremamente studiato,

ad esempio nella migrazione delle cellule e nella

contrazione muscolare. L’asse integrina-

filamento di actina, descrive il collegamento

funzionale che c’è fra l’affinità o meno di

un’integrina alla matrice (spesso associata ad

un’altra integrina verso un ligando) e la forma

della cellula, le tensioni interne della cellula, la

possibilità di avere piccole contrazioni. Nell’immagine(sopra), si vedono proteine sottostanti la

membrana che si possono riunire per influenzare l’organizzazione dell’actina; possiamo immaginare

sotto la membrana, le proteine scaffold che permettono di avvicinarle. Recentemente si sta notando

che l’affinità verso alcuni lipidi di membrana, contribuisce ad avvicinare alcune proteine alla

membrana stessa. Il lipide in questione è il fosfatidilinositolo bifosfato, componente del foglietto

interno della membrana.

Migrazione cellulare Contrazione della muscolatura liscia

Le integrine sono studiate per esempio durante la migrazione cellulare, processo che richiede che le

integrine vengano messe sulla membrana e poi ritirate (spostate nella zona di avanzamento e poi

ritirate nella zona dietro). Chi si occupa di endocitosi può studiare i recettori e come vengono in certe

situazioni anche riciclati per andare in altre zone. Questi sono studi che si trovano in riviste che

parlano della migrazione di fibroblasti, delle cellule del mesenchima embrionale e delle cellule

metastatiche, dove si vede partendo da un’organizzazione a riposo cosa può succedere con

attivazione e trasduzione di segnale. Viene anche studiato cosa succede nella contrazione delle cellule

muscolari per quanto riguarda le integrine (guarda immagine sopra). 1

Fibronectina: Il principale ligando delle integrine sulla matrice extracellulare, è la fibronectina, una

glicoproteina (che verrà poi ripresa nel capitolo della matrice extracellulare). Al contrario di ciò che

avviene negli emidesmosomi, dove la subunità coinvolta è la nel caso del collegamento con actina

β4,

invece, è soprattutto coinvolta la Molte di queste riconoscono domini particolari della

β1. β1

fibronectina, proteina multimodulare. La fibronectina è studiata nei campi che vanno dallo sviluppo

embrionale (perché è la pista che seguono le cellule già dalla gastrulazione in avanti) ai processi di

formazione di coaguli e trombi di riparazione delle ferite. Quindi la fibronectina è una proteina

ubiquitaria intorno alle cellule, in particolare nei tessuti dove c’è “un via vai di cellule”. Questo “via

vai” di cellule si può immaginare anche nella formazione di nuovi vasi sanguigni, cioè quando

l’endotelio da quiescente, riceve uno stimolo (perché qualche parte del tessuto non riceve abbastanza

ossigeno e c’è da costruire un nuovo vaso) e questo richiede che le cellule endoteliali cambino il loro

stato da quiescenti a proliferanti, da statiche a migranti e così via fin quando un po’ alla volta si

costruisce un nuovo vaso ed il percorso del nuovo vaso sarà marcato dalla posizione della

fibronectina. La fibronectina è un dimero legato da ponti disolfuro che poi polimerizza ulteriormente;

ha diversi moduli che oltre a dare una certa forma alla proteina, contengono delle sequenze che

vengono riconosciute se utilizzate per collegamento con il collagene, con le cellule, con l’eparina (un

glicosaminoglicano). Ha una struttura plastica in quanto il solo collegamento rigido si trova

all’estremità carbossiterminale mediante il legame S-S. Questa è una di quelle proteine che può

cambiare forma, può allargarsi e proprio le integrine saranno determinanti per la polimerizzazione di

questa molecola nella matrice. La stessa molecola extracellulare può essere riconosciuta da integrine

diverse (soprattutto β1 ma anche di tipo β3 coinvolta nella

vasculogenesi) sulla stessa cellula o su cellule diverse.

Normalmente molte proteine in conformazione globulare,

possono aver nascoste al loro interno, delle sequenze di

amminoacidi che sarebbero riconoscibili da proteine sulla

membrana. Questi vengono descritti come siti criptici. Se la

proteina cambia conformazione in seguito a stiramento (come

avviene durante la polimerizzazione della fibronectina) o se le

metalloproteasi della matrice frammentano alcuni domini, il

cambiamento di conformazione, può fare emergere una

sequenza che prima era nascosta. In questo caso le sequenze

che emergeranno, permetteranno la polimerizzazione dei vari monomeri formando una rete estesa

(guarda il video). Il collegamento con la fibronectina in particolare, corrisponde a punti di adesione

focale. Il collegamento di una molecola e di un monomero con delle integrine in particolare, induce

una tensione meccanica tramite il citoscheletro di actina che viene comunicata alla fibronectina e la fa

distendere; il risultato è che i vari monomeri si legano fra di loro e si forma una specie di ragnatela che

di solito può rivestire la cellula o nel caso di alcune molecole può anche andare direttamente sulla

matrice. Questo è una specie di collegamento della cellula con la matrice. Il filmato fa vedere che,

anche aumentando la tensione, queste reti che si formano sono abbastanza plastiche, quindi possono

allargarsi in conformità con contrazione o espansione delle cellule, soprattutto di una cellula che sta

migrando. La fibronectina è una grande proteine che esiste in due forme: cellulare e plasmatica. La

forma cellulare è presente nei tessuti dove si assembla in una matrice fibrillare; la forma plasmatica è

prodotta dagli epatociti e secreta nel sangue dove rimane in forma solubile e non fibrillare, oppure

quando penetra nei tessuti è incorporata nella ECM.

Per capire come è possibile tramite legame del ligando attivare il citoscheletro, conviene fare

attenzione ai processi di attivazione, processi dove viene indotto un cambiamento di conformazione

e una proteina chiamata talina

che contribuirà ad allontanare le due gambe delle subunità α β;

svolgerà un ruolo importante e questo permetterà alla coda della tramite proteine intermedie, di

β,

prendere collegamento con il citoscheletro di actina. 2

Quindi le integrine si legano alla fibronectina, che è secreta come struttura compatta globulare in cui i

siti di legame per altre molecole di fifronectina sono sepolti all’interno della proteina. Il legame è

seguito dall’attivazione dl segnalamento mediato da integrine, portando al reclutamento di proteine

citoplasmatiche per formare complessi di adesione focale. Diverse componenti delle adesioni focali

sono proteine che legano e modulano l’actina permettendo il reclutamento e la riorganizzazione del

citoscheletro di actina verso questi siti.

