Bioinformatica - 2 modulo Appunti

Appunti di Marco Morosetti Appunti di Marco Morosetti Appunti di Marco Morosetti

Introduzione Bioinformatica Proteine

Le proteine sono molecole biologiche che svolgono una serie

interminabili di funzioni all’interno della cellula ( regolazione genica,

metabolismo, segnalazione, accrescimento e struttura della cellula ).

Nella bioinformatica della proteine è si importantissimo conoscere la

sequenza amminoacidica della proteina, ma è importante aggiungere

agli elementi della bioinformatica anche le strutture delle

macromolecole, e quindi delle proteine stesse. La struttura della

proteine è un indice fondamentale della funzione delle proteine stesse: il

66% delle proteine con una struttura simile possiedono una funzione

simile, mentre l’evoluzione ha plasmato anche funzioni simili con

strutture di erenti in quanto la combinazioni di strutture possono far si

che la proteina abbia la possibilità di fare una stessa funzione.

Purtroppo a livello laboratoristico è ancora di cile poter replicare una

singola proteina presente in migliaia e migliaia di copie come nel caso

della PCR. È importante ricordare come tutte le informazioni che

possiamo estrapolare, anche attraverso l’utilizzo della bioinformatica,

sono importantissime per la predizione e la strutturazione delle proteine

ES la mioglobina e l’emoglobina sembrano proteina totalmente diverse,

in realtà sono fatte della stessa struttura e possiedono anche una

funzione correlata. Si parte dalla sequenza primaria, si continua con la

struttura delle proteine e si arriva alla costruzione della proteomica.

Nell’ultimi anni la struttura proteica è stata molto studiata ed analizzata,

sia per varie applicazione successive alla conoscenza, sia per

miglioramenti delle tecniche di analisi. Si parla di crescita esponenziale !

Tutto questo è possibile vederlo all’interno del database principale delle

strutture proteiche -> PDB, Protein Data Bank. Seppur c’è stata

l’aumento della conoscenza delle strutture proteiche, essa non è

paragonabile al numero di sequenze proteiche conosciute o scoperte

negli stessi anni ( 6’000’000 contro 50’000, tra le quali sono molto

ridondanti ). Questo può essere dovuto alla di coltà che si possono

incontrare nello studio della struttura ( cristallogra a a raggi X, tecniche

NMR, spettroscopia elettronica o di massa ). Una via alternativa, ma al

tempo stesso valida, si basa sulla comparazione di sistemi biologici: noi

studiamo tratti di strutture e le colleghiamo

a speci ci amminoacidi, a questo punto

pensiamo di strutturare AA simili nella

stessa maniera; oppure riusciamo a

comparare proteine con uno stesso pro lo

AAco a nché abbiano una stessa funzione

( o quanto meno simile ) ed è qui che entra

in gioco la bioinformatica !

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ffi ff fi ffi ffi fi

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Proteine

Amminoacidi

Gli amminoacidi sono molecole monometriche delle proteine che

possono unirsi tra loro per formare un peptide, attraverso legami

covalenti chiamati legami peptidici. Essi sono composti da un

carbonio centrale chiamato, carbonio-alfa,

unito a 4 gruppi caratteristici : un gruppo

amminico, un gruppo carbossilico, un

idrogeno non polare e un gruppo, chiamato

R, speci co per ogni amminoacido che lo

caratterizza e lo diversi ca.

Il carbonio Alfa è ibridizzato SP e la forma

3

geometrica teorica è tetraedica. Esso è un centro chiare della

molecola, poiché è legato a 4 gruppi funzionali di erenti

( esclusione la glicina ). Per questa ragione esistono 2 tipologie di

stereoisomeri degli amminoacidi : stereoisomero D e stereoisomero

L. Il sistema D e L degli stereoisomerie indica in modo assoluto la

disposizione dei gruppi funzionali intorno all’atomo di carbonio,

senza considerare la possibilità del centro chiare di essere

otticamente attiva, e quindi destrogira o levrogira ( questo anche

perché non tutte le molecole sono otticamente attive anche se

possiedono un centro chirale ). Questo sistema paragona la

struttura della gliceraldeide a quella dell’amminoacido e posiziona il

gruppo carbossilico dell’amminoacido e il gruppo aldeidico della

gliceraladeide in alto. In questa maniera, nell’amminoacido,

troviamo in posizione opposta il gruppo R e laterale gli altri 2.

