Riassunto esame Biologia applicata, prof. Ceccarelli

Ricerca sulle proteine G

Proteine G, tumori correlati e strategie antitumorali in via di sviluppo

Comprendendo numerose classi di proteine implicate in processi intracellulari tanto vari quanto essenziali per la sopravvivenza della cellula stessa, le alterazioni a carico delle proteine G si risolvono in effetti spesso devastanti, come la comparsa di tumori. La nostra ricerca si è focalizzata proprio sulle diverse vie che possono condurre all’insorgere di un tumore a seconda della classe di proteine G che vanno incontro a mutazione, oltre che sulle strategie attualmente applicate o in corso di sviluppo atte a contrastare tale malattia.

Considerata l’importanza di questa classe di proteine, non stupisce il fatto che nel 2012 il premio Nobel per la Medicina è stato assegnato a due scienziati statunitensi, Robert Lefkowitz e Brian Kobilka, che si sono dedicati a questo campo di ricerca.

Proteine Ras

Introduzione

Ras è il nome dato a una famiglia di proteine correlate, trovate all'interno delle cellule, comprese quelle umane. L'origine del nome Ras è l'abbreviazione di Rat sarcoma, sarcoma del ratto, che riflette il modo in cui sono stati scoperti i primi membri della famiglia proteica. Il nome ras è anche usato per riferirsi alla famiglia di geni che codificano per queste proteine. Tutti i membri della famiglia delle proteine Ras appartengono ad una classe di proteine chiamate piccole GTPasi (small GTPase), e sono coinvolte nella trasmissione di segnali all’interno delle cellule (trasduzione del segnale cellulare).

Ras è il membro prototipo della superfamiglia delle proteine Ras, che sono tutte correlate alla loro struttura tridimensionale, e regolano diversi comportamenti cellulari. Quando Ras è "attivato" da segnali in arrivo, esso si trasferisce successivamente su altre proteine che, in ultima analisi, attivano i geni coinvolti in crescita cellulare, differenziazione e sopravvivenza. Come risultato, le mutazioni nei geni Ras possono portare alla produzione di proteine Ras permanentemente attive. Ciò può causare segnalazioni indesiderate e iperattive all'interno della cellula, anche in assenza di segnali in ingresso.

Poiché questi segnali conducono a crescita e divisione cellulare, un segnale Ras iperattivo in ultima analisi può portare al cancro. L'oncogene Ras è il più comune nei tumori umani. Mutazioni che attivano in modo permanente Ras si riscontrano nel 20-25% di tutti i tumori umani e fino al 90% in alcuni tipi di tumore, ad esempio pancreatici.

I tre geni umani ras codificano proteine molto simili costituite da catene di 188-189 amminoacidi, designate H-Ras, N-Ras e K-Ras4A e K-Ras4B (le due K-Ras proteine derivanti da splicing alternativo).

Una delle proteine Ras è una switch protein di circa 189 amminoacidi con attività GTPasica. Ras dà il nome alla principale e meglio caratterizzata via iniziata dai recettori tirosin-chinasici che segue con una cascata di protein-chinasi, ed in specifico nel ciclo di proliferazione e differenziazione cellulare. Nella sua struttura è stato riconosciuto anche un dominio RNA contenente quelle che sembrerebbero sequenze Alu (un tipo di sequenza SINE).

Ras è una proteina G monomerica formata da α-eliche e β-sheets unite tra loro tramite loops. Dotata di due regioni switch-1 e switch-2 che cambiano la loro conformazione a seconda se siano legate a GDP o GTP, si alterna tra uno stato "acceso" in cui è legata al GTP, e uno "spento" in cui è legata a GDP.

La via inizia con il legame di un ligando a un recettore tirosin-chinasico (RTK) posto sulla membrana plasmatica. Questo recettore viene attivato solo se dimerizza con un altro RTK, allora i due recettori si fosforileranno a vicenda attivandosi. Il recettore così attivato si lega al dominio SH2 della proteina adattatrice Grb2, che svolge il suo ruolo senza essere fosforilata. Infatti, il suo dominio SH3 si lega alla proteina SOS attivandola, senza che ci siano reazioni di fosforilazione.

SOS è quindi portato nelle vicinanze della membrana plasmatica dove può legarsi a Ras sostituendo il GDP con il GTP e portarla quindi nel suo stato attivato. SOS perciò funziona da fattore di scambio nucleotidico (GEF). Il modo in cui il complesso Ras-GTP riesce ad attivare la tappa successiva della via è in gran parte noto. È risaputo che Ras attivata si lega all'N-terminale di una proteina Ser/Thr chinasi chiamata c-Raf, attivandola.

Esistono tre isoforme della proteina Raf, o Raf-chinasi. La prima, c-Raf è espressa in tutti i tipi di tessuto, l'isoforma Raf-A è espressa in certi organi interni (come il rene), mentre B-Raf è molto alto nel sistema nervoso e nelle cellule del midollo osseo. Ras può legare tutte e tre le forme di Raf, con affinità diversa. Raf fosforila due residui di serina delle protein chinasi MEK1 e MEK2, chinasi con specificità doppia, capace cioè di fosforilare sia residui di serina che residui di tirosina. Infine, MEK fosforila un'altra serina/treonina chinasi, le MAP chinasi (ERK-1 ed ERK-2), attivandole e la cui azione può mediare numerose risposte cellulari.