Attivazione integrine: Ci sono diversi tentativi, anche con cristallografia a raggi X , di studiare le

integrine sulle cellule, la loro organizzazione nello spazio e l’affinità o meno verso un ligando. Vari

studi di cinetica descrivono uno stato “inattivo” in cui l’affinità aumenta ed uno stato “attivo” in cui il

ligando è collegato. C’è una conformazione di ripiegamento che inattiva totalmente, uno stimolo che

inizia a distendere l’integrina e fa emergere la zona di legame con l’eventuale ligando ed uno degli

stimoli che farà allontanare le varie code (e questa è la situazione in cui l’integrina si trova con due

collegamenti). Una figura dell’Alberts (nuova edizione), mette in evidenza la presenza di proteine che

necessitano di formare dimeri incrociati che permetteranno il collegamento con le code beta e

contribuiscono anche a formare aggregati di integrine sulla membrana che possono anche essere

integrine diverse ma la coda delle integrine è simile e quindi la stessa proteina può essere legata o da

integrine simili o da altre che riconoscono sequenza diversa. Spesso l’attivazione delle integrine può

richiamare vicino alla zona di collegamento con le integrine, dei recettori accoppiati a proteine G o

recettori ad attività tirosi-chinasica, per cui questo può contribuire

alla formazione di complessi per la trasduzione di segnale, per cui

molte di queste chinasi sono chiamate chinasi dell’adesione focale e

sono quelle che fanno partire diversi segnali.

Le alterazioni strutturali da una parte della cellula sono accoppiate

ad alterazioni strutturali dall’altra, cosicchè le influenze possono

essere trasmesse in qualsiasi direzione attraverso la membrana

cellulare. Le pinze per il legname che i boscaioli usano per afferrare i

ceppi, sono usate dall’Alberts per analogia. Quando si prendono le

maniglie, le pinze afferrano il ceppo; se si chiudono le pinze sul

ceppo, le maniglie si avviccinano. Inoltre, quanto maggiore é la

tensione sulle lingue laterali, tanto più forte è la presa ad entrambe

le estremità. In una molecola di integrina, i dettagli del legame sono differenti, ma i principi meccanici

sono simili: i cambiamenti conformazionali nelle estremità opposte della molecola sono accoppiati, e

avvicinando le maniglie si ha una presa più forte. La tensione comunicata al citoscheletro di actina,

dipende dalla tensione che si stabilisce fuori la cellula con le integrine.

Le integrine presentano tre stati principali: inattivo (bassa affinità), attivo (alta affinità) e occupato dal

ligando. Nel modello detto «switchblade» (cambia lame) un’integrina inattiva è ripiegata su se stessa

e la tasca di legame con il ligando rimane sotterrata. Le integrine sono attive quando dritte, posizione

in cui espongono interamente la tasca di legame con il ligando. 3

Quando sono inattive, le integrine si legano ai ligandi con bassa affinità. Questa interazione a bassa

affinità stimola segnali intracellulari che attivano la proteina del citoscheletro talina, che si lega alla

coda citoplasmatica della subunità β. Questo legame rompe l’associazione inibitoria fra le catene α e

β, permettendo che le regioni citoplasmatiche e transmembrana delle due catene si separino e porta

alla condizione in cui il dominio extracellulare cambi da una conformazione ripiegata ad una forma

distesa che permette un legame ad alta affinità con il ligando. Nonostante le integrine si leghino ai

loro ligandi con alta affinità in seguito all’attivazione «inside-out», il legame stabile richiede che i loro

domini citoplasmatici siano ancorati al citoscheletro. Il legame integrina-ligando scatena

l’aggregazione delle integrine sulla superficie cellulare e porta al reclutamento di enzimi e di molecole

adattatatrici che formano complessi di adesione che collegano le integrine al citoscheletro.

Talina: In che modo questi cambiamenti nella regione extracellulare dell’integrina si collegano agli

eventi che occorrono all’estremità intracellulare della molecola di integrina? Nella loro conformazione

ripiegata, inattiva, le porzioni intracellulari delle catene α e β rimangono molto vicine e aderiscono

una all’altra. Quando il dominio extracellulare si allarga, questo contatto si rompe e le porzioni

intracellulari (e transmembrana) di queste catene si separano. Come risultato, il sito di legame per la

talina sulla coda della catena β viene esposto. Il legame con la talina porta a sua volta

all’assemblamento di filamenti di actina

ancorati all’estremità intracellulare

dell’integrina. In questo modo, quando una

integrina si aggrappa al suo ligando fuori dalla

cellula, la cellula reagisce collegando il suo

citoscheletro alla molecola di integrina, in

modo tale da potere applicare delle forze a

questo punto di attacco. Ciò viene noto come

attivazione “outside-in”. La catena di causa ed

effetto può anche funzionare in senso opposto,

dall’interno verso l’esterno invece che

dall’esterno verso l’interno (segnalamento

«inside-out»). La talina compete con la catena

α per il suo sito di legame sulla coda della

catena β. Perciò, quando la talina si lega alla catena β, essa disfa il legame α-β, permettendo alle due

gambe della molecola di integrina di scattare e di separarsi. Ciò guida la porzione extracellulare

dell’integrina verso la sua conformazione estesa, attiva. Questa attivazione “inside-out” viene

scatenata da molecole regolatorie intracellulari. Queste includono il fosfoinositide PIP2, che si ritiene

sia in grado di attivare la talina in modo tale che essa si lega in modo forte alla catena β dell’integrina.

In questo modo, un segnale generato all’interno della cellula scatena un processo tramite il quale le

molecole di integrina afferrano e tengono saldamente i loro ligandi extracellulari. Le molecole

intracellulari come il PIP2 sono esse stesse prodotte in risposta a segnali ricevuti dall’esterno della

cellula mediante altri tipi di recettori di superficie, quali i recettori accoppiati a proteine G e i recettori

ad attività tirosina chinasica, che possono quindi controllare

l’attivazione delle integrine. Viceversa, l’attivazione delle

integrine mediante legame alla matrice può influenzare il

ricevimento dei segnali mediati da altre vie di signalling.

L’interazione di tutte queste vie di comunicazione,

trasmettendo i segnali in entrambe le direzioni attraverso la

membrana cellulare, permette che abbiano luogo interazioni

complesse fra le cellula e il ambiente fisico-chimico. 4

Quando una chinasi specifica per il fosfatidilinositolo fosforila la testa (aggiungendo due gruppi

fosfato in risposta a dei segnali), si avvicinano anche diversi recettori che possono modulare

l’attivazione dell’integrina; una interazione dall’interno, provoca un cambiamento di affinità delle

integrine verso la molecola esterna e così lo stesso può avvenire anche fuori. Un ligando multivalente

può essere riconosciuto da diverse integrine e lo schema sottostante mette in evidenza FAK (focal

adhesion kinase), chinasi che si concentrano nei punti di adesione focale, quindi che hanno

collegamento con actina e che fosforileranno proteine provocando formazione di complessi sotto la

membrana.

La talina ha diverse zone che possono essere bersaglio di enzimi proteasi come la calpaina che può

degradarla e modulare la sua capacità di legarsi all’actina o alle integrine. La talina ha diversi siti

riconosciuti da molecole diverse e si legano a strutture

diverse. Legandosi all’actina ne può scatenare la

polimerizzazione e la formazione di filamenti; attraverso altri

siti la talina si lega a proteine che servono a formare fasci più

o meno vicini di actina e quindi il citoscheletro complessivo

in prossimità della membrana verrà organizzato da questa

proteina di collegamento con altre proteine. La talina ha sito

di legame anche con lipidi fosforilati e quindi possiamo

immaginarla con lo stesso ruolo di diverse glicoproteine della

matrice che sono organizzatrici di varie proteine fuori. E’

importante ricordare che la talina è una proteina

MULTIMODULARE che riconosce molecole diverse e possono

essere degradate da proteasi ed il prodotto di degradazione “scompiglia” il complesso che è

organizzato sotto la membrana.