Importante disposizione è che sia il gruppo carbossilico che il

gruppo R si devo localizzare dietro al piano frontale del carbonio

Alfa. In base quindi alla disposizione del gruppo amminico si

distinguono i due stereoisomeri : se si trova a sinistra è lo

stereoisomero L ( se fosse otticamente

attivo sarebbe destrogiro ) ; se si trova a

destra è lo stereoisomero D ( se fosse

otticamente attivo sarebbe levogiro ).

Nelle cellule eucariotiche, si ritrova e

viene sintetizzato esclusivamente lo

stereoisomero L. La stereoisomeria è

molto importante per l’azione catalitica

degli enzimi, i quali sono stereospeci ci.

fi fi fi ff

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Classi cazione degli amminoacidi

Gli amminoacidi in natura sono circa 20 e sono distinguibili in base

al loro gruppo R. Nell’uomo questi 20 amminoacidi sono suddivisi

in amminoacidi non-essenziali, ovvero amminoacidi che possono

essere sintetizzati dalle cellule umane; e amminoacidi essenziali,

ovvero amminoacidi che devono essere introdotti con la dieta,

poiché non sintetizzabili. In base alle caratteristiche chimico-

siche, ma anche strutturali e funzionali, gli amminoacidi sono

classi cabili in 5 gruppi :

- Amminoacidi non polari = amminoacidi con gruppi R non polari e

quindi idrofobici, con possibilità di creare interazioni idrofobiche.

L’idrofobicità dell’amminoacido è direttamente proporzionale alla

lunghezza della catena R

idrofobica. Questo gruppo è

composto da 7 amminoacidi

( ordinati per ordine

crescente di grandezza del

gruppo R ) :

- Glicina : amminoacido

• più semplice di tutti,

non chirale e non crea

legami idrofobici.

Alanina : amminoacido

• che crea interazioni

idrofobiche all’interno delle proteine.

Prolina : amminoacido in cui il gruppo R si lega in una

• struttura ciclica con il gruppo amminico diventando un

imminoacido. Essa mantiene una conformazione rigida delle

proteine.

Valina : amminoacido che crea interazioni idrofobiche

• all’interno delle proteine.

Leucina : amminoacido che crea interazioni idrofobiche

• all’interno delle proteine.

Isoleucina : amminoacido che crea interazioni idrofobiche

• all’interno delle proteine.

Metionina : amminoacido che contiene un atomo di zolfo nel

• suo gruppo R, formando un legame tioetere.

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- Amminoacidi polari, ma non carichi = amminoacidi con gruppi R

polari e quindi idro li, con possibilità di creare legami idrogeno.

Essi non hanno una carica espressa. Questo gruppo è composto

da 5 amminoacidi ( ordinati per

ordine crescente di grandezza del

gruppo R ) :

Serina : amminoacido con polarità

• dovuta al gruppo ossidrile.

Treonina : amminoacido con

• polarità dovuta al gruppo ossidrile.

Cisteina : amminoacido con

•

polarità dovuta al gruppo sol drico.

Essa in molte occasioni è

responsabile delle reazioni di

ossidoriduzione insieme ad un’altra

cisteina. Con la loro ossidazione si

forma un ponte disulfuro e un dimero chiamato cistina. Con

la riduzione della cistina si crea due molecole di cisteina. La

cistina, quando creata, è molto idrofobica e permette la

stabilizzazione della porteina.

Asparagina : amminoacido con polarità dovuta al gruppo

• ammidico.

Glutammina : amminoacido con polarità dovuta al gruppo

• ammidico.

- Amminoacidi carichi negativamente ( acidi ) = amminoacidi con

gruppi R con una carica negativa a Ph siologico, risultando

molto reattivi. Questo gruppo è composto da 2 amminoacidi

( ordinati per ordine crescente di grandezza del gruppo R ) :

Aspartato : amminoacido con la stessa struttura

• dell'asparagina, ma con un gruppo carbossilico invece che

un gruppo ammidico. La carica negativa si localizza

nell’ossigeno con un solo legame.

Glutammato : amminoacido con la stessa struttura della

• glutammina, ma con un gruppo carbossilico invece che un

gruppo ammidico. La carica negativa si localizza

nell’ossigeno con un solo legame.

- Amminoacidi carichi positivamente ( basici ) = amminoacidi con

gruppi R con una carica positiva a Ph siologico, risultando molto

fi fi fi fi

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reattivi. Questo gruppo è composto da 3 amminoacidi ( ordinati

per ordine crescente di grandezza del gruppo R ) :

Lisina : amminoacido con gruppo R contenente un gruppo

• amminico aggiuntivo, che dona la carica positiva.