L'attivazione di Ras, così come quella di tutte le altre proteine facenti parte della superfamiglia delle GTPasi, è accelerata dal fattore di scambio dei nucleotidi guaninici (GEF), il quale si lega a Ras permettendo il distacco del GDP. Poiché la concentrazione cellulare di GTP è nettamente superiore a quella del GDP, il GTP si lega liberamente alle proteine Ras lasciate "vuote" permettendo il rilascio di GEF.

La sua disattivazione è invece regolata dalla proteina GAP che ha attività GTPasica. In assenza di GAP il complesso Ras-GTP ha un'emivita di 1-5h; in presenza di RasGAP questa non supera i 5 min.

Mutazioni di NRAS, HRAS e KRAS e strategie antitumorali in via di sviluppo

Mutazioni nei tre membri di questa famiglia, NRAS (neuroblastoma-RAS), HRAS (Harvey-RAS) e KRAS (Kirsten-RAS), sono riscontrabili in circa un terzo di tutti i tumori umani. L’NRAS è stato uno dei primi oncogeni scoperti nel melanoma cutaneo, che risulta mutante nel 20% dei tumori, causando alterazioni a valle di numerose vie. Tuttora, nonostante sia un obiettivo terapeutico molto rilevante, ancora non si è riusciti a creare molecole con lo scopo di inibire queste proteine.

Sebbene NRAS, KRAS e HRAS condividano diverse caratteristiche funzionali e strutturali, recenti scoperti suggeriscono differenti localizzazioni subcellulari. Si pensa che ciò determini le varie funzioni delle proteine RAS, ma potrebbe anche spiegare la predominanza di certe mutazioni a favore di alcune proteine di questa famiglia piuttosto che in altre. Se le mutazioni del KRAS sono frequenti nei cancri al polmone, pancreas e al colon, ad esempio, quelle a carico delle NRAS si riscontrano maggiormente nel melanoma.

Finora le diverse strategie applicate per inibire direttamente le proteine Ras non si sono tradotte in terapie efficaci. Uno di questi approcci si basa sull’inibire l’associazione di RAS con GTP. Considerata però l’affinità intercorrente tra i due, risulta praticamente impossibile sviluppare specifici GTP antagonisti. Un secondo approccio si basa invece sulla sospensione dell’attività enzimatica delle RAS mutate attraverso l’utilizzo di molecole GAP-simili che intensificano l’associazione di RAS con GAP e al tempo stesso promuovono la scissione del GTP.

Un’ulteriore tecnica utilizza il silenziamento che previene la traduzione in proteine dell’mRNA. Essa può concretizzarsi attraverso due diverse metodologie: l’utilizzo di ODNs (oligodesossiribonucleotidi, oligonucleotidi sviluppati per applicazioni cliniche in numerose malattie) oppure di molecole che interferiscono con l’RNA, dette RNAi. ISIS2503, un ODN contro l’H-Ras, produce soppressioni selettive di H-Ras mRNA nelle cellule, oltre a mostrare attività tumorale nel carcinoma pancreatico. La più recente tecnologia RNAi mostra il vantaggio di una maggiore specificità contro sequenze bersaglio, abilitando il silenziamento selettivo di Ras oncogenici anche con un solo punto di mutazione. Molti gruppi hanno riportato che la selettiva riduzione di K-Ras o H-Ras mutati attraverso l’interferenza con i processi di traslazione dell’RNA induce una crescita significativa nell’inibizione in linee cellulari nei cancri pancreatico, polmonare, colorettale in modelli animali.

Sebbene la tecnologia RNAi non abbia compiuto progressi nel combattere i tumori umani, sembra che le potenzialità cliniche risultino maggiori di quelle offerte dagli ODNs, basati sulla prevedibile efficacia in vivo con K-Ras come obiettivo.

Un approccio alternativo consiste nella prevenzione delle proteine Ras appena tradotte dall’essere attivate, inibendo le modificazioni post-traduzionali necessarie per traslocare le proteine Ras nella membrana plasmatica, utilizzando FTIs. Studi preclinici hanno dimostrato le potenzialità di FTIs, mostrandosi efficace contro i substrati di H-Ras e K-Ras, oltre che l’inibizione in vitro e in vivo in diversi modelli di linee cellulari cancerogene. In molti casi però, sia in vivo che in vitro, tale fattore ha colpito anche cellule che non presentavano alcuna mutazione nelle proteine Ras.

Non essendo dunque sortito, da tali approcci, alcun successo concreto, l’obiettivo centrale della ricerca si è spostato dapprima sull’inibizione indiretta delle RAS, per poi concentrarsi sull’interferire con la complessa rete di vie attivate a valle come la MAPK (protein chinasi attivata da mitogeno), il PI3K (fosfoinositolo3-chinasi), e il PLC (fosfolipide C) e altri ancora. Sebbene un recente studio condotto con la MEK162, un potente inibitore della MEK, ha mostrato qualche attività in pazienti con melanoma nel quale l’NRAS è mutato, la resistenza tumorale innata o acquisita a singoli agenti è inevitabile.

Tuttavia ci sono ragionevoli speranze che il concetto di inibizione combinata di selezionate vie possa condurre a risultati effettivi. Il gruppo di ricerca di Christian Posch e Susanna Ortis Urda ha dimostrato recentemente l’importanza dei meccanismi di segnalazione MAPK e PI3K/AKT/mTOR in dieci linee cellulari di melanoma con NRAS mutato. Questa seconda via comincia in presenza di un opportuno ligando (in genere un fattore di crescita necessario per l'utilizzo dei nutrienti) che attiva un recettore tirosin-chinasico, avviene l’attivazione, tramite fosforilazione, della fosfoinositide3-chinasi (PI3K). Questa incomincia a fosforilare vari substrati.