La talina si collega ad una proteina importante della membrana plasmatica delle cellule muscolari

scheletriche che è spesso alterata in distrofie muscolari gravi; il collegamento può essere abnorme e

quando la cellula muscolare si contrae, non è ben collegata funzionalmente alla matrice ed il muscolo

può soffrire perché questo è importante per collegare i processi di contrazione della cellula con la

matrice senza che la cellula si distacchi dalla matrice stessa. La talina è collegata anche con una delle

proteine contrattili che permette contrazione delle fibre di actina sotto la membrana e questo è

importante sia per piccole contrazioni della cellula, sia per contrazioni di una cellula che sta migrando.

Si lega a proteine tirosin-chinasiche, ad un’altra glicoproteina di membrana, all’actina, alla β-integrina

e così via. Quindi è una proteina multifunzionale.

Trasduzione segnali e meccanotrasduzione (integrine): A seconda della cellula e della

matrice su cui poggia la cellula, vengono ingaggiate proteine diverse che possono dare origine a

diverse vie di segnalazione. Le integrine sono le antenne che permettono alla cellula di sentire

l’ambiente in cui sono affinchè la cellula che si adatti a questo ambiente e allo stesso tempo può

permettere all’interno di comunicare con la matrice esterna. Un esempio di questo ruolo fu dato più

di dieci anni fa, era il cambiamento di espressione dell’integrina sulla cellula dell’epitelio mammario

prima della gravidanza, durante la gravidanza e durante l’allattamento. L’ambiente induce l’epitelio a

5

proliferare durante la gravidanza e durante l’allattamento a produrre le proteine del latte. E’ stato

sudiato questo fenomeno in termini di matrice esterna alla cellula che cambia e delle integrine che

comunicano alle cellule in un primo momento di proliferare ed in un secondo momento di attivare i

geni per le proteine del latte.

Nei punti di contatto o di adesione focale (punti circoscritti dove convergono diverse integrine),

questa aggregazione di integrine recluta tramite la talina delle molte molecole di segnalamento oltre

a scatenare la polimerizzazione dell’actina.

Questa adesione può attivare diverse molecole fra cui chinasi delle adesioni focali e molte altre

chinasi e piccole proteine G monomeriche. A seconda del tipo di integrina attivata, la cellula

risponderà o allargandosi sulla matrice o proliferando o se l’adesione viene meno va in apoptosi (in

una cellula normale perché una cellula tumorale non è condizionata dall’adesione) e può anche

attivare certi geni piuttosto che altri.

Vi sono esempi in cui questo processo è studiato con attenzione per individuare i vari punti e cercare

di interferire con anticorpi vari o simili molecole di adesione finte per cambiare l’adesione: la

guarigione delle ferite, la risposta del sistema immunitario, lo sviluppo dell’embrione, la propagazione

delle cellule tumorali. Sono tutti fenomeni che hanno questo processo costante di adesione, segnali

diversi e così via. Nei complessi di adesione focale si concentrano: integrine, protein-chinasi, proteine

di integrazione, diverse proteine G e proteine che legano l’actina. Vengono studiati molto nel campo

dei tumori perché se questa convergenza di proteine varie viene inibita, ne conseguono patologie

diverse dalla formazione di autocorpi contro le molecole

di adesione focale, formazioni di trombi e altro.

C’è una convergenza di segnali fra vie di segnalazione

diverse. Segnali ricevuti dall’esterno della cellula

mediante altri tipi di recettori di superficie, come

recettori accoppiati a proteine G e recettori ad attività

tirosin chinasica, possono alterare la conformazione

della talina e quindi attivare le integrine (figura 19-49

Alberts).

E’ importante anche l’interazione delle integrine con i

fattori di crescita soprattutto nel campo delle cellule

tumorali, dello sviluppo embrionale e delle cellule

staminali perché possono esserci segnalazioni con

ormoni e fattori di crescita che devono essere integrate collegandosi a diverse integrine (cross-talk)

per avere una risposta dalla cellula. Non è mai una sola integrina a rispondere, ma recettori e

integrine varie convergono nella risposta.

Nelle figure è possibile vedere l’actina (che solitamente è evidenziata da una

sostanza chiamata falloidina che è collegata ad un fluorocromo) e mostra le

linee di tensione e gli incroci vari che si formano nelle cellule che si allargano

su un substrato. Marcando anche con colori diveri le chinasi dell’adesione

focale e le integrine, si nota che sono allineati all’actina.

Migrazione dei globuli bianchi: Parlando della selectina, non era stato concluso il discorso

sull’extravasazione dei leucociti. Prima di tutto il sangue è reso più concentrato facendo uscire

plasma. I globuli bianchi, che normalmente viaggiano al centro del capillare, si avvicinano alla

superficie; l’endotelio diventa appiccicoso perché vengono esocitati i prodotti di selectine varie, che

erano immagazzinati sotto la membrana nei corpi di Weibel-palade; questi corpi sono vescicole di

secrezione controllata, che aspettano un segnale costituito da citochine infiammatorie, che arriva in

seguito al danno del connettivo sottostante. Vengono così esocitate dall’endotelio molecole di

6

adesione, soprattutto selectine, che in base al

glicocalice del globulo bianco, cominciano a legare

quest’ultimo (anche se debolmente) inducendo un

processo di rotolamento. I primi ad essere

richiamati sono i granulociti neutrofili che sono

quelli che uccideranno i batteri. I partner di una

successiva adesione più forte, sono le integrine

sulla membrana del leucocita e delle proteine della

superfamiglia delle immunoglobuline sull’endotelio

e anche queste vengono esposte sulla membrana in seguito a risposta a segnali di danno.

Nelle figure è possibile vedere la formazione del coagulo (in seguito ad una danno) basato su piastrine

che inducono poi la formazione di polimerizzazione di fibrina perché aiuta anche alcuni globuli bianchi

a rimanere intrappolati. Poi c’è la necesità che i globuli bianchi escano dall’endotelio. Si possono

vedere le vescicole di accumulo di molecole di adesione necessarie e di prodotti che richiameranno le

piastrine. I corpi di Wabel-palade sono granuli specializzati nell’esocitosi per la riparazione

dell’endotelio e del tessuto sottostante; vi sono tanti mediatori che vengono rilasciati quando questo

corpo circondato da membrana si fonde con la membrana plasmatica: alcuni mediatori solubili

andranno nel sangue e richiameranno le piastrine, altri che sono proteine di membrana, si inseriranno

sulla membrana (in particolare delle selettine che

richiameranno i globuli bianchi).

Bisogna poi che le giunzioni delle cellule

dell’endotelio si allentino per fare uscire i leucociti.