Arginina : amminoacido con gruppo R contenente un

• gruppo guanidico ( vedi foto ) che dona la carica positiva.

Istidina : amminoacido con gruppo R contenente un gruppo

• imidazolico aromatico ( vedi foto ) che dona la carica

positiva. Questo amminoacido è l’unico che può essere

ionizzato o no a Ph siologico, risultando utile in molti

situazioni.

- Amminoacidi aromatici = amminoacidi con gruppi R contenenti

un composto aromatico. Essi risultano come amminoacidi

idrofobi e hanno una disposizione in 3D particolare che in uenza

la struttura generale delle proteine. Inoltre gli amminoacidi

aromatici riescono ad assorbire la luce, nello speci co nella

regione ultravioletta, che restituiscono con frequenza maggiore

( cromosomi e uorofori ). Questo principio viene utilizzato per

l’identi cazione delle proteine nel caso di una scena del crimine o

dell’impronta digitale. Questo gruppo è composto da 3

amminoacidi ( ordinati per ordine crescente di grandezza del

gruppo R ) :

Feninalanina : amminoacido che interviene nelle interazioni

• idrofobiche.

Tironina : amminoacido che oltre alle interazioni idrofobiche

• possono creare dei legami idrogeno grazie all’ossidrile unito

al composto aromatico. Questa particolarità crea anche una

leggera polarità dell’amminoacido.

Triptofano : amminoacido formato da 2

• eterocicli nel gruppo R, nei quali è

contenuto anche un atomo di N. Questa

caratteristica rende l’amminoacido

leggermente polare.

Amminoacidi acidi e basi

Gli amminoacidi quando sono immessi

nel mezzo acquoso si ionizzano,

formando una forma di ione bipolare chiamata forma Zwiterione.

fi fl fi fi fl

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Questo ione bipolare può comportarsi sia come acido che come

base in riferimento ai gruppi carichi :

NH si comporta come acido = NH —> NH + H

+ 3+ +

3 2

COO si comporta come base = COO —> COOH + OH

- - -

Queste reazioni sono interconnesse tra loro, poiché sia il gruppo

amminico che il gruppo carbossilico si trovano nella stessa

molecola ( amminoacido ). Vedendo in una unica sequenza e

focalizzandoci sul passaggio dall’acido alla base coniugata

possiamo avere una valutazione generale sul comportamento

dell’amminoacido, formando una titolazione.

Prendiamo in esame un amminoacido che non presenta un gruppo

R carico: si parte dalla forma più protonata dell’amminoacido e si

titola con NaOH. Nella titolazione avremo 2 fasi, una per ogni

gruppo da ionizzare, con due punti di esso ( punti in cui la

concentrazione dell’acido è uguale alla concentrazione della base

coniugata, con Ph uguale al PKa ). Prima avviene la ionizzazione

dell’acido carbossilico, e poi quella del gruppo amminico. Le

cariche delle forme dell’amminoacido, in questa maniera, passano

da una carica positiva, ad una carica nulla e ad una carica

negativa. La titolazione degli amminoacidi ci aiuta a conoscere e

capire la carica dell’amminoacido e la sua forma ionica in relazione

al Ph della soluzione : la forma Zwiterione di un amminoacido,

ovvero la forma con carica netta pari a 0, si trova esclusivamente

ad un Ph preciso, chiamato Punto o Ph isoelectrico ( Pi ), e

corrisponde alla media aritmetica del

Pka dell’acido carbossilico e al Pka

del gruppo amminico. Valori di Ph

inferiori al Pi dell’amminoacido,

creerà la forma protonata

dell’amminoacido, quindi carica

positivamente no ad un massimo di

+1 su tutte le molecole. Valori di Ph

superiori al Pi dell’amminoacido,

creerà la forma deprotonata

dell’amminoacido, quindi carica

negativamente no ad un massimo di

-1 su tutte le molecole. Ovviamente,

queste considerazioni sono basate

su equilibri chimici, ragion per cui lo

spostamento del Ph e la

fi fi fl

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concentrazione delle forme dell’amminoacido, avviene

gradualmente. Ogni amminoacido ha un Pi caratteristico, dovuto

alla stabilizzazione o meno dei gruppi R degli amminoacidi.