Sono notevoli le modificazioni che avvengono a

livello del citoscheletro del leucocita in questo

momento: la cellula deve cambiare forma, diventa

plastica per inserirsi in una zona molto sottile; poi si

allarga di nuovo e verrà trascinata passivamente dal

sangue e diventerà attiva nel tessuto sotto. C’è

quindi il coinvolgimento di molecole di adesione,

citoscheletro e attivazione di geni.

Per la riparazione del tessuto è necessario poi il

ripristino dello strato epiteliale che è un processo che richiede una transizione epitelio-mesenchimale

notevole: cellule che migrano sopra un tessuto connettivo che è stato riparato e ripristinano l’epitelio

pluristratificato. Questi processi sono studiati nel dettaglio dai patologi.

Il glicocalice viene utilizzato per richiamare la cellula giusta al momento giusto. Sia molecole di

adesione che proteine altamente glicosilate, sono ampiamente rappresentate sulle estroflessioni della

membrana dei globuli bianchi.

Nelle venule normali i leucociti fluiscono senza interazioni adesive con l’endotelio, ma nei vasi

infiammati, vengono espresse sulla superfice delle cellule endoteliali selettine e ligandi per le

integrine. Questo porta all’ancoraggio, rottolamento (“rolling”), e arresto dei leucociti circolanti e la

loro finale estravasione dalla circolazione verso il tessuto circostante. Ad esempio, la P-selettina è

normalmente espressa nei corpi di Weibel-Palade delle cellule endoteliali, ma entro pochi minuti

dopo l’attivazione delle cellule endoteliali mediante trombina, istamina, ipossia o danno, questi corpi

si fondono con la membrana plasmatica, promuovendo l’espressione della P-selettina sulla superficie

della cellula endoteliale. Allo stesso modo, la P-selettina immagazzinata nei granuli α delle piastrine

viene espressa sulla superficie delle piastrine pochi minuti dopo l’attivazione piastrinica. I leucociti si

ancorano e rotolano sulle cellule endoteliali attivate. 7

Quando queste selectine si legano alle proteine altamente glicosilate o glicolipidi sulla membrana,

fanno partire dei segnali che sono integrati a segnali provenienti dalle piastrine, che convergono sul

globulo bianco e permettono a delle integrine che

erano in disarmo sulla membrana del leucocita, di

stendersi e andranno a collegarsi alla membrana

dell’endotelio. I-CAM, proteina della superfamiglia

delle immunoglobuline è il controrecettore delle

integrine. E’ un legame forte che ferma l’integrina. In

un secondo tempo, quando queste sono fortemente

coinvolte nel legame con il globulo bianco, si

apriranno dei varchi fra una cellule endoteliale ed

un’altra ed il globulo bianco passa. La sequenza è: prima granulociti che vanno nel tessuto

danneggiato che nel frattempo è stato invaso da batteri, degranulano (processo di esocitosi con vari

mediatori che uccidono i batteri) e poi muoino sia batteri che granulociti. Per ripulire (batteri e

granulociti morti) vengono chiamati i monociti che nel tessuto si differenziano in macrofagi. I

macrofagi fagocitano le cellule morte, il connettivo degradato (pezzi di collagene e di varie proteine

degradate), produce in un secondo tempo dei segnali per gli “operai” che devono ricostruire il tessuto

connetivo. Prima serve nutrimento e ossigeno, quindi

si formano vasi sanguigni molto sottili nel tessuto di

granulazione. Il tessuto di granulazione è un tessuto

che nelle ferite sanguina molto facilmente perché i

vasi sanguigni sono simili a quelli dell’embrione, cioè

devono portare nutrimento; nel caso della ferita,

portano nutrimento ai fibroblasti che devono

lavorare; sono dei vasi composti solo da endotelio e

qualche pericito, quindi molto delicato. Con questi

vasi temporanei nel tessuto di granulazione, i

fibroblasti cominciano ad avere nutrimento per

ricostruire il connettivo; cominciano a fabbricare

glicosaminoglicani prima e collagene dopo. Si riforma

il connettivo, l’endotelio ricopre la zona della ferita formando prima un solo strato. I vasi temporanei

che si sono formati vengono riassorbiti ed un pò per volta, se la cicatrizzazione è ben fatta, si riforma

l’epitelio (in certi casi si forma una brutta cicatrice perché si vede più connettivo che epitelio).

Affinchè tutto ciò avvenga, devono arrivare i macrofagi, ma se il danno è talmente grande che questa

sequenza di riparazione non può avere luogo, allora si ha un’infiammazione cronica e vengono

richiamati linfociti. Recentemente sono state scoperte delle vie più rapide per i globuli bianchi, delle

“gallerie” nell’endotelio attraverso le quali possono passare ( vedi articolo).

Le selectine, ICAMs, e le integrine mediano l’adesione tra leucociti

e cellulo endoteliali vicino ai siti di infezione 8

Introduzione alla matrice extracellulare

Avendo parlato a lungo delle molecole coinvolte nel collegamento con la matrice extracellulare,

adesso vediamo come questa è fatta, come viene fatta la “manutenzione”, cosa succede quando

vengono frammentate specificamente delle proteine, ma anche l’acido ialuronico (enzimi degradano

grandi molecole formando frammenti di varia lunghezza in modo specifico e non casuale perché

questi frammenti servono nella segnalazione).

Il tessuto connettivo è un tessuto dove la matrice è estremamente importante. Intorno a tutte le

cellule degli organismi pluricellulari, c’è una componente acellulare che serve ad organizzare le cellule

e promuovere il passaggio di molecole e cellule diverse. Queste devono essere organizzate fra loro e

all’occorrenza non devono essere talmente dense da non permettere ad esempio ai globuli bianchi e

fibroblasti di migrare. Questa regione deve essere plastica tranne nell’osso, dove ha il compito di

resistere a stress meccanici e quindi l’ossificazione va a scapito della migrazione delle cellule. La

matrice ha il ruolo di sensibilità, resistenza a trazione, richiamo di liquidi e così via.

Nella matrice extracellulare ci sono grandi molecole, polimeri, che formano delle “funi”, ossia

filamenti intrecciati che daranno resistenza meccanica alla trazione che sono le fibre di collagene; vi

sono diverse proteine adesive come ad esempio la fibronectina (onnipresente); poi vi sono i

proteoglicani (che sembrano avere delle piume) con glicosaminoglicani collegati.

Tutto quello che fanno le cellule, dipende dalla

loro interazione con l’ambiente extracellulare:

metabolismo,proliferazione, differenziamento,

mantenere lo stato di staminalità, morte,

migrazione, ecc. Tutto ciò non dipende dunque

solo dal programma genetico della cellula ma

anche dai segnali che arrivano costantemente

dall’esterno che faranno attivare un gene

piuttosto che un altro. I mediatori sono

soprattutto le integrine. Avere questa rete di

proteine intorno alla cellula, è da ostacolo alla terapia genica, perché diventa difficile poter inserire il

gene giusto. C’è dunque per certe patologie, come l’arterosclerosi, artrite, malattie autoimmuni, la

necessità di trovare delle terapie alternative. Per avere delle scorte di materiale tipo cartilagine, osso,

pelle, ecc. bisogna avere una factory di tessuto, bisogna coltivare bene le cellule nella matrice giusta

per ripristinare il tessuto giusto. Non basta avere solo un giusto mezzo di coltura, la cellula ha bisogno

di una matrice tridimensionale adeguata per poi riprendere a costruire il tessuto corretto. Nelle

colture cellulari quindi il ruolo della matrice è fondamentale.

Il signalling mediato dalla matrice extracellulare, è una musica integrata da vari strumenti: le varie

molecole della matrice, varie proteine sulla membrana, le integrine; occorre un’integrazione ben

armonizzata per avere un buon comportamento delle cellule.

La matrice è una struttura in costante modificazione chimica e strutturale e le proteine che la

costituiscono sono multimodulari e glicosilate.

Funzioni:

-Sostegno meccanico per le cellule e per il tessuto

-Integrazione delle cellule in tessuti

-Influenzamento della forma e il movimento della cellule

-Influenzamento dello sviluppo e il differenziamento delle cellule

-Coordinamento delle funzioni cellulari mediante segnalamento attraverso recettori di adesione (e

recettori associati) 9

-Riserva di molecole di segnalamento extracellulare

-Legame con proteasi della matrice e loro inibitori.

La matrice influenza la cellula e la cellula può cambiare la conformazione della matrice, è un processo

biunivoco.

Nella matrice sono state identificate più di 300 proteine diverse: proteine strutturali, enzimi per la

sintesi e degradazione della matrice, un gran numeo di fattori di crescita. Inoltre le strutture

multimodulari (che hanno un piccolo numero di moduli ripetuto molte volte come il terzo modulo

della fibronectina ad esempio) di molte proteine, permettono interazioni multiple durante

l’evoluzione e lo sviluppo. Moduli ripetuti sono anche di tipo immunoglobulinico, moduli che

corrispondono all’epidermal growth factor, alcune regioni del collagene che sono specifiche delle

estremità, molti moduli di un certo tipo di laminine e trombospondine. Il numero di ripetizione è

diverso, ma sostanzialmente il tipo di modulo è invariato. Era chiamato Matrisoma, questa sorta di

catalogo di tutte le componenti della matrice. Non bisogna dimenticare i polisaccaridi come l’acido

ialuronico.

Nel dialogo fra cellula e matrice possono emergere delle sequenze (prima nascoste) che sono dei

segnali e ciò deriva dalla proteolisi operata da enzimi che tagliano il legame peptidico fra amminoacidi

in un contesto specifico. Metalloproteasi, serinoproteasi, riconoscono amminoacidi con un certo tipo

di conformazione (qualcuno è idrofobico o magari ha sequenze particolari e quindi il taglio viene fatto

in modo altamente specifico). L’azione di questi enzimi può aprire dei varchi molto importanti per la

migrazione, poi può provocare il rilascio di piccoli frammenti che possono essere solubili (quindi

hanno amminoacidi che sono compatibili con l’acqua e possono formare ponti di idrogeno e legami

ionici) , vanno in soluzione e si sciolgono nel liquido interstiziale che nel caso di una ferita, di un

embrione o di un tumore, è un liquido molto abbondante; andando in soluzione si allontanano dalla

zona di partenza. Altra conseguenza del taglio, è che viene alterata la conformazione tridimensionale,

ossia la struttura terziaria della proteina e così alcuni moduli prima nascosti, sono ora visibili alle

cellule; se queste cellule hanno il giusto recettore per riconoscere quei moduli, di solito integrine o

proteoglicani, il riconoscimento innesca una trasduzione di segnali e la cellula altera il proprio

comportamento. Per avere segnali giusti nei momenti giusti, bisogna usare delle strategie che

richiedono acido ialuronico e proteoglicani; questi hanno delle cariche negative che possono

richiamare con legame non covalente alcuni di questi peptidi evitando che vadano in soluzione e

quindi le tengono in microambienti giusti formando nicchie con caratteristiche particolari. Ciò viene

preso in considerazione quando si parla della nicchie delle cellule staminali. Quindi la concentrazione

localizzata dei segnali, dipenderà soprattutto dai proteoglicani ----> Domanda da esame!

A seconda del tipo di tessuto, c’è grande variabilità del numero relativo delle molecole delle varie

classi:

-collagene

-elastina

-acido ialuronico (che è un polimero glicosamminoglicano che non si lega covalentemente a nessuna

proteina ed è l’unico in questo)

-proteoglicani (proteine legate covalentemente ai glicosamminoglicani)

-glicoproteine (proteine legate covalentemente a oligosaccaridi)

E’ importante conoscere la differenza fra proteoglicani e glicoproteine! 10

L’epitelio poggia su una matrice molto

specializzata che è la lamina basale. Nel tessuto

sottostante, soprattutto nel connettivo lasso

dove la matrice è più abbondante, si può trovare

una rete non cellulare complessa, vasi sanguigni,

vasi linfatici, nervi e così via. Questa rete di

proteine è sintetizzata soprattutto da cellule che

sono varie famiglie di fibroblasti, ma anche cellule

epiteliali sintetizzano molecole della matrice. Il fibroblasto stesso orienta le proteine e gli zuccheri che

sintetizza. Anche l'organizzazione del collagene è prevista dai fibroblasti seguendo istruzioni che non

sono ancora conosciute. L’integrità del tessuto connettivo dipende molto da quello che fanno i

fibroblasti.

Meccanica della matrice: La matrice deve reggere stress di tensione e compressione dei vari tessuti;

le cellule devono accompagnare quello che succede sotto: se il connettivo si estende o viene

compresso, la cellula che è collegata tramite molecole di adesione, deve subire cambiamenti che

accompagnano ciò. Emidesmosomi e adesioni focali, permettono di comunicare, anche

meccanicamente, quello che succede fuori con quello che succede dentro.

Le proteasi della matrice, sono enzimi molto pericolosi, che possono degradare le proteine nel

momento sbagliato. Esempi di una proteolisi errata sono: artrite reumatoide ed invasione tumorale.

In altre situazioni, la degradazione può essere piuttosto pronunciata, ma viene tenuta sotto stretto

contollo. Esempi: il trofoblasto che permette formazione della placenta, opera degradazioni nell’utero

della madre che permettono di avvicinare i vasi della madre con quelli del feto. Sono degradazioni

controllate perché gli enzimi degradano solo in certe zone e non in altre; gli enzimi vengono prodotti

solo in certi compartimenti ed essendo pericolosi vengono deposti nella zona di limite della

degradazione e per evitare che vadano oltre, vi sono gli inibitori delle proteasi. Chi studia le proteasi

studia anche i loro inibitori perché l’effeto netto è dato sia dall’attività della proteasi che da quella

degli inibitori; se non c’è equilibrio fra le due attività, si va verso la patologia.

Oltre ai fibroblasti, anche altre cellule lavorano per costruire la matrice. La cartilagine e l’osso sono

fabbricati da cellule specializzate del tessuto connettivo che si chiamano condroblasti e osteoblasti,

però anche le cellule epiteliali contribuiscono a costituire la lamina basale. A quanto pare solo gli

eritrociti non producono proteine della matrice.