Tutte le considerazioni cambiano

leggermente considerando gli

amminoacidi con un gruppo R Importanza del punto

ionizzabile : in questa situazione, nella isoelectrico

titolazione, viene considerata anche la L’amminoacido che si trova a Ph =

ionizzazione del gruppo funzionale al punto isoelectico è più stabile e

all’interno del gruppo R. Nella meno reattivo nella soluzione.

Questo concetto rimane comunque

titolazione avremo, quindi 3 fasi, una per variabile poiché il Pka, e quindi il Pi,

ogni gruppo ionizzabile, con 3 punti di varia di molte nell’amminoacido

esso. Il Pi degli amminoacidi complessato in proteina.

elettricamente carichi viene calcolato

prendendo in considerazione il Pka della

forma +1 e il Pka della forma -1 ( come

per quelli non carichi ), ma una delle quali corrisponde al Pka del

gruppo ionizzabile del gruppo R. Gli AA come aspartato e

glutammato hanno un Pi molto basso e a Ph siologico si trovano

quindi carichi negativamente. Gli AA come lisina, arginina ed

istidina hanno un Pi molto alto e ha Ph siologico si trovano carichi

positivamente. Un caso particolare è l’istidina che possiede un Pi

pari a 7,59 e ha Ph siologico si trova sia ionizzato positivamente

che nella forma zwiterionica.

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Proteine

Gli amminoacidi si possono unire tra loro attraverso una reazione di

condensazione ( con eliminazione di una molecola d’acqua )

dovuta all’unione del nucleo lo

( NH2 ) al carbonio dell’acido

carbossilico ( vedi chimica

organica ). Il legame che si

crea è un legame covalente

chiamato amidico o peptidico.

Il legame avviene attraverso il

gruppo carbossilico di un

amminoacido e il gruppo

amminico di un altro

amminoacido. Esso è un

legame rigido e planare: il

legame C-N e il doppio legame

C=O risentono della risonanza,

con la

formazione di 2 possibili strutture di

risonanza. Questa caratteristica riduce la

distanza del legame C-N e non ne permette

la rotazione del legame ( struttura planare ).

In questa struttura planare, l’ossigeno del

carbonio e l’idrogeno dell’azoto si trovano

nella con gurazione trans. La reazione di

condensazione del legame peptidico è una

reazione endoergonica, ma nella cellula

avviene grazie ad un’azione chimico/

meccanica dai ribosomi. La reazione di

idrolisi del legame

peptidico è una

reazione esoergonica,

ma non avviene spontaneamente per l’elevata Focus

energia di attivazione necessaria. Quando un Nella proteina, oltre ai

legami peptidici, c’è un altro

amminoacido è complessato in almeno un tipo di legame covalente tra

legame peptidico, viene chiamato residuo gli amminoacidi : ponte

amminoacidico, dovuto alla mancanza di una disulfuro, prodotto

sua parte costitutiva. In base alla quantità di dall’unione degli atomi di

zolfo nel gruppo R del

amminoacidi che si complessano tra loro con residuo della cisteina. ( vedi

legami peptidici, si nominano in : AA )

fi fi

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- Dipeptide -> 2 amminoacidi.

- Tripeptide -> 3 amminoacidi.

- Tetrapeptide -> 4 amminoacidi.

- Oligopeptide -> 10/15 amminoacidi.

- Polipeptide -> 90/100 amminoacidi.

- Proteina -> >100 amminoacidi ( solitamente < ai 2000 residui, ma

ci sono eccezioni ).

Nei sistemi biologici, solitamente troviamo una percentuale

maggiore di proteine, ma ci sono dipeptidi od oligopeptidi che

svolgono una funzione biologicamente attiva, anche molto

importante. ( aspartame, ormone, neurotrasmettitore ).

Caratteristiche e diversità delle proteine

- Nella catena proteica degli amminoacidi avremo 2 estremi liberi:

un estremo amminoterminale dovuto al NH3+ libero

dell’amminoacido non complessato in legame peptidico e un

estremo carbossiterminale

dovuto al COO- libero

dell’amminoacido non

complessato in legame

peptidico. ( N-terminale e

C-terminale ). Essa si legge

dal N-terminale al C-

terminale.

- Le proprietà acido/base delle proteine dipendono dal gruppo C-

terminale e N-terminale dei rispettivi amminoacidi nali ( Pka degli

amminoacidi nali ). In più bisogna valutare anche la presenza di

gruppi R ionizzatili all’interno della proteina. Queste

considerazioni possono indicarci relativamente il comportamento

della proteina, poiché tutti i Pka che prendiamo in considerazione

possono essere modi