Attenzione: la matrice NON è una struttura inerte!

Cenni su componenti della matrice che verranno trattati successivamente in maniera specifica:

-Polisaccaridi: di tipo glicosaminoglicani (GAGs) di solito legati covalentemente a proteine formando

proteoglicani. Vedremo che l’acido ialuronico però lavora per conto suo.

-Proteine fibrose:

strutturali, come collagene ed elastina (con compiti complementari)

1) adesive, come fibronectina e laminina (multimodulari che permettono di organizzare

2)

tridimensionalmente la matrice).

N.B. Adesivo significa che fa da collante fra proteine e zuccheri della matrice e le cellule. 11

BIOLOGIA CELLULARE AVANZATA

Introduzione alla matrice extracellulare

Aspetti particolarmente importanti della matrice e dei vari componenti.

Non si tratta di un’impalcatura inerte.

Negli ultimi anni stanno venendo fuori una marea di informazioni su

aspetti considerati irrilevanti fino a poco tempo fa, in particolare sulla

la f a e tazio e dell’acido

frammentazione delle proteine e ialuronico,

che presentano ancora molti interrogativi perchè queste proteine o il

polimero di GAG può essere frammentato da enzimi specifici in

frammenti di diverse dimensioni e, ciascun frammento, svolge ruoli

particolari mediati da recettori particolari, quindi la frammentazione delle

molecole della membrana è apparsa come una novità non prevedibile.

Negli ultimi anni ci sono molte informazioni su collageni (prossima

lezione) particolari perchè sono proteine transmembrana, non proteine

ell’a ie te ext a ellulare,

che vengono secrete e sta venendo fuori

(vedi seminario sui tipi di collagene particolare) il fatto che alcuni

frammenti di questi collageni nella parte extracellulare possono andare in

soluzione, essere riconosciute da integrine e proteoglicani delle cellule

vicine ed fungere da segnali, fra questi ci sono diverse delle molecole con

attività angiogenetica: queste frammentazioni non sono sempre mirate

ad estrarre proteine che non stanno più funzionando in modo ottimale

ma sono fatte appositamente per dare origine ad altre molecole con

compiti diversi, indipendentemente dal fatto che se la proteina sta

funzionando male chiaramente viene degradata. I frammenti che

go o ilas iati ell’a ie te ext a ellula e posso o a da e i

ve

soluzione, si è notato che ci sono alcune integrine o proteoglicani

transmembrana che li riconoscono [questo è un aspetto da tenere

assoluta e te d’o hio: il pote ziale segnale che è presente lì!]

Un altro aspetto che potrebbe venire fuori da qui ai prossimi anni è che la

frammentazione di alcune proteine extracellulari abbia compiti diversi,

quindi è meglio non stupirsi se la depolimerizzazione possa avere ruoli

all’i te o della ellula.

anche di segnalamento o meno,

l’i po ta za della at i e sul o po ta e to di tutte le

È fondamentale

cellule che poggiano su di essa, molte di queste cellule sono quelle che

dell’acido

hanno contribuito alla formazione delle proteine stesse o

ialuronico, altre si trovano di passaggio o sono influenzate da queste.

Questi sono solo alcuni degli aspetti che verranno influenzati. Quindi

tutto quello che succede in una cellula è mediato dalla matrice.

Non possiamo considerare alcuni componenti più importanti rispetto ad

altri perchè ogni componente svolge un ruolo specifico e complementare

a quello delle altre molecole.

N.B.: ci sono nelle cellule dei recettori che possono individuare delle

sequenze di amminoacidi particolari oppure delle sequenze di zuccheri,

o e el aso dell’a ido ialu o i o e ui di p op io l’i te azio e di

si ha

ogni molecola con le altre e con i recettori sulle cellule

Compiti di tipo meccanico estremamente importanti, come la capacità di

resistere a stress di stiramento oppure la capacità di assecondare alcuni

movimenti di contrazione e trazione, riprendendo la situazione di

partenza, sono fondamentali ad esempio nelle arterie elastiche, nella

’è u ivesti e to di elasti a

pleura, in diverse strutture in cui che

permette alla struttura di dilatarsi e riprendere la sua posizione di

partenza senza strapparsi a causa di questi sforzi, in particolare per quelli

che sono continuati, come ad esempio quello durante la respirazione,

nella pleura e nelle arterie elastiche.

Fibre collagene: rafforzano e aiutano ad organizzare la matrice.

Fibre di elastina: conferiscono resilienza

(capacità di riprendere la forma primitiva dopo deformazione)

Proteine multiadesive: aiutano le cellule ad aderire alla matrice

Inoltre alcune molecole hanno la capacità di organizzare strutture

tridimensionali là dove servono.

La matrice extracellulare è la sostanza fondamentale del tessuto

connettivo perchè permette la

diffusione di nutrienti, metaboliti, cataboliti e ormoni tra

sangue e cellule.

I GAG o i proteoglicani associati (es. acido ialuronico che funge da GAG

non legato covalentemente a proteine, ma solo indirettamente) sono una

componente della sostanza fondamentale del tessuto connettivo, questa

è una struttura altamente idrata, di tipo gelatinoso con una struttura

pervasa da strutture fibrose di tipo collagene che formano una rete di

resistenza meccanica, e questa è fondamentale per non ostacolare il

passaggio di sostanze nutritive per le cellule. Le cellule sono lontane dai

l’ossige o e le sosta ze ut itive

vasi sanguigni, devono uscire dai vasi,

diffondere attraverso la sostanza fondamentale e raggiungere le cellule

per i prodotti di catabolismo e metabolismo. La sostanza fondamentale è

importante per permettere il passaggio di metaboliti tra le cellule e il

sangue o la linfa e non ostacolare la migrazione delle cellule che

provvedono alla manutenzione del tessuto connettivo o alle cellule del

sistema immunitario. Quanto più è ricca di fibre, di collagene in

particolare, a maggior ragione sono poi calcificate, tanto maggiore è

l’osta olo alla diffusione delle sostanze nutritive e al passaggio delle

cellule.

Nell’osso ci sono i canali di Hanvers dove passano i vasi, altrimenti lì non

arriverebbero nutrienti. La cartilagine non ha vasi sanguigni e vive finchè

’è il ovi e to delle a ti olazio i he ha un effetto stantuffo

(comprime-allarga), per cui fuoriescono i liquidi quando comprime e

rientrano quando si allarga. È così che vive la cartilagine, se si rompe un

e l’a ti olazio e è i o ilizzata, la a tilagi e uo e pe hè o

arto

riceve nutrienti. Anche questo è uno degli aspetti non indifferenti: questi

tessuti per permettere il passaggio dei liquidi devono subire processi di

compressione e decompressione.

La maggior parte delle matrici extracellulari, in particolare quelle del

tessuto connettivo, ma tutti i tessuti in generale, hanno in maggiore o

minore proporzione una matrice specifica, la struttura è di fatto un gel.

i po ta te pe studia e l’i fia azio e el

Il liquido interstiziale è

microambiente tumorale, perchè diventa in quel caso estremamente

abbondante e se non viene degradato come si deve dal sistema linfatico

può avere consequenze piuttosto gravi.

Il liquido interstiziale è proprio la parte liquida che permea negli spazi tra

sangue e cellule e serve per mantenere un equilibrio di concentrazione di

sosta ze all’i te o delle ellule, ui di sosta zial e te è u ezzo

acquoso in cui sono in soluzione delle sostanze che poi serviranno alle

cellule per il loro metabolismo, ci sono gas (O2 trasportato dai globuli

el plas a e ’è a he

rossi nel sangue, ma anche in soluzione, un certo

grado di CO2 e N). La solubilità dei gas nei liquindi dipende da

te pe atu a, p essio e.. ui di i og i l di li uido ’è u a e ta

concentrazione di gas che è quella che permette alle cellula di vivere,

alcune hanno bisogno di più ossigeno, altre di meno ecc..

Un altro concetto importante è capire come funzionano le cellule. Questa

è u a ase i po ta te pe l’ingegneria tissutale: trovare matrici

sintetiche o basate su polimeri, collagene ed altre strutture naturali, che

costituiscono la base biomeccanica dei tessuti. La cellula è soggetta a

sollecitazioni di tipo meccanico che sono costanti e di vario tipo (di

compressione, di taglio, quindi parallele alla superficie delle cellule) forze

che contribuiscono a modificare la forma delle cellule. Un insieme di

sollecitazioni meccaniche viene costantemente esercitata sul tessuto

o ettivo e da ui p opagata alle ellule. All’i te o delle ellule ’è u

sistema chiamato tensegrità che è una integrazione di sollecitazione

meccanica sui vari assi, è la capacità di organizzare le strutture portanti

con angolazioni tali che in ogni momento, ogni sollecitazione viene

suddivisa su varie direzioni in modo da diminuire il più possibile

l’ete oge ità delle sollecitazioni meccaniche. Le strutture del

citoscheletro si stanno rivelando proprio come componente che, in modo

integrato, permette alla cellula di suddividere questa tensione meccanica

e dato che il citoscheletro è collegato alla membrana e questa alla

at i e ’è lo stesso tipo di te sio e all’i te o e all’este o della ellula.

Rewiew che parlano di integrazione tra le sollecitazione esterne ed

i te e o u ollega e to all’o ga izzazio e della o ati a e la

membrana interna del nucleo, tramite le proteine transmembrana e

translaminari.

Questi concetti che spiegano come poco alla volta durante lo sviluppo

embrionale si sviluppano tessuti con forme molto diverse, servono nel

a po dell’i geg ie ia tissutale pe sape e o e i posta e la fo azio e

di un derma, di una cartilagine, di un osso a partire da cellula staminale

mesenchimale, perchè la rigidità della matrice condizionerà lo sviluppo di

cellule con caratteristiche diverse.

Haptotaxis: ambito embriologia e disseminazione metastatica. distinto

dalla chemiotassi, è un movimento di cellule esposte a fattori solubili,

tipica delle cellule infiammatorie, le cellule riconoscono i gradienti

molecolari nella matrice e impostano il senso di migrazione in base alla

ole ola pe ui ha o l’i teg i a. Tipicamente la fibronectina è la

molecola che caratterizza le piste che le cellule migranti di solito seguono.

L'aptotassi è la motilità direzionale o crescita

esterna delle cellule, ad esempio nel caso di

crescita assonale, di solito fino ad un gradiente di

siti di adesione cellulare o

dichemioattrattanti legati al substrato. Questi

gradienti sono naturalmente presenti nella matrice

extracellulare (ECM) del corpo durante processi

come l'angiogenesi o artificialmente presenti in

biomateriali in cui vengono

stabiliti gradienti alterando la concentrazione dei

siti di adesione su un substrato polimero.

La lamina basale nella maggior parte dei casi viene associata alla struttura

i po ta te pe l’o ga izzazio e

su cui poggiano gli epiteli, infatti è delle

cellule epiteliali perchè, oltre a indurre il loro destino e comportamento,

ell’epitelio iveste solo u o

ha una struttura che dei domini delle

membrane, mentre in altre cellule come il muscolo, le cellule del sertoli,

la fibra muscolare alla base del cristallino, gli adipociti, in questi tipi

cellulari la lamina basale riveste tutta la cellula. Vedremo parlando del

muscolo quanto siano importanti le diverse membrane basali che ci sono

elle zo e delle giu zio i eu o us ola i, pe hè lì ’è u a pa ticolare

funzione e anche la lamina basale è diversificata ed ha un compito

importantissimo per eventualmente ripristinare un collegamento nervoso

con la fibra muscolare danneggiata.

Si sta tentando con le tecniche di proteomica di fare una specie di

inventario di tutte le proteine che costuiscono la matrice extracellulare:

200 tipi di proteine strutturali diverse più altre ad azione enzimatica, altri

fattori di crescita o piccoli peptidi che vengono legati alla matrice facendo

p oteasi e . U ’enorme

da serbatoi e vari inibitori delle diversità di

proteine fanno parte della matrice.

[Cold Spring Harbor Perspectives in Biology]

Il compito del collagene, soprattutto a livello della matrice è di costruire

funi che resistono a stress meccanici. Quindi la maggior parte di loro

assume una struttura a bastoncello, per fare questo ha bisogno di vari

monomeri che polimerizzano e assumono una struttura ad elica che possa

a otola si o alt e eli he, fo a do delle fu i atto igliate l’u a ispetto

all’alt a, ueste eli he i hiedo o ipetizio e di aa olto pa ticolari: la

tripletta contiene sempre la glicina, il più piccolo di tutti gli aa, il cui

gruppo laterale è un H, ha una struttura compatibile sia con gli aa polari

che apolari e permette alle varie eliche di avvolgersi strettamente perchè

non occupa molto spazio. Gli altri aa che spessissimo fanno parte della

tripletta che si ripete, sono stati nella maggior parte dei casi modificati

post t aduzio al e te edia te id ossilazio e, ’è u aa id ossilato he

si chiama idrossiprolina, è un marcatore tipico dei collageni perchè si

trova esclusivamente qui. Questi gruppi OH saranno fondamentali per

formare ponti di H che rafforzano i legami fra le varie catene. Queste

molecole, che devono resistere a sforzi meccanici molto diversificati a

secondo dei tessuti, sono fatte da miscele di monomeri di famiglie

dive se, ved e o u ’e o e dive sità di ate e atto igliate di va io tipo

per cui possiamo le trovare tutte uguali o tutte diverse o due e uno,

quindi avremo una gran diversità.

è uell’aa i ui il g uppo late ale è ollegato a he al g uppo

La prolina

amminico, quindi forma una una specie di anello che dà rigidità. Nelle

proteine dunque normalmente induce un giro, quindi tutte quelle

proteine di membrana, e le transmembrana soprattutto, nel posto in cui

gira il senso della catena, hanno delle proline perchè è rigido e induce un

cambiamento di orientamento. Molti collageni con una caratteristica

struttura elicoidale sono associati a quelli che formano le fibre a bastoni,

assumono una struttuta con diversi snodi che sono dati da sequenze di aa

che interrompono la periodicità. Quanti più snodi ci sono tra i residui ad

elica, tanto più plastica è la molecola. Il massimo di snodi li troviamo nei

collageni della lamina basale, che invece di formare lacune formano una

rete tridimensionale. La diversità di queste molecole è enorme anche in

termini del fatto che molte di queste possono essere proteine assiali di

base, tipo proteoglicani, a cui poi sono associate diverse catene di GAG.

Quindi entriamo nel campo di proteine che possono essere considerate

collageni perchè hanno caratteristiche strutturali simili alla maggior parte

dei collageni, ma che hanno anche caratteristiche da GAG, quindi

caratteristiche multiple che conferiscono molte potenzialità di ruoli,

quindi multifunzionalità. Anche nel campo dei collageni, non solo nel

campo delle proteine multiadesive, si trova spesso la presenza di alcuni

domini che possono essere ripetuti anche diverse volte. Alle estremità

carbossiamminoterminale di solito ci sono dei domini globulari che sono

in grado di riconoscere altre molecole, quindi vengono spesso descritti i

domini carbossiamminoterminale per le loro funzioni, ci sono proteine

multidominio e multifunzionali. Vedremo per esempio i collageni di tipo

fibrillare e i collageni associati a fibrille, con delle caratteristiche di

complementarietà. Andando poi nella famiglia delle molecole che

mantengono la matrice idratata è bene ricordare che esiste una gran

variabilità di GAG, catene polisaccaridiche non ramificate, composte da

unità ripetute di disaccaridi, di cui uno è sempre un di amminozucchero

(N-acetilglucosammina o N-acetilgalattosammina) e l’altro un acido

uronico (glucuronico o iduronico), il tipo di legame tra uno zucchero e

l’alt o di solito è t a il C1 di u o zu he o e il C o C dell’alt o zu he o.

La possibilità di stabilire legami con diversi gruppi OH degli zuccheri

aumenta molto la variabilità e il tipo di legame può introdurre torsione,

pe hè se i g uppi OH so o dallo stesso lato dell’a ello o ’è to sio e,

se i gruppi OH sono uno sopra e uno sotto lo zucchero si capovolge,

quindi le caratteristiche meccaniche sono totalmente diverse. Inoltre i

gruppi solfato o carbossilici sulla maggior parte degli zuccheri

conferiscono ai GAG una carica altamente negativa; la variabilità è dovuta

anche alla presenza di cariche (-) perchè avremo un grado di solfatazione

dive so sia ell’a i ozu he o he ell’a ido.

Il cheratan solfato è un GAG particolare che ha un galattosio al posto

dell’acido uronico.

’è

Quindi una gran variabilità data dal numero di ripetizione di questi

dimeri, dal grado di solfatazione, tipo di amminozucchero, tipo di acido

ato di

derivato dal glucosio. Non si conosce ancora in che modo nell’appa

Golgi vengono riconosciuti quali degli aa della proteina riceveranno le

catene di GAG, quali sono le sequenze consensus di aa a monte e a valle

alle gli osidasi dell’appa ato del Golgi, ispetto ad

che indicano una certa

U ’alt

serina o asparagina dove bisogna inserire un GAG. a incognita è

quante catene di GAG devono venire associate a questi proteoglicani,

perchè alcuni, come la cartilagine, hanno decine o centinaia di GAG altri

ne hanno 8.

Ci sono patologie associate alla formazione sbagliata di questi composti o

alla capacità di degradarli una volta che non sono più efficaci, quindi è

importante capire il perchè di queste diversità, anche perchè queste

cariche negative hanno dei compiti che non sono solo di richiamare acqua

uello asta l’a ido ialu o i o o igliaia e igliaia di g uppi

(pe

carbossilici, non è solfatato ma ha molte migliaia di ripetizioni che

+

bastano per chiamare Na che chiama a sua volta H2O), questa diversità

di cariche ha il compito di attrarre diverse molecole con cariche

complementari e quindi il tipo di ioni o di peptidi, quasi sicuramente con

ruolo di segnalamento, che vengono richiamati sono diversi. Questo

contribuisce al microambiente di un tessuto normale o di un tessuto

alte ato, o dei se atoi di seg ali dive sifi ati da u a ellula all’alt a.

Ca tilagi e: aso più o plesso i ui ’è u ’aggragazione

ole ola e he vede l’a ido ialu o i o o e pu to di ollega e to

multi

non covalente tramite proteine aggiuntive che collegano dei proteoglicani

all’a ido ialu o i o i st uttu e t idi e sionali che occupano uno spazio

otevole. Il o pito di ueste st uttu e ella o p essio e è l’effetto

stantuffo, fondamentale per la sopravvivenza della cartilagine.

Quindi la carica (–) molto elevata permetterà innanzitutto alle molecole

non di attorcigliarsi su se stesse perchè tutte quelle cariche (–) si

ui di sta o il più lo ta o possi ile l’u o

respingono tra di loro,

dall’alt a, i uesto aso si allargano, poi attraggono cationi diversi che

+ + +

possono essere Ca Na K quindi questi sono come riserve di cariche

elettriche diverse con campi elettrici diversi. Questo compito di

lubrificazione è molto importante perchè strutture che sono sottoposte

ad attrito costante e quelle che sono altamente solfatate hanno la

capacità di legare molti fattori di crescita. Anche questo è un prospetto

interessante per vedere come evolve la ricerca nel campo dei GAG e dei

proteoglicani.

È importante considerare inoltre il tipo di proteina assiale collegata al

GAG, molte di queste proteine hanno ripetizioni di leucina. I domini ricchi

di leucina formano una struttura tridimensionale particolare, altri invece

hanno zone di collegamento con acido ialuronico e sono quelli

soprattutto presenti nella cartilagine, altre di queste proteine hanno

anche la capacità di riconoscere degli zuccheri, le possiamo vedere come

lectine e sono proteine assiali di proteoglicani. Fra di loro si trovano

anche proteine multiadesive perchè hanno dei domni in grado di

collegarsi ad altri collageni o altri fattori di crescita quindi

tridimensionalmente sono anche questi dei collanti.

Alcuni proteoglicani sono bimodulari.

Le proteine multiadesive sono glicoproteine ma hanno nei diversi aa delle

sequenze di oligosaccaridi ramificati, conviene ricordarli perchè questi

zuccheri, aggiunti nel golgi, sono dei marcatori che indicano proteine che

ell’a ie te ext a ellula e e

devono lavorare hanno delle strutture che

sono confacenti al loro compito: es. Laminina

una proteina che forma una specie di croce con tre catene che possono

essere proteine con caratteristiche diverse quindi, in lamine basali di

diversi tessuti, avremo laminine con caratteristiche diverse, ciascuna


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38.58 MB

AUTORE

dynasty

PUBBLICATO

8 mesi fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biologia sperimentale ed applicata
SSD:
Università: Pavia - Unipv
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher dynasty di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia cellulare avanzato e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Pavia - Unipv o del prof Zuccotti Maurizio.